Introdução

2. As Peroxidases ... 7 2.1. As Peroxidases Bacterianas ... 9 2.1.1. A Peroxidase do Citocromo c de Pseudomonas aeruginosa ... 10 2.1.1.1. A Forma Oxidada ... 11 2.1.1.2. A Forma Semi-Reduzida... 11 2.1.1.3. A Forma Reduzida... 12 2.1.1.4. O Mecanismo Catalítico... 13 2.1.2. A Peroxidase do Citocromo c de Pseudomonas stutzeri ... 14 2.1.3. A Peroxidase do Citocromo c de Paracoccus denitrificans ... 14 2.1.3.1. A Necessidade de Cálcio para a Activação ... 15 2.1.3.2. O Equilíbrio Dímero-Monómero ... 16 2.1.3.3. Os Dois Tipos de Sítios de Ligação para o Cálcio ... 17 2.1.3.4. A Forma Activa ... 18 2.1.3.5. Os Modelos Propostos para a Activação ... 18 2.1.3.5.1. Modelo I ... 19 2.1.3.5.1. Modelo II... 19 2.1.4. Outras Peroxidases Bacterianas... 21 3. Bibliografia ... 25

1. Introdução

O advento da produção de Oxigénio molecular (O2) através da fotólise da água, levada a cabo pelos organismos fotossintéticos, levou ao primeiro grande evento de poluição da atmosfera.

O O2 é uma substância paramagnética pouco usual pelo facto de ter dois electrões desemparelhados com o mesmo estado de spin [1]. Este facto leva a que, apesar de a redução do O2 ser um acontecimento termodinamicamente favorável, esta apenas se dê muito lentamente na ausência de um catalisador. Isto é, num par de electrões, antiparalelos entre si, um deles terá um spin paralelo aos electrões desemparelhados do O2, necessitando portanto, de haver uma mudança no spin de um dos electrões, antes que o O2 os possa receber. Nas colisões ocasionais, o tempo de contacto é demasiado curto para que este acontecimento possa ocorrer [2]. É esta barreira cinética que nos mantém a salvo no ambiente tão fortemente oxidante em que vivemos.

1.1. Metabolitos Reactivos de Oxigénio

Durante a respiração celular, a redução incompleta do oxigénio molecular leva ao aparecimento de metabolitos reactivos de oxigénio (ou oxigénio activo) [2], como o peróxido de hidrogénio (H2O2), o ião superóxido (O2•-) ou o radical hidroxilo (HO•). Estas espécies, são bastante mais reactivas do que o O2, e conseguem por vezes levar a cabo reacções de auto-oxidação não enzimáticas, originando quebras em ambas as cadeias de ADN, produção de pontes dissulfureto ou oxidação de outros aminoácidos nas proteínas, e peroxidação dos lípidos com consequente diminuição da mobilidade das membranas celulares [3]. Das espécies anteriores, apenas o peróxido de hidrogénio não é uma espécie radicalar. Apesar disso, este continua a ser um perigoso oxidante citotóxico pelo facto de conter, tal como o O2, dois electrões não emparelhados, e de estar assim, bastante receptivo a mais dois electrões. Além disso, catiões como o Fe(II) e o Cu(I) são capazes de transferir um terceiro electrão para o peróxido de hidrogénio, originando uma molécula de água e outra de radical hidroxilo (reacção de Fenton) [2-4]. Este último é um dos oxidantes mais potentes que se conhecem, sendo capaz de atacar qualquer uma das substâncias orgânicas presentes na célula, levando em última análise à morte celular.

Para manter a viabilidade celular num ambiente tão fortemente oxidante, é necessário um processo de eliminação dos metabolitos reactivos de oxigénio. As células criaram, assim, numerosos mecanismos de defesa, tal como a acumulação de várias substâncias anti-oxidantes, incluindo o ácido ascórbico, o β-caroteno e a glutationa, ou a evolução de diversas famílias de enzimas que catalisam reacções de eliminação destas espécies, e o aparecimento de defesas secundárias que incluem sistemas de reparação do ADN e enzimas proteolíticas e lipolíticas [3]. A importância destes sistemas é fundamental na sobrevivência de seres que respiram oxigénio (seres aeróbios) ou mesmo dos que apenas vivem na sua presença, apesar de respirarem outras substâncias (seres anaeróbios aerotolerantes).

De entre as enzimas que eliminam os metabolitos reactivos de oxigénio temos as

dismutases do superóxido, que catalizam a reacção de associação de duas moléculas de

superóxido, originando uma molécula de peróxido de hidrogénio e outra de oxigénio (equação (1)).

O2- + O2- +2 H+

º

São uma classe de enzimas ubíquas em células aeróbias mas muito diversificada, podendo conter cobre, zinco, manganésio, ferro ou até níquel no seu centro activo e localizar-se quer no citosol, quer em organelos subcelulares. No entanto, ao resolverem o problema do ião superóxido nas células, as dismutases do superóxido produzem mais H2O2, o qual é ainda uma substância tóxica.

As enzimas que eliminam o peróxido de hidrogénio, as hidroperoxidases [5], classificam-se em: catalases, as quais catalisam a redução do H2O2 usando como doadores electrónicos substâncias que possam dispor de dois electrões simultaneamente (equação 2) e

peroxidases, as quais usam o potencial oxidante do H2O2 para levar a cabo oxidações selectivas num grande número de substratos orgânicos capazes de doar apenas um electrão. A reacção típica das peroxidases encontra-se exemplificada na equação (3).

2 H2O2

º

H2O2 + 2 H+ + 2 Sred

º

(Sendo Sred um substrato reduzido, e Sox o mesmo substrato no estado oxidado)

As catalases são maioritariamente enzimas hémicas, existindo no entanto, algumas excepções, como as catalases contendo magnésio. Dentro das peroxidases, temos também uma maioria de proteínas hémicas, havendo no entanto, alguns exemplos não hémicos, como

as bromoperoxidases de Pseudomonas (Ps.) aeruginosa e de Ps. putida ou a cloroperoxidase de

Ps. pyrrocinia [5].

Não se conhece nenhum sistema enzimático para eliminar a mais reactiva das substâncias derivadas do oxigénio acima mencionadas, o radical hidroxilo, provavelmente porque o seu tempo de vida na célula é extremamente curto (cerca de 10-9 _{segundos) e} também porque a remoção do seu principal precursor, o H2O2, através dos sistemas enzimáticos das hidroperoxidases, é já por si uma medida de protecção da célula bastante eficaz.

Apesar de todos os efeitos nocivos acima mencionados dos metabolitos reactivos de oxigénio, estes participam também em alguns importantes processos biológicos que ocorrem nas células dos seres mais complexos. A libertação de grandes quantidades de ião superóxido, produzido pelos leucócitos não só induz a morte dos microrganismos patogénicos, como aumenta a permeabilidade vascular e participa na morte celular. Além disso, a produção intracelular de metabolitos reactivos de oxigénio exerce um efeito fundamental na regulação da libertação de outros mediadores da resposta inflamatória. Resultados recentes indicam que o peróxido de hidrogénio poderá estar envolvido no mecanismo de activação dos linfócitos. Este metabolito actua como mensageiro secundário na iniciação e amplificação da sinalização no receptor do antigénio. Em paralelo, elevadas concentrações de peróxido de hidrogénio poderão ainda induzir a apoptose celular [6].