Determinação das atividades enzimáticas

A determinação das atividades enzimáticas, detalhada a seguir, foi realizada com base na metodologia de Ghose (1987).

3.4.1.1 Atividade em papel de filtro

A atividade em papel de filtro foi realizada de duas formas. Durante a produção foi determinada a atividade FPase (atividade de celulase total sobre papel de filtro), devido ao fato de se ter baixas concentrações de glicose. Assim, durante o ensaio enzimático, não se conseguia liberar 2 mg de glicose, como recomendado na metodologia de Ghose (1987). Na amostra final foi realizada a determinação da atividade FPU (Unidade de Papel de Filtro). Esta atividade foi utilizada para calcular a carga de enzimas que deveria ser utilizada nos ensaios de hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar. O procedimento aplicado para a determinação de ambas as atividades encontra-se detalhado a seguir.

Atividade FPase:

Para a determinação da atividade foram utilizados os seguintes reagentes: tiras de papel de filtro Whatman nº 1, medindo 1 cm x 6 cm (aproximadamente 50 mg), tampão citrato de sódio 50 mM (pH 4,8) e reagente DNSA (ácido 3,5-dinitro salicílico).

Para a realização do ensaio enzimático, tiras do papel de filtro, enroladas em formas de espiral, foram colocadas em tubos de ensaio, aos quais se adicionou 1,0 mL de tampão citrato de sódio 50 mM. Os tubos foram colocados em banho termostático (TECNAL, TE- 2005) a 50 ºC, por 1 minuto, antes de se adicionar a amostra (diluída, quando necessário), para que ocorresse o equilíbrio da temperatura. Após 1 minuto, adicionou-se 0,5 mL da amostra de enzima, em cada tubo, agitando-se cuidadosamente.

Em paralelo, foi realizado o ensaio para controle da enzima o qual teve como objetivo a determinação da concentração inicial de açúcares redutores presentes na amostra de enzima. Neste caso, apenas 1,0 mL de tampão citrato de sódio 50 mM e 0,5 mL da amostra foram adicionados em tubos de ensaio, sem a adição do substrato (papel de filtro). Um branco foi utilizado para zerar o espectrofotômetro, utilizando-se 0,5 mL de tampão citrato de sódio 50 mM.

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Todas as reações foram conduzidas a 50 ºC, em banho termostático, durante 60 minutos. Ao final deste tempo, as reações foram interrompidas pela retirada de 0,5 mL da mistura contida em cada um dos tubos, que foi colocada imediatamente em outros tubos contendo 0,5 mL de DNSA (ácido 3,5-dinitro salicílico). Todos os tubos foram submetidos a um banho em água a 100 ºC, durante 5 minutos, e, em seguida, resfriados até a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ºC). As amostras foram diluídas com 6,5 mL de água destilada, procedendo-se, então, à leitura da absorbância em espectrofotômetro (Hewlett-Packard, modelo 8453), a 540 nm. A determinação da concentração de glicose liberada em cada ensaio enzimático foi realizada através da utilização de uma curva padrão de glicose previamente preparada.

Atividade FPU:

Para a determinação dessa atividade foram utilizados os mesmos reagentes empregados a determinação da atividade FPase.

Para o ensaio enzimático, tiras do papel de filtro, enroladas em formas de espiral, foram colocadas em tubos de ensaio, aos quais se adicionou 1,0 mL de tampão citrato de sódio 50 mM. Os tubos foram colocados em banho termostático (TECNAL, TE-2005) a 50 ºC, por 1 minuto, antes de se adicionar a enzima, para que ocorresse o equilíbrio da temperatura. Após 1 minuto, adicionou-se 0,5 mL de enzima, em cada tubo, agitando-se cuidadosamente.

No ensaio para controle da enzima, foi adicionado 1,0 mL de tampão citrato de sódio 50 mM e 0,5 mL de enzima em tubos de ensaio, sem a adição do substrato (papel de filtro). O branco foi utilizado para zerar o espectrofotômetro, utilizando-se 1,5 mL de tampão citrato de sódio 50 mM.

As reações foram conduzidas a 50 ºC, em banho termostático, durante 60 minutos. Ao final deste tempo, as reações foram interrompidas pela adição de 3,0 mL de DNSA (ácido 3,5-dinitro salicílico). Todos os tubos foram submetidos a um banho em água a 100 ºC, durante 5 minutos, e, em seguida, resfriados até a temperatura ambiente. As amostras foram diluídas com 20 mL de água destilada, procedendo-se, então, à leitura da absorbância em espectrofotômetro (Hewlett-Packard, modelo 8453), a 540 nm. A determinação da concentração de glicose liberada em cada ensaio enzimático foi realizada através da utilização de uma curva padrão de glicose previamente preparada

3.4.1.2 Atividade em carboximetilcelulose (CMCase)

A determinação da atividade CMCase é baseada na hidrólise de carboximetilcelulose (CMC)

Neste caso, o meio reacional foi composto por 0,25 mL de uma solução de CMC 4% (p/v) e 0,25 mL da amostra. Para o controle da enzima, aos tubos de ensaios foram adicionados apenas 0,25 mL da amostra e 0,25 mL de tampão citrato de sódio 50 mM. O branco, utilizado para zerar o espectrofotômetro, foi preparado pela adição de 0,25 mL da solução de CMC 4% e 0,25 mL de tampão citrato de sódio 50 mM.

Todos os tubos, contendo o meio reacional, o controle da enzima e o branco, foram incubados a 50 ºC, em banho termostático (TECNAL, TE-2005), durante 10 minutos. Ao final deste tempo, a reação foi interrompida pela adição de 0,5 mL de DNSA. Os tubos foram submetidos a um banho em água a 100 ºC, durante 5 minutos. Em seguida, os tubos foram resfriados até a temperatura ambiente. As amostras foram diluídas com 6,5 mL de água destilada e, em seguida, procedeu-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro (Hewlett-Packard, modelo 8453), a 540 nm, sendo a determinação da concentração de glicose liberada em cada ensaio enzimático realizada através da utilização de uma curva padrão de glicose.

3.4.1.3 Atividade de β-glicosidase

O ensaio para a determinação da atividade β-glicosidase utiliza celobiose como substrato. A determinação da concentração de glicose liberada pela β-glicosidase foi realizada através da utilização de um kit de análise de glicose (Reagente GOD-POD, Biosystems), o qual se baseia na reação das enzimas glicose oxidase e peroxidase. A glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose de acordo com a seguinte reação:

2 O 2 H Glucônico Ácido GOD O 2 H 2 O e cos Gli + + → +

Por sua vez, o peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob a ação da enzima peroxidase. O produto final dessa reação é a antipirilquinonimina de

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coloração vermelha, cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose na amostra. Tal reação está representada a seguir.

O 2 H 4 a min uinoni antipirilq POD fenol a oantipirin min a 4 2 O 2 H 2 + − + → +

Os ensaios enzimáticos foram utilizados através da adição em tubos de ensaio. de 0,5 mL de amostra e 0,5 mL de uma solução de celobiose 15 mM.

Para o controle, foram adicionados aos tubos de ensaio 0,5 mL de tampão citrato de sódio 50 mM (pH 4,8) e 0,5 mL da amostra de enzima. O branco foi formado por 1,0 mL do reagente GOD-POD, o qual foi utilizado para zerar o espectrofotômetro.

Todos os tubos, contendo a amostra de enzima e substrato, o controle e o branco, foram incubados a 50 ºC, durante 30 minutos. Após este tempo, os tubos foram submetidos a um banho a 100 ºC por 5 minutos, para a finalização das reações. Em seguida, foram transferidos para um banho em água fria, até atingir a temperatura ambiente. Em uma segunda etapa, a glicose produzida foi determinada pela adição de 0,01 mL da mistura reacional em tubos contendo 1,0 mL do reagente GOD-POD. Os tubos foram incubados em banho termostático a 37 ºC, durante 15 minutos. As leituras das absorbâncias foram feitas em espectrofotômetro a 505 nm. A determinação da concentração de glicose liberada em cada reação enzimática foi realizada através da utilização de uma curva padrão de glicose.

3.4.1.4 Atividade xilanase

Esse método se baseia na determinação da concentração de açúcares redutores liberados durante a degradação da xilana.

Para a determinação da atividade enzimática da xilanase, utilizou-se 0,5 mL da amostra e 1,0 mL de solução 1% (p/v) de xilana. Os controles foram formados por 1,0 mL de tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) e 0,5 mL da solução de enzima. O branco, utilizado para zerar o espectrofotômetro, foi formado utilizando-se apenas 0,5 mL da solução de xilana.

Todos os tubos foram incubados a 50 ºC, durante 5 minutos. Ao final deste tempo, 0,5 mL de cada uma das misturas foi colocado imediatamente em outros tubos de ensaio contendo 0,5 mL de reagente DNSA. Os tubos foram colocados em banho a 100 ºC, por 5

minutos. Ao final deste tempo, os tubos foram resfriados em banho frio, até atingir a temperatura ambiente. Antes de realizar a leitura da absorbância a 540 nm, foram realizadas diluições das amostras com 6,5 mL de água destilada. A determinação da concentração de xilose liberada em cada reação enzimática foi realizada usando-se uma curva padrão de xilose, previamente preparada.

3.5 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PRÉ-