A caracterização do extrato foi feita através da determinação das atividades enzimáticas descritas a seguir, utilizando o Espectrofotômetro U-2001, (Hitachi). As unidades de enzimas foram expressas como UI/mL (µmol / min x mL). As unidades totais do extrato foram obtidas multiplicando-se UI/mL pelo volume extraído. Para relacionar as unidades totais produzidas com a quantidade de cavaco de madeira utilizado em cada processo de biodegradação, UI foi divida pela massa (kg) de cavaco utilizada e reportada como UI/kg (µmol / min x kg de cavaco).
4.8.1. β-D-Xilanase
A atividade de xilanase foi determinada de acordo com o método de BAILEY et al. (1992), seguido da quantificação de açúcares redutores liberados
a partir da xilana, pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS - MILLER, 1959).
Uma alíquota de 0,9 mL de solução de xilana 1,0 % (birchwood-Sigma X0502) foi colocada em 3 tubos de ensaio e incubados em banho-maria a 50 ºC. A seguir foram adicionados 0,1 mL do extrato enzimático em cada tubo e a reação foi conduzida por 5, 15 e 30 minutos. Adicionou-se então, 1,5 mL do reagente do DNS e os tubos foram fervidos por 5 minutos. Em seguida as
amostras foram resfriadas e a absorbância foi lida a 540 nm em
espectrofotômetro. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.
Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se o reagente de DNS antes do extrato enzimático. Nessas condições a enzima não apresenta atividade catalítica, mas é possível dosar compostos redutores que não são provenientes da reação enzimática.
A curva padrão foi construída com solução de xilose (Merck), a concentrações de 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18 e 20 µmol / mL. Uma unidade de atividade de xilanase foi definida como a quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de açúcar redutor por minuto, expresso como xilose.
Preparo da solução de xilana “Birch” 1,0 %
A solução de xilana foi preparada dissolvendo-se 1 g de xilana (birchwood-Sigma X0502) em 80 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,4. A solução foi aquecida até ebulição em forno de microondas, e após retornar à temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão. A solução permaneceu em agitação mecânica até completa solubilização da xilana na solução.
Preparo do reagente do DNS
O reagente foi preparado dissolvendo-se 10,6 g de ácido
3,5-dinitrosalicílico, 19,8 g de hidróxido de sódio, 306,0 g de tartarato de sódio e potássio e 8,3 g de bissulfito de sódio em 1 L de água destilada. Após
agitação para total dissolução dos reagentes, foram adicionados 7,6 mL de fenol, e o volume completado para 1,4 L com água destilada (MILLER, 1959).
4.8.2. β-D-Xilosidase
A atividade de β-xilosidase foi determinada segundo TAN et al. (1987), através da estimativa do p-nitrofenol (pNP) liberado a partir do reagente p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo (pNPX).
Uma alíquota de 0,2 mL do extrato enzimático foi adicionada a 0,8 mL de solução de pNPX 0,1 % em três tubos de ensaio. As reações foram conduzidas incubando os tubos durante 15, 30 e 60 minutos a 50 ºC. Após incubação, as reações foram interrompidas pela adição de 2 mL de solução de bicarbonato de sódio 10 % em cada tubo e a absorbância foi lida a 410 nm. Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se a solução de bicarbonato de sódio 10 % antes do extrato enzimático. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8.
O pNP liberado foi determinado através de curva de calibração com padrão de p-nitrofenol nas concentrações de 50, 75, 150, 225, e 300 µmol / mL. Uma unidade de atividade de β-xilosidase foi definida como a quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de pNP por minuto.
Preparo da solução de para-nitro-fenil-β-D-xilopiranosídeo
(pNPX) 0,1 %
A solução de pNPX foi preparada dissolvendo-se 0,1 g de pNPX (Sigma) em 90 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,8, sob agitação e o volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão.
Preparo do bicarbonato de sódio 10 %
A solução de bicarbonato de sódio 10 % foi preparada dissolvendo-se 10 g de bicarbonato de sódio em 100 mL de água destilada, sob agitação e aquecimento em agitador mecânico.
4.8.3. β-D-Glicosidase
A atividade de β-glicosidase foi determinada segundo TAN et al. (1987), através da estimativa do p-nitrofenol (pNP) liberado a partir do p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPG).
Uma alíquota de 0,2 mL do extrato enzimático foi adicionada a 0,8 mL de solução de pNPG 0,1 % em três tubos de ensaio. As reações foram conduzidas incubando os tubos durante 15, 30 e 60 minutos a 50 ºC. Após incubação, as reações foram interrompidas pela adição de 2 mL de solução de bicarbonato de sódio 10 % em cada tubo e a absorbância foi lida a 410 nm. Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se a solução de bicarbonato de sódio 10 % antes do extrato enzimático. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8.
O pNP liberado foi determinado através de curva de calibração com padrão de p-nitrofenol nas concentrações de 50, 75, 150, 225, e 300 µmol / mL. Uma unidade de atividade de β-glicosidase foi definida como a quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de pNP por minuto.
Preparo da solução de para-nitro-fenil-β-D-glicopiranosídeo
(pNPG) 0,1 %
A solução de pNPG foi preparada dissolvendo-se 0,1 g de pNPG
(Sigma) em 90 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,8, sob agitação e o volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão.
4.8.4. β-D-Mananase
A atividade de mananase foi determinada de acordo com o método de RATTO e POUTANEN (1988), seguido da quantificação de açúcares redutores liberados a partir de galactomanana, pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS - MILLER, 1959).
Uma alíquota de 0,9 mL de solução de galactoglucomana 0,5 % (Sigma G0753) foi colocada em 3 tubos de ensaio e adicionados 0,1 mL do extrato enzimático em cada tubo. A seguir, os tubos de ensaio foram incubados em banho termostatizado à temperatura de 50 ºC por 5, 15 e 30 minutos. Adicionou-se então, 1,5 mL do reagente do DNS e os tubos foram fervidos por 5 minutos. Em seguida as amostras foram resfriadas e a absorbância foi lida a 540 nm em espectrofotômetro. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.
Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se o reagente de DNS antes do extrato enzimático. Nessas condições a enzima não apresenta atividade catalítica, mas é possível dosar compostos redutores que não são provenientes da reação enzimática.
A curva padrão foi construída com solução de manose (Merck), a concentrações de 1,38; 2,77; 4,16; 5,55; 6,94; 8,33; 11,11 e 13,38 µmol / mL. Uma unidade de mananase foi definida como a quantidade de enzima capaz de
catalisar a liberação de 1 µmol açúcar redutor por minuto, expresso como
manose.
Preparo da solução de manana 0,5 %
A solução de manana foi preparada dissolvendo-se 0,5 g de
galactomanana (“locust bean gum” - Sigma G0753) em 80 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,4. A solução foi submetida a aquecimento até
aproximadamente 80 ºC, em forno de microondas, e após retornar à
temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão. A solução permaneceu em agitação mecânica até completa solubilização da manana na solução.
4.8.5. Endo-glucanase
A atividade de endo-1,4-β-glucanase foi determinada segundo técnica descrita por TANAKA et al. (1981) que consiste em conduzir a hidrólise de uma
solução de carboximetilcelulose 0,44 %. A quantidade de açúcares redutores foi determinada pelo método do DNS (MILLER, 1959).
Uma alíquota de 0,1 mL do extrato enzimático foi adicionada a 0,9 mL de solução de carboximetilcelulose 0,44 % (Sigma C5013) em três tubos de ensaio. As reações foram conduzidas incubando os tubos durante 30, 60 e 90 minutos a 50 ºC. Adicionou-se então, 1,5 mL do reagente do DNS e os tubos foram fervidos por 5 minutos. Em seguida as amostras foram resfriadas e a absorbância foi lida a 540 nm em espectrofotômetro. Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se o reagente de DNS antes do extrato enzimático. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.
A curva padrão foi construída com solução de glicose (Merck), a concentrações de 1,38; 2,77; 4,16; 5,55; 8,33; 11,11 µmol / mL. Uma unidade de atividade de endoglucanase foi definida como a quantidade de enzima
capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de açúcar redutor por minuto,
expresso como glicose.
Preparo da solução de carboximetilcelulose 0,44 %
A solução de carboximetilcelulose foi preparada dissolvendo-se 0,44 g
de carboximetilcelulose (Sigma C5013 - média viscosidade) em 80 mL de
tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,4. A solução foi submetida a
aquecimento até aproximadamente 80 ºC em forno de microondas, e após retornar à temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão. A solução permaneceu em agitação mecânica até completa solubilização da carboximetilcelulose na solução.