DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
Tese de Doutorado
PURIFICAÇÃO DE HEMICELULASES E DE UMA
β-GLICOSIDASE DE CERIPORIOPSIS SUBVERMISPORA
PRODUZIDAS EM CONDIÇÕES DE BIOPOLPAÇÃO
Pérola de Oliveira e Magalhães
Lorena – SP – Brasil
2005
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
PURIFICAÇÃO DE HEMICELULASES E DE UMA
β-GLICOSIDASE DE CERIPORIOPSIS SUBVERMISPORA
PRODUZIDAS EM CONDIÇÕES DE BIOPOLPAÇÃO
Tese de Doutorado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Biotecnologia Industrial.
Banca Examinadora:
Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres (presidente) – DEBIQ/FAENQUIL Dra. Maria Bernadete de Medeiros – DEBIQ/FAENQUIL
Dr. André Luis Ferraz – DEBIQ/FAENQUIL Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte - UNICAMP Dr. Alexandre Nunes Ponezi - UNICAMP
Estudante:
Pérola de Oliveira e Magalhães
Lorena - SP - Brasil
2005
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha Catalográfica
Elaborada pela Biblioteca Universitária
Magalhães, Pérola de Oliveira e
Purificação de hemicelulases e de uma β-glicosidase de Ceriporiopsis
subvermispora produzidas em condições de biopolpação / Pérola de Oliveira e
Magalhães. Lorena, 2005. 133 f. : il. ; 30 cm.
Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) - Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Bioteconogia, 2005
Orientadora : Adriane Maria Ferreira Milagres
1.Biotecnologia 2. Xilanases 3. Purificação 4. Mananases 5.Ceriporiopsis
subvermispora 6. Hemicelulases 7. β-glicosidase 8. Biodegradação I.
Milagres, Adriane Maria Ferreira, orient. II. Título.
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
PURIFICAÇÃO DE HEMICELULASES E DE UMA
β-GLICOSIDASE DE CERIPORIOPSIS SUBVERMISPORA
PRODUZIDAS EM CONDIÇÕES DE BIOPOLPAÇÃO
Este exemplar corresponde à versão final da tese de doutorado aprovada pela banca examinadora.
Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres Orientadora e Presidente da Banca Examinadora
Lorena - SP - Brasil
2005
A DEUS
“Tu te fizeste presente em todos os momentos firmes e trêmulos. E, passo a passo, pude sentir a tua mão na minha, transmitindo-me a segurança necessária para enfrentar meu caminho e seguir.... A tua presença é qualquer coisa como a luz e a vida, e sinto que, em meu gesto, existe o teu gesto e em minha voz a tua voz.” (Vinícius de Moraes)
Agradeço em primeiro lugar aos meus pais, ao meu irmão e ao Dino pelo grande incentivo e amor dedicados em todos os momentos. Especialmente agradeço a minha mãe que trabalhou comigo durante toda esta tese.
Agradeço a Dra. Adriane M. Ferreira Milagres pela orientação, pelos ensinamentos e pela confiança;
Ao Departamento de Biotecnologia e a Faculdade de Engenharia Química de Lorena pela oportunidade e apoio para a realização desta dissertação;
Aos amigos do laboratório pelos ensinamentos, companheirismo e incentivo;
Aos demais professores, colegas e técnicos do DEBIQ, por todo auxílio e atenção;
CONTEÚDO ABREVIATURAS ... 1 LISTA DE TABELAS ... 2 LISTA DE FIGURAS ... 3 RESUMO ... 8 ABSTRACT ... 9 1. INTRODUÇÃO ... 10 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 12 2.1. CONSTITUINTES DA MADEIRA... 12
2.2. ENZIMAS ENVOLVIDAS NA DEGRADAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA PAREDE CELULAR ... 19
2.2.1. Hemicelulases... 20 2.2.2. Xilanases ... 21 2.2.3. Mananases ... 24 2.2.4. Celulases ... 26 2.3. Ceriporiopsis subvermispora... 30 3. OBJETIVO ... 32 4. MATERIAL E MÉTODOS... 33 4.1. SOLUÇÕES TAMPÕES ... 33 4.2. FUNGO... 35 4.3. MANUTENÇÃO DA CEPA... 35 4.4. PREPARAÇÃO DA MADEIRA... 35 4.5. PREPARAÇÃO DO INÓCULO ... 36 4.6. INOCULAÇÃO DO BIORREATOR ... 36
4.7. EXTRAÇÃO DAS ENZIMAS HIDROLÍTICAS ... 37
4.8. DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS ... 38
4.8.1. β-D-Xilanase ... 38
4.8.2. β-D-Xilosidase... 40
4.8.3. β-D-Glicosidase ... 41
4.8.4. β-D-Mananase ... 41
4.9. PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA... 43
4.9.1. Purificação de duas xilanases e de uma mananase a partir do extrato inicial ... 44
4.9.1.1. DEAE Sepharose CL 6B... 44
4.9.2. Purificação de uma β-glicosidase e de uma xilanase a partir do extrato concentrado (>100 kDa)... 45
4.9.2.1. Sephacryl S-300 HR ... 45
4.9.2.2. DE 52 Cellulose ... 46
4.9.2.3. Concanavalina A... 46
4.9.2.4. Sephadex G-50... 46
4.9.3. Purificação de uma mananase a partir do extrato ultrafiltrado (<100 kDa) ... 47
4.9.3.1. Precipitação com sulfato de amônio ... 47
4.9.3.2. Extração de fenóis com polivinilpirrolidona (PVP) ... 47
4.9.3.3. DEAE Sepharose CL 6B... 48
4.9.3.4. Mono Q HR... 49
4.9.3.5. DE- 52 Cellulose... 50
4.10. ELETROFORESE... 50
4.10.1. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) .. 50
4.10.2. Preparo dos géis desnaturantes (SDS-PAGE) ... 51
4.10.2.1. Gel concentrador ... 51
4.10.2.2. Gel separador ... 52
4.10.3. Preparo das amostras... 52
4.10.4. Sephadex G-25... 52
4.10.5. Preparo do tampão da Amostra ... 53
4.10.6. Coloração com nitrato de prata... 53
4.10.7. Coloração com Azul de Coomassie ... 54
4.10.8. Detecção de atividade de xilanase no gel de eletroforese... 54
4.10.8.1. Gel concentrador com xilana ... 54
4.10.8.2. Gel separador com xilana ... 55
4.10.9. Detecção de atividade de β-Glicosidase no gel de eletroforese ... 55
4.11. DOSAGEM DE PROTEÍNAS ... 56
4.12. Determinação da massa molar ... 56
4.13. Determinação dos parâmetros cinéticos... 58
4.14. Efeitos de compostos na atividade ... 59
4.15. Efeito da temperatura ... 59 4.16. Efeito do pH ... 59 4.17. Estabilidade Térmica ... 60 4.18. Estabilidade ao pH... 60 4.19. Especificidade ao substrato ... 61 5. RESULTADOS... 62
5.1. ENZIMAS HIDROLÍTICAS PRODUZIDAS POR C. subvermispora... 62
5.2. CARACTERIZAÇÃO DAS HEMICELULASES E CELULASES NO EXTRATO INICIAL ... 63
5.3. PURIFICAÇÃO DAS ENZIMAS HIDROLÍTICAS ... 70
5.3.1. Purificação de duas xilanases e uma mananase a partir do extrato inicial ... 70
5.3.1.1. DEAE - Sepharose CL - 6B ... 70
5.3.2. Purificação de uma β-Glicosidase e de uma xilanase a partir do extrato concentrado (> 100 kDa)... 74
5.3.2.1. SephacrylS-300... 74
5.3.2.2. DE-52 Cellulose... 79
5.3.2.2.1. Concanavalina A ... 82
5.3.3. Purificação de uma mananase a partir do extrato ultrafiltrado (< 100 kDa)... 85
5.3.3.1. Concentração e fracionamento das proteínas ... 85
5.3.3.2. Extração de fenóis com PVP (polivinilpirrolidona) ... 86
5.3.3.2.1. DEAE - Sepharose CL - 6B... 86
5.3.3.2.2. MONO Q H/R ... 88
5.3.3.2.3. DE- 52 Cellulose III ... 89
5.4. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS PURIFICADAS .... 92
5.4.1. Caracterização bioquímica da β-glicosidase... 92
5.4.1.1. Determinação dos parâmetros cinéticos para β-glicosidase... 92
5.4.1.2. Efeito da temperatura ... 92
5.4.1.4. Efeitos de compostos sobre a atividade da β-glicosidase
purificada ... 94
5.4.2. Caracterização bioquímica da xilanase de 79 kDa ... 94
5.4.2.1. Determinação dos parâmetros cinéticos para xilanase de 79 kDa ... 94
5.4.2.2. Efeito da temperatura ... 95
5.4.2.3. Efeito do pH ... 96
5.4.2.4. Efeitos de compostos sobre a atividade da xilanase de 79 kDa . 96 5.4.3. Caracterização bioquímica da mananase de 156 kDa... 97
5.4.3.1. Determinação dos parâmetros cinéticos da mananase de 156 kDa ... 97
5.4.3.2. Efeitos de compostos sobre a atividade da mananase de 156 kDa ... 97
5.4.3.3. Especificidade ao substrato ... 98
6. DISCUSSÃO ... 99
6.1. Obtenção do extrato enzimático e análise da atividade das enzimas... 99
6.2. Purificação e caracterização de hemicelulases e de uma β-glicosidase produzidas por C. subvermispora... 102
7. CONCLUSÕES ... 110
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 112
9. ANEXOS ... 130
9.1. Anexo A: Curva padrão do log da massa molar versus Kav das proteínas padrões aplicadas na coluna Sephacryl S-300... 130
9.2. Anexo B: Curva padrão do log da massa molar versus Kav das proteínas padrões aplicadas na coluna Sephadex G-50. ... 131
ABREVIATURAS DNS : Ácido 3,5-dinitrosalicílico CMC : Carboximetilcelulose CMCase : Endoglucanase Da : Dalton EX : Endo-xilanase
LiP : Lignina peroxidase
MnP : Peroxidase dependente de Manganês
PNPG : p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo
PNPX : p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo
AE : Atividade específica
Km : Constante de Michaelis-Menten
Vmáx : Velocidade máxima da reação
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Unidades constituintes das polioses em várias espécies de madeiras (FENGEL e WEGENER, 1989) ... 15 TABELA 2 – Constituição química do P. taeda utilizado neste trabalho ... 35 TABELA 3 – Purificação de uma xilanase de 79 kDa através da coluna DEAE
CL 6B... 71 TABELA 4 – Purificação de uma mananase de 156 kDa através da coluna
DEAE CL 6B ... 71 TABELA 5 – Purificação de uma β-glicosidase presente no extrato concentrado (>100 kDa). ... 74 TABELA 6 – Efeitos de alguns compostos na atividade da β-glicosidase purificada. ... 94 TABELA 7 – Efeitos de alguns compostos sobre a atividade da xilanase de
79 kDa... 96 TABELA 8 – Efeitos de alguns compostos sobre a atividade da mananase de
156 kDa... 98 TABELA 9 – Especificidade a diferentes substratos das enzimas purificadas. 98
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Representação das camadas da parede das células de madeira mostrando lamela média (ML), parede celular primária (P), as camadas da parede celular secundária (S1, S2 e S3), e o lúmen (W) das células de madeira (FENGEL e WEGENER, 1989). ... 13 FIGURA 2 – Estrutura da celulose (a) unidade de celobiose; (b) extremidade
redutora e não redutora. ... 14 FIGURA 3 – Estrutura representando as regiões cristalina e amorfa de uma
microfibrila de celulose... 14 FIGURA 4 – Estruturas de hemiceluloses (Adaptado de KANTELINEN, 1993)
A: glicuronoxilana de madeiras duras; B: glicuronoarabinoxilana de coníferas; C: galactoglicomanana de coníferas ... 16 FIGURA 5 – Modelo esquemático da estrutura da lignina de madeira mole de
acordo com Addler (FENGEL e WEGENER, 1989)... 18 FIGURA 6 – Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (I) álcool
p-cumarílico; (II) álcool coniferílico; (III) álcool sinapílico (FENGEL e WEGENER, 1989) ... 18 FIGURA 7 – Representação teórica da estrutura da xilana vegetal e pontos
onde as enzimas atuam. Ac, grupo acetil; Arab, L-arabinofuranose; MeGlA, ácido 4-O-metil-glicurônico; Xil, D-xilose... 21 FIGURA 8 – Mecanismo da decomposição da celulose pela ação do complexo celulolítico. ... 27
FIGURA 9 – Foto do biorreator de 2 L usado nos experimentos de
biodegradação da madeira. ... 37
FIGURA 10 – Foto do equipamento de ultrafiltração tangencial
(Minitan - Ultrafiltration System - Millipore), com membranas de
ultrafiltração (100 kDa) usado na separação do extrato enzimático. ... 38 FIGURA 11 – Fluxograma de purificação de uma mananase e duas xilanases a partir do extrato inicial. ... 44 FIGURA 12 – Fluxograma de purificação de uma β-glicosidase e uma xilanase a partir do extrato concentrado (>100 kDa). ... 45 FIGURA 13 – Fluxograma de purificação de uma mananase a partir do extrato ultrafiltrado (<100 kDa). ... 49
FIGURA 14 – Distribuição das atividades enzimáticas totais nas frações: extrato inicial ( ), > 100 kDa ( ) e < 100 kDa ( )... 63 FIGURA 15 – Efeito do pH a 50 ºC na atividade da β-glicosidase, β-xilosidase, xilanase, mananase e CMCase, presente no extrato enzimático de C.
subvermispora ... 65
FIGURA 16 – Efeito da temperatura na atividade da β-glicosidase e da β-xilosidase em pH 4,8 e da xilanase, mananase e CMCase em pH 5,4, presente no extrato enzimático de C. subvermispora. ... 66 FIGURA 17 – Estabilidade da β-glicosidase, β-xilosidase, xilanase, mananase e CMCase do extrato enzimático de C. subvermispora em relação a valores de temperatura... 67 FIGURA 18 – Estabilidade da β-glicosidase, β-xilosidase, xilanase, mananase e CMCase do extrato enzimático de C. subvermispora em relação a valores de pH. ... 68 FIGURA 19 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (12,5 %),
corado com nitrato de prata, do extrato inicial. 1 – marcadores de massa molar; 2 – bandas de proteínas presentes no extrato inicial após Sephadex G-25... 69 FIGURA 20 – Perfil da cromatografia do extrato inicial em coluna de troca
iônica DEAE Sepharose CL 6B, eluído com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,8 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM... 71 FIGURA 21 – A: Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),
corado com nitrato de prata, do pico I da coluna DEAE CL 6 B. 1 – marcadores de massa molar; 2 – xilanase com aproximadamente 79 kDa; B: Zimograma para atividade da xilanase purificada de 79 kDa em gel de atividade para xilanase. ... 72 FIGURA 22 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),
corado com nitrato de prata, dos picos II, III e IV da coluna DEAE CL 6B. 1 – marcadores de massa molar; 2 – xilanase com aproximadamente 29 kDa. ... 73 FIGURA 23 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (12,5 %),
corado com nitrato de prata, do pico V da coluna DEAE CL 6B. 1 – marcadores de massa molar; 2 – mananase com aproximadamente 156 kDa. ... 73
FIGURA 24 – Perfil da cromatografia em coluna de permeação em gel Sephacryl S-300 do extrato concentrado após ultrafiltração, eluído com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4. A: atividades de xilanase, mananase e endoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase representadas no cromatograma; B: atividade somente de β-glicosidase e β-xilosidase representadas no cromatograma. ... 75 FIGURA 25 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),
corado com nitrato de prata, do pico I da Sephacryl S-300. 1 – marcadores de massa molar; 2 – β-glicosidase purificada. ... 77 FIGURA 26 – Zimograma para atividade de β-Glicosidase em gel de
poliacrilamida com Esculina como substrato. Atividade da β-glicosidase de 110 kDa purificada. ... 77 FIGURA 27 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),
corado com Comassie Blue, do pico II da Sephacryl S-300. 1 –marcadores de massa molar; 2 – pico II da Sephacryl S-300 concentrado. ... 78 FIGURA 28 – Zimograma para atividade de β-Glicosidase em gel de
poliacrilamida com Esculina como substrato 1 – marcadores de massa molar; 2 –Atividade da β-glicosidase de aproximadamente 53 kDa presente no pico II da Sephacryl S-300 HR... 78 FIGURA 29 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica DE-52
Cellulose do pico II da Sephacryl S-300, eluído com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM ... 80 FIGURA 30 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),
corado com prata, do pico II da DE-52 Cellulose. 1 – marcadores de massa molar; 2 – fração 272 a 288; 3 – fração 240 a 264 e 4 – fração 192 a 232 com bandas de aproximadamente 65 kDa, 44 kDa e 31 kDa. ... 81 FIGURA 31 – Perfil da cromatografia em coluna de afinidade Concavalina A do pico II da Sephacryl S-300, eluído com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM... 83 FIGURA 32 – Perfil da cromatografia em coluna de permeação em gel
Sephadex G-50 do pico I da Con A, eluído com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4. ... 83 FIGURA 33 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (12,5 %),
marcadores de massa molar; 2 – Pico II bandas de aproximadamente 66 kDa e 30 kDa; 3 – Pico I, bandas de aproximadamente 66 kDa e 30 kDa... 84 FIGURA 34 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (12,5 %),
corado com prata, do pico I e II do cromatograma da Sephadex G 50. 1 – marcadores de massa molar; 2 – Pico II banda de aproximadamente 21 kDa; 3 – Pico I, bandas de aproximadamente 32 kDa e 21 kDa... 84 FIGURA 35 – Recuperação total das atividades enzimáticas e do teor de
proteina após precipitação fracionada com 30 %, 60 % e 80 % de sulfato de amônio. ... 85 FIGURA 36 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica DEAE CL 6B
da FI 60 % de sulfato de amônio, eluído com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 6,0 e gradiente de NaCl 0 – 500 mM. A: atividades de xilanase, mananase, endoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase; B: atividades somente de β-glicosidase e β-xilosidase. ... 87 FIGURA 37 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica Mono Q do pico V da DEAE CL 6B, eluído com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0 e gradiente de NaCl 0 – 500 mM e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM... 88 FIGURA 38 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica DE-52
Cellulose do pico II da Mono Q, com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 9,0 e gradiente de NaCl 0 – 500 mM. ... 89 FIGURA 39 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (12,5 %),
corado com prata, dos picos e proteína 1, 2 e 3 do cromatograma da DE- 52 Cellulose eluída com amostra do pico II da Mono Q HR 5/5. 1 – marcadores de massa molar; 2 – Pico 2, banda de aproximadamente 65 kDa e 3 – Pico 3, bandas de aproximadamente 65 kDa, 21 KDa e 16 kDa... 91 FIGURA 40 – Representação gráfica de Lineweaver-Burk (duplo-recíproco)
para a β-glicosidase purificada. A: efeito da concentração de pNPG na atividade da enzima purificada; B: efeito da concentração de celobiose na atividade da enzima purificada... 92 FIGURA 41 – Efeito da temperatura na atividade da β-glicosidase purificada. 93 FIGURA 42 – Efeito do pH na atividade da β-glicosidase purificada. ... 93
FIGURA 43 – Representação gráfica de Lineweaver-Burk (duplo-recíproco) para a xilanase de 79 kDa. ... 95 FIGURA 44 – Efeito da temperatura na atividade da xilanase de 79 kDa... 95 FIGURA 45 – Efeito do pH na atividade da xilanase de 79 kDa. ... 96 FIGURA 46 – Representação gráfica de Lineweaver-Burk (duplo-recíproco)
RESUMO
Purificação de hemicelulases e de uma β-glucosidase de
Ceriporiopsis subvermispora produzidas em condições de biopolpação.
Pérola de Oliveira e Magalhães. Defesa de doutorado. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra Adriane M.
Ferreira Milagres (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116,
CEP 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. André Luiz Ferraz, Dra. Maria Bernadete de Medeiros, Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte e Dr. Alexandre Nunes Ponezi.
Os estudos de fungos agindo sobre madeira em geral buscam a eficiência em degradar a lignina, processo este utilizado na biopolpação.
Ceriporiopsis subvermispora é hoje a espécie mais indicada para o processo
de biopolpação de cavacos nas fábricas de papel. Apesar da importância de
C. subvermispora na aplicação industrial, o sistema enzimático deste fungo
ainda não está completamente esclarecido. Geralmente a produção de enzimas por fungos é estudada em meios sintéticos, muitas vezes contendo indutores enzimáticos, e portanto, os resultados nem sempre refletem os acontecimentos in situ ou in vivo. Neste trabalho foram investigadas as enzimas hidrolíticas produzidas pelo C. subvermispora em biorreatores
contendo cavacos de Pinus taeda L., por 30 dias, a 27 0C. Os cavacos
biodegradados foram extraídos com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4. As atividades enzimáticas de vários cultivos foram determinadas e expressas em micromoles de produto formado por minuto por quilograma de cavaco (UI/kg). A produção das enzimas variou entre os cultivos, obtendo-se xilanase (388-593 UI/kg); mananase (256-634 UI/kg); endoglucanase (24-76 UI/kg); β-glicosidase (24-72 UI/kg) e baixas atividades de β-xilosidase (0,65-6,5 UI/kg). O perfil eletroforético do extrato foi obtido em gel desnaturante de poliacrilamida revelando nove bandas protéicas com massas molares correspondentes a 110 kDa, 85 kDa, 60 kDa, 56 kDa, 52 kDa e 51 kDa, 45 kDa, 36 kDa e 21 kDa. A temperatura ótima das enzimas dos extratos enzimáticos variou entre 55 ºC e 60 oC e o valor de pH ótimo para as enzimas foi 4,0 para a β-glicosidase, 4,5 para a β-xilosidase, 5,0 para a xilanase, 4,5 para a mananase e 3,5 para a CMCase. Verificou-se também que as enzimas apresentam maior estabilidade em pH 5,0 e a 40 oC e a β-glicosidase foi a enzima de maior estabilidade.
Os extratos foram separados em duas frações através de filtração por membrana (100 kDa). Foram purificadas duas xilanases e uma mananase presentes no extrato inicial apresentando, respectivamente, 79, 29 e 156 kDa. No extrato >100 kDa, foram purificadas uma β-glicosidase de 110 kDa e uma xilanase de 21 kDa e no extrato <100 kDa, uma mananase de 65 kDa. A xilanase de 79 kDa apresentou atividade máxima em pH 8,0 e a 50 ºC, enquanto a β-glicosidase de 110 kDa apresentou máxima atividade em pH 3,5 e temperatura ótima a 60 ºC. Estes resultados confirmam a presença de múltiplas xilanases em extratos fúngicos, juntamente com outras enzimas hidrolíticas necessárias para uma eficiente degradação da hemicelulose presente na parede celular da madeira.
ABSTRACT
Purification of hemicellulases and a β-glucosidase of Ceriporiopsis
subvermispora produced in biopulping conditions. Pérola de Oliveira e
Magalhães. Defesa do doutorado. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra. Adriane M. Ferreira Milagres (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, CEP 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. André Luiz Ferraz, Dra. Maria Bernadete de Medeiros, Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte e Dr. Alexandre Nunes Ponezi.
Generally, the studies of fungi acting on wood search the best performance in degrading the lignin, whose process is utilized in the biopulping. The white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora is nowadays the main strain for the biopulping process of wood chips in the paper industry. Despite of the importance of C. subvermispora in the industry, the enzymatic system of this fungi is not completely cleared yet. Usually the production of enzymes by fungus is studied in synthetic medium, often containing enzymatic inductors, and hence, the results do not always represent the occurrences in situ or
in vivo. In this work, hydrolytic enzymes produced by C. subvermispora in wood
chips of Pinus taeda L. after 30 days of growing at 27 ºC were investigated. The cultures were extracted with a sodium acetate buffer solution (50mM). Xylanase activities (388 and 593 UI/kg of wood chips); mannanase (256-634 UI/kg of wood chips); carboximetylcellulase (24-76 UI/kg of wood chips); β-glucosidase (24-72 UI/kg of wood chips) and low β-xylosidase activities (0,65-6,5 UI/kg of wood chips) were detected. The electrophorectic profile of the crude extract was obtained by denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE) revealing nine proteins bands with molecular weight of 110 kDa, 85 kDa, 60 kDa, 56 kDa, 52 kDa and 51 kDa, 45 kDa, 36 kDa and 21 kDa. The optimum temperature of the enzymes of the enzymatic extracts was between 55 and 60 ºC and the optimum pH value was 4.0 for the β-glucosidase, 4.5 for the β-xylosidase, 5.0 for the xylanase, 4.5 for the mananase and 3.5 for the carboxymetilcellulase. It was also observed that the enzymes presented higher stability at a pH value of 5.0 and at 40 ºC and also that β-glucosidase has the highest stability.
The obtained extracts were ultrafiltered through a membrane system with a 100 KDa cut-off point, separating the extracts in two fractions. Two xylanases and one mannanase present in the crude extract and showing respectively, 79 kDa, 29 kDa and 156 kDa were purified. In the concentrated extract a β-glucosidase of 110 kDa and a xylanase of 21 kDa were purified and in the ultrafiltered extract, one mannanase presenting 65 kDa was purified. The 79 kDa xylanase presented maximum activity at pH 8.0 and 50 ºC, while the β-glucosidase of 110 kDa presented maximum activity at pH 3.5 and optimum temperature at 60 ºC. These results confirmed the presence of multiple xylanases in fungal extracts, together with other hydrolytic enzymes necessary to an efficient degradation of the hemicellulose present in the wood cell wall.
1. INTRODUÇÃO
A biopolpação é definida como o tratamento dos cavacos de madeira com fungos, antes da polpação química ou mecânica, com o intuito de remover e/ou alterar a lignina, preservando a celulose. Os fungos causadores de decomposição branca são os mais eficientes degradadores da lignina e são provavelmente os mais apropriados para serem utilizados no processo de biopolpação (AKHTAR et al., 1998; MESSNER e SREBOTNIK, 1994).
Em 1987, o “Biopulping Consortium” fundado por T. K. Kirk em Madison, EUA, avaliou 200 espécies de fungos e dois deles exibiram diferenças que pareceram ser muito úteis para a biopolpação. Ceriporiopsis subvermispora vem desde então, recebendo especial atenção devido a sua habilidade de degradar a lignina de madeiras moles e duras seletivamente (BLANCHETTE et al., 1992; AKHTAR et al., 1998). Sua extrema agressividade para a colonização da madeira lhe permite estabelecer-se em sistemas não estéreis (SCOTT et al., 1998) e causar o efeito de "amolecimento" da matriz lignocelulósica com grande eficiência. Essas características indicam que, até o momento, essa é a espécie de fungo mais indicada para o processo de biopolpação de cavacos para utilização na fabricação de papel.
Mesmo em períodos de biodegradação relativamente curtos (15 a 30 dias), a madeira é modificada facilitando a penetração de licores de polpação e a subseqüente solubilização da lignina, ocasionando economia de reagentes. O desfibramento e o refino mecânico também são facilitados, ocasionando economia de energia. (AKHTAR et al., 1998, FERRAZ et al., 1998, 2000).
Muitos trabalhos têm mostrado que o crescimento fúngico em substrato sólido é diferente quando comparado ao meio líquido, e conseqüentemente, os padrões de produção de isoenzimas são diferentes (VICUÑA et al., 1996; MACHUCA e FERRAZ, 2001). Poucos estudos têm avaliado a ação destas enzimas na biopolpação. Durante os estágios iniciais de colonização da madeira por C. subvermispora, pequenas quantidades de lignina e celulose são removidas, mas ocorrem alterações substanciais na estrutura dos componentes da parede celular (BLANCHETTE et al., 1997; GUERRA et al., 2003). Tais modificações são ocasionadas pela presença de enzimas e
compostos de baixa massa molar. Sugere-se que estes compostos são produzidos pelos fungos decompositores de madeira e penetram na estrutura da parede celular iniciando as reações de despolimerização da mesma (ENOKI et al., 1999; WATANABE et al., 2002). Estudos recentes têm focado nos radicais hidroxil (OH.) e outros radicais como peroxil (ROO.) ou hidroperoxil
(OOH.) também produzidos pelos fungos para atacar os componentes da
madeira, abrindo espaço para que as enzimas possam penetrar (HAMMEL et al., 2002).
Durante o processo de biopolpação um grande volume de enzimas pode ser recuperado. Manganês-peroxidase é a principal enzima oxidativa produzida por
C. subvermispora, enquanto xilanase e mananase são as principais enzimas
hidrolíticas. Tais enzimas são potencialmente importantes em biobranqueamento de polpas celulósicas, em que a lignina é removida quase completamente após o processo de branqueamento, porém uma parte é capaz de permanecer na polpa interferindo na qualidade do produto final (CHRISTOV e PRIOR, 1997). Estudos têm mostrado a aplicação de enzimas hemicelulolíticas como a xilanase e a mananase neste processo, solubilizando a hemicelulose e facilitando indiretamente a retirada da lignina. Porém, tem-se descrito que a extensão da hidrólise da hemicelulose residual na polpa é dependente entre outros fatores, das propriedades das enzimas, como a massa molar, as cargas líquidas, o ponto isoelétrico, a estabilidade térmica e ao pH e à interferência de inibidores da sua atividade.
Face ao exposto, o conhecimento das características das celulases e hemicelulases produzidas por C. subvermispora durante a biodegradação de cavacos de Pinus taeda é um ponto a contribuir, no sentido de melhor compreender as alterações estruturais ocorridas na madeira e à possibilidade de aplicação do extrato enzimático bruto ou das enzimas puras em outros processos biotecnológicos.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. CONSTITUINTES DA MADEIRA
O teor, a proporção e a estrutura química dos diferentes componentes da madeira podem variar de acordo com a espécie da madeira. Em geral as madeiras podem ser classificadas em duras (“hardwood”) ou moles (“softwood”). As madeiras duras são provenientes de angiospermas como, por exemplo, o eucalipto, ipê e peroba e as madeiras moles de gimnospernas, grupo das coníferas como o pinho, cedro, cipreste (FENGEL e WEGENER, 1989; HIGUCHI, 1985). Os principais componentes da madeira são celulose, hemicelulose e lignina. Além destes, em muitas espécies, outros componentes químicos, coletivamente chamados de extrativos estão presentes.
A célula vegetal deposita a sua parede celular em várias camadas. A parede celular primária é formada pelas microfibrilas de celulose e é continuamente depositada durante o crescimento em área da célula. A madeira desenvolve em seguida internamente uma parede celular secundária composta principalmente de celulose e lignina. Após a divisão celular, as células recém formadas permanecem unidas por uma substância intercelular, chamada lamela média, constituída principalmente por lignina (FIGURA 1) (FENGEL e WEGENER, 1989). De acordo com as orientações das microfibrilas de celulose, a parede secundária pode ser dividida em três camadas, denominadas S1, S2 e S3. As camadas da parede celular são constituídas de microfibrilas de celulose e da matriz. A composição da matriz é heterogênea variando em diferentes partes da parede, em diferentes tipos celulares e em diferentes espécies. As hemiceluloses que compõem a matriz podem ser: xilana, glucomanana, galactomanana, manana e xiloglucana. Além dessas substâncias a matriz contém proteínas e compostos fenólicos tais como lignina, ácido ferúlico, ácido cumárico (DANIEL, 2003).
FIGURA 1 – Representação das camadas da parede das células de madeira mostrando lamela média (ML), parede celular primária (P), as camadas da parede celular secundária (S1, S2 e S3), e o lúmen (W) das células de madeira (FENGEL e WEGENER, 1989).
A celulose que constitui a parede celular é uma cadeia constituída de no mínimo 15000 resíduos de glicose unidos por ligações ß-1,4, sem ramificações (FENGEL e WEGENER, 1989). Quando dois anéis glicopiranosídicos se unem através deste tipo de ligação, forma-se a celobiose. O grupo hidroxílico no
carbono 1 (C1) possui propriedades redutoras, enquanto as hidroxilas do
carbono 4 (C4) são não redutoras (FIGURA 2). Cerca de 30 a 100 moléculas de celulose alinham-se paralelamente formando as microfibrilas. A íntima associação entre as microfibrilas resulta em fibras rígidas, insolúveis e cristalinas, embora a cristalinidade seja freqüentemente interrompida por regiões menos ordenadas, denominadas amorfa ou paracristalina (FIGURA 3) (FENGEL e WEGENER, 1989). Na parede celular da madeira a estrutura altamente ordenada da macromolécula de celulose permite que polímeros de celulose adjacentes se ajustem formando uma estrutura longa como uma fibra, chamada microfibrila. As macromoléculas de celulose na microfibrila são mantidas juntas por muitas pontes de hidrogênio intra e intermoleculares. A estrutura altamente ordenada da celulose e as pontes de hidrogênio intermoleculares são a base para muitas das propriedades físico-químicas da
celulose nas plantas, incluindo a rigidez e a sua natureza insolúvel. A rigidez e a natureza cristalina das microfibrilas de celulose são responsáveis tanto pelo seu papel funcional na parede celular das plantas quanto pela sua resistência à decomposição microbiana (SINSABAUGH e LIPTAK, 1997).
FIGURA 2 – Estrutura da celulose (a) unidade de celobiose; (b) extremidade redutora e não redutora.
FIGURA 3 – Estrutura representando as regiões cristalina e amorfa de uma microfibrila de celulose.
As polioses ou hemiceluloses são compostas principalmente pelos
açúcares glicose, manose e galactose (hexoses), xilose e arabinose
(pentoses), podendo ainda apresentar quantidades variáveis de ácidos urônicos e desoxi-hexoses em alguns tipos de madeira. Apresenta-se na forma de estruturas ramificadas, de menor massa molar que a celulose e podem ser homopolímeros ou heteropolímeros. O teor de polioses em diferentes tipos de madeira é bastante variável, mas pode-se assumir um valor médio de cerca de
20 % (FENGEL e WEGENER, 1989). Em madeiras moles tem sido observada a maior presença de manose, arabinose e galactose formando 4-O-metil-arabinoglicuronoxilanas e O-acetil-galactoglicomanana (TABELA 1). Em madeiras duras, observou-se maior quantidade de xilose e grupos acetil formando O-acetil-4-O-metilglicuronoxilanas (FENGEL e WEGENER; 1989).
As hemiceluloses 4-O-metilglicuronoxilana e 4-O-metilglicurono arabinoxilanas são comumente conhecidas como xilanas. As glicuronoxilanas consistem numa cadeia principal, formada por moléculas de xilose, unidas entre si por ligações β-1-4 e cadeias laterais de ácido metilglicurônico, unidas por ligações α na posição 2 (ou 3) da unidade de xilose. As glicuronoxilanas das madeiras duras possuem alto teor de grupos acetila, sendo 1 a cada 10 unidades de xilose (FIGURA 4A). As glicuronoarabinoxilanas, ou xilanas de coníferas assemelham-se as glicuronoxilanas, mas apresentam ainda, unidades de arabinose, ligadas às posições 2 ou 3 dos monômeros de xilose. Há 1 ou 2 grupos laterais de ácido glicurônico e 1 a 3 unidades de arabinose, por 10 unidades de xilose (FIGURA 4B).
As galactoglicomananas são heteropolímeros que possuem tanto manose como glicose, na cadeia principal, e, nas madeiras de coníferas, são dotadas de grupos laterais de galactose ligados à posição 6 das unidades da cadeia principal. As unidades da cadeia principal são unidas por ligações do tipo β 1-4 e há cerca de 1 grupo lateral de galactose para cada 30 unidades da cadeia principal, nas coníferas (FIGURA 4C).
TABELA 1 – Unidades constituintes das polioses em várias espécies de madeiras (FENGEL e WEGENER, 1989)
Espécies Manose % Xilose % Galactose % Arabinose % Ac. urônico % Acetil % Referência
Pinus sylvestris 12.4 7.6 1.9 1.5 5.0 1.6 Cote et al., 1966
Picea abies 13.6 5.6 2.8 1.2 1.8 - Fengel, 1978
Fagus grandifolia 1.8 21.7 0.8 0.9 5.6 4.3 Timell, 1969
FIGURA 4 – Estruturas de hemiceluloses (Adaptado de KANTELINEN, 1993) A: glicuronoxilana de madeiras duras; B: glicuronoarabinoxilana de coníferas; C: galactoglicomanana de coníferas
A lignina é composta basicamente de unidades de fenilpropano formando uma macromolécula tridimensional e amorfa. O primeiro modelo da lignina foi descrito por Freudenberg em 1964, neste modelo parte da lignina foi mostrada com 18 unidades de fenilpropano, com um total de mais de 100 unidades na molécula completa (FENGEL e WEGENER, 1989). Como pode ser observado na FIGURA 5, uma modificação na estrutura foi introduzida mais tarde por Addler (FENGEL e WEGENER, 1989). O acoplamento das unidades de fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva, o que é atribuído ao mecanismo de biossíntese da lignina, que se processa por via radicalar a partir da reação de três diferentes álcoois cinamílicos precursores, álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico (FIGURA 6) que geram unidades p-hidroxibenzílicas, guaiacílicas e siringílicas, respectivamente. Os diferentes tipos de acoplamento entre os precursores dão origem a vários tipos de ligações entre as unidades fenilpropano. As mais abundantes são: β-O-4 e α-O-4 (50-65 %), β-1 (9-15 %), β-5 (6-15 %), 5-5 (2-9 %), e β-β (2-5 %) (FENGEL e WEGENER, 1989).
Existe ainda uma fração menor da madeira, formada basicamente por compostos fenólicos e resinas, que são chamados de extrativos e
compreendem cerca de 2 a 4 % da madeira. Entre estes compostos
encontram-se os terpenos, ésteres de ácidos graxos, compostos fenólicos e outros compostos de baixa massa molar. É interessante ressaltar que todos os constituintes da madeira estão intimamente associados e\ou ligados quimicamente, construindo todo o complexo celular (FENGEL e WEGENER, 1989; HIGUCHI, 1985).
FIGURA 5 – Modelo esquemático da estrutura da lignina de madeira mole de acordo com Addler (FENGEL e WEGENER, 1989)
FIGURA 6 – Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (I) álcool p-cumarílico; (II) álcool coniferílico; (III) álcool sinapílico (FENGEL e WEGENER, 1989) 3 3 CH CH CH O H2 CH O H2 2 CH CH CH CH O CH H CO O H O H O CH3 O H I II III CH O H
á lcool p-cum a rílico á lcool conife rílico á lcool sina pílico
2 5 - 5 -β β - 1 - 5 - O - 4 β β β 3 O C H | γ β α 3 O C H H C O H2 _ H C O 12 O H 11 | | | | | 2 H C O C H 10 H O 9 2 H C O H | | | | 8 __ 7 ___ ______ _ O C 6 ______ 3 H C O 5 | | | | | | | | | ___ _ 4 _ _ _ _ | | | | | | | | | | _ _ _ _ 16 ___ ___ ___ ___ ___ C H C H 15 14 ___ H C H C H C H C H C H C 3 H C O 3 13 | | | | | | | | | | | | | | | | | | ______
______
______ H C ___ 2 ___ 2 C H OH H C = O 1 | || | | | | | | | | | | | | H O C H H O C H H O C H H C O H H C O H H C O H H C O H H C O H H C O H H C O H 2 2 2 2 H C O H2 H C O H 2 2 H C O H H C O H 2 H C O H H C O H 2 O C H 3 O C H 3 O C H 3 3 3 H C O H C O 3 H C O 3 H C O 3 H C O 3 H C O 3 3 3 H C O O H O H H C H C H C H C H C C H C H C H C H C H C H C = O O O O O O O O O O O O O O O O H C O H 2 H C O H H C C H ______ __ H O H2 C C C = O-| -| O H ___2.2. ENZIMAS ENVOLVIDAS NA DEGRADAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA PAREDE CELULAR
Vários estudos conduzidos com fungos e bactérias têm mostrado que a maioria destes microrganismos produz celulases e hemicelulases, porém muitos não são capazes de degradar a parede celular das madeiras. Desde que a produção das celulases e hemicelulases não está relacionada com a biodegradação da madeira, acredita-se que um dos principais fatores que controlam a biodegradação é a disponibilidade da celulose e da hemicelulose para ser degradada por estas enzimas (DANIEL, 2003). Em paredes celulares lignificadas sugere-se que a celulose está associada com as hemiceluloses que por sua fez estão rodeadas por lignina formando assim, uma barreira impermeável.
Em particular, os fungos são os principais degradadores de madeira na natureza e empregam diferentes mecanismos para romper a barreira de lignina. Enzimas extracelulares de ação hidrolítica e oxidativa e compostos de baixa massa molar, produzidos por diferentes fungos decompositores, causam diferentes formas de degradação da madeira. A degradação ocorre necessariamente de forma extracelular, uma vez que os componentes dos materiais lignocelulósicos devem ser inicialmente despolimerizados até compostos menores que são susceptíveis ao transporte pela parede celular e ao metabolismo intracelular dos fungos envolvidos (FERRAZ, 2004).
Dependendo da maneira que degradam a madeira, os fungos são então classificados em causadores de podridão parda (Brown-rot fungi – degradam principalmente polissacarídeos), podridão branda (Soft-rot fungi – podem degradar lignina e polissacarídeo, porém em velocidade muito baixas) e podridão branca (White-rot fungi – degradam todos os componentes da madeira) (ERIKSSON et al., 1990).
Os fungos causadores de podridão branca pertencem principalmente à classe Basidiomycetes, com algumas espécies pertencentes à classe Ascomycetes. Esta classe de fungos pode ser distinguida em dois grupos: o grupo dos fungos que degradam simultaneamente todos os componentes lignocelulósicos e o grupo dos fungos que degradam primeiramente a lignina e a hemicelulose, preservando a celulose. Entretanto, estudos em laboratório,
das vias de degradação utilizadas pelos fungos causadores de podridão branca, têm mostrado que a degradação não ocorre de forma uniforme através da madeira. O mesmo fungo pode causar deslignificação seletiva em determinada área e a poucos milímetros dali causar a degradação simultânea de celulose e lignina. Existem relatos que alguns fungos causadores de podridão branca atacam tanto seletivamente quanto não seletivamente em diferentes regiões de uma mesma porção de madeira (KUHAD et al., 1997; AKHTAR et al., 1998). A ordem nas quais variadas quantidades de lignina, celulose e hemicelulose são degradadas é diferente entre as espécies dos fungos de podridão branca e pode variar com o substrato que está sendo atacado e com o tempo de cultivo (ERIKSSON et al., 1990). Assim, um fungo pode causar uma degradação seletiva no início do cultivo, e com o passar do tempo tornar-se não seletivo (BLANCHETTE, 1980; HAKALA et al., 2004).
Os mecanismos distintos de degradação envolvidos em cada caso têm sido objeto de muitos estudos e um aspecto a ser considerado é o modo de ação das hemicelulases e celulases por estes fungos.
2.2.1. Hemicelulases
As enzimas que hidrolisam a hemicelulose podem ser divididas em enzimas que degradam a cadeia principal e enzimas que degradam as cadeias laterais (ERIKSSON et al., 1990; KUHAD et al., 1997). Assim a hidrólise das hemiceluloses ocorre de maneira aleatória, produzindo
heteroxilo-oligossacarídeos lineares e ramificados contendo cadeias laterais de
arabinofuranose, ácido glicurônico ou ácido 4-O-metil-glicurônico. Devido à complexa estrutura das hemiceluloses, diferentes tipos de enzimas são requeridos para sua modificação e degradação enzimática. Um sistema enzimático incluindo endo e exo-xilanases, mananases, β-xilosidase, α-glicuronidase e α-arabinofuranosidase torna-se necessário para a hidrólise completa desses heteroxilo-oligossacarídeos (BIELY, 1985). Entre estas, as duas principais enzimas degradadoras da hemicelulose são a endo-1-4-β-D-xilanase e a endo-1-4- β-D-mananase (BIELY, 1993). Formas múltiplas de cada classe de enzimas podem ocorrer e essas podem cooperar na hidrólise do substrato (WONG et al., 1988; BIELY et al., 1997) (FIGURA 7).
2 | 1 α MeGlA O H H H O OH H OH H C H3 O OH O H OH H H OH H O H O O OH O H H H H H O H O H O OH H H H H O H O OH H H H H O H O OH H H H H O O H H O H H H H O H O H CH3 CH3 O O O
-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xil
β1-2 | 1 α MeGlA Arab α 1 | 3 2 | Ac Ac | 3 Xilβ1-4Xil
β1-endo -1,4-β−xilanase (E.C. 3.2.1.8) β−xilosidase (E.C. 3.2.1.37) α−glucuronidase (E.C. 3.2.1)
α−L- arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55) acetilesterase (E.C. 3.1.1.6)
FIGURA 7 – Representação teórica da estrutura da xilana vegetal e pontos onde as enzimas atuam. Ac, grupo acetil; Arab, L-arabinofuranose; MeGlA, ácido 4-O-metil-glicurônico; Xil, D-xilose
2.2.2. Xilanases
A atividade das xilanases é altamente dependente da presença de enzimas capazes de degradar as cadeias laterais. A hidrólise de diferentes xilanas por xilanases rende variados produtos, os quais se diferem pelas quantidades de xiloses, xilobioses e xilotrioses liberadas, assim como a natureza dos açúcares com ácido urônico substituídos (BIELY, 1985).
A enzima principal para a despolimerização da xilana é a endo-1-4-β-xilanase (EC 3.2.1.8). Sua ação ocorre na cadeia principal da xilana, gerando xilo-oligossacarídeos menores substituídos ou não substituídos que serão clivados pela exo-1-4-β-xilanase (BIELY, 1985). Os substituintes são ao mesmo tempo liberados por esterases e glicosidases correspondentes, por exemplo: resíduos de α-L-arabinosil por α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), resíduos de 4-O-metil-D-glucuronosil ou D-glucuronosil por α-glucuronidase (EC 3.2.1), resíduos acetil por acetilesterase (EC 3.1.1.6). Os dímeros de xilose
são geralmente clivados pela β-xilosidase (EC 3.2.1.37), liberando D-xilose como único produto da hidrólise. A β-xilosidase é importante quando a hidrólise completa da xilana é requerida (BIELY, 1985; COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993).
Porém, as ligações não são todas equivalentes e igualmente acessíveis para as enzimas xilanolíticas. Além disso, a acessibilidade de algumas ligações também muda durante o curso da hidrólise devido à retirada de substituintes e diminuição do tamanho da cadeia (WONG et al., 1988). Assim, a produção de um sistema xilanolítico com múltiplas enzimas de diferentes especificidades está normalmente envolvida no processo de hidrólise para ocorrer um ataque eficiente às ligações (THOMSON, 1993). A produção de múltiplas xilanases de origem microbiana tem sido documentada, variando as suas especificidades e tendo sinergismo no processo de degradação das xilanas (WONG et al., 1988; BIELY et al., 1997; LI et al., 2000). Dois tipos de endoxilanases fúngicas foram descritos: xilanases capazes clivar ligações glicosídicas próximas a ramificações da cadeia principal e xilanases que clivam ligações glicosídicas mais distantes das ramificações da cadeia principal. Sendo que muitas das endoxilanases capazes de clivar ligações glicosídicas próximas a ramificações da cadeia principal não são específicas, hidrolisando além das xilanas, celulose, carboximetilcelulose, p-nitofenil-β-glucosídeo, celo-oligômeros e laminarina (WONG e SADDLER, 1992; SARASWAT e BISARIA, 2000). Existe evidência da ocorrência de três a cinco xilanases em certas bactérias e fungos (WONG e SADDLER, 1992). Em Trichoderma spp, diferentes xilanases foram detectadas e três delas purificadas e caracterizadas (DEKKER, 1983; WONG et al., 1988). Phanerochaete chrysosporium produziu cinco xilanases além de outras enzimas do complexo xilanolítico. (COMTAT, 1983). Múltiplas β-xilosidases também foram caracterizadas de Trichoderma reesei e Sclerotium
rolfsii, apresentando massas molares entre 60 e 100 kDa (KUHAD et al., 1997;
ANDRADE et al., 2004).
Estudos com fungos demonstram que algumas destas múltiplas enzimas podem ser produtos de um mesmo gene ou de genes distintos com o mesmo objetivo de melhorar a hidrólise das xilanas. A síntese de múltiplas endo-xilanases produzidas por um único microrganismo foi revelada com base
nas suas diferentes propriedades físico-químicas, como massa molar e ponto isoelétrico.
Uma cuidadosa comparação de endo-xilanases feita por WONG et al. (1988), indicou que com base nas similaridades da seqüência de aminoácidos dos seus domínios catalíticos, estas enzimas podem ser divididas em dois grupos, um contendo enzimas de alta massa molar (> 30 kDa) e com valores baixos de ponto isoelétrico, designadas como glucanase da família 10 (antigamente família F), e um outro grupo contendo enzimas de baixa massa molar com valores altos de ponto isoelétrico designadas como glucanase família 11 (antigamente família G) (HENRISSAT e BAIROCH, 1993;1996) Apesar de limitado o conhecimento sobre as diferentes propriedades catalíticas das endo-xilanases nas duas famílias das glicosil hidrolases, está certo que as enzimas pertencentes à família 10 possuem maior versatilidade catalítica ou menor especificidade com o substrato do que as enzimas da família 11 (BIELY et al., 1997). A maior versatilidade catalítica das endo-xilanases da família 10 em comparação com as da família 11 pode ser explicada por suas diferenças na estrutura terciária, estabelecidas por cristalografia de raio X. As endo-xilanases da família 11 são moléculas menores e bem mais compactas (DAVIS e HENRISSAT, 1995). Além disso, o sítio de ligação ao substrato das endo-xilanases da família 10 é aparentemente menos profundo que os da família 11. Este fato, junto com uma possível maior flexibilidade conformacional das enzimas maiores do que das enzimas menores pode contribuir para a menor especificidade ao substrato das endo-xilanases da família 10 (BIELY et al., 1997).
A maioria das endo-xilanases é muitas vezes descrita como enzimas constituídas de um domínio catalítico (CD) (KULKARNI et al., 1999). Entretanto, algumas endo-xilanases da família 10 e 11 possuem além do domínio catalítico um domínio de ligação a carboidrato, normalmente um domínio de ligação à celulose (CBD) ou um domínio de ligação a xilana (XBD), conectado ao CD por uma haste flexível rica em glicina (TORRONEN e ROUVINEN, 1997; CANALS et al., 2003). A presença de pelo menos um domínio de ligação a carboidrato pode ligar a enzima a regiões específicas do substrato aumentado efetivamente à concentração da mesma, o qual leva a um aumento da eficiência catalítica. Endo-xilanases da família 10 têm em geral
massa molar próxima de 40 kDa, enquanto as endo-xilanases da família 11 apresentam massa molar ao redor de 20 kDa (HIMMEL et al., 1997; SAPAG et al., 2002). As endo-xilanases fúngicas em geral apresentam massa molar entre 16 e 75 kDa (KIRK e CULLEN, 1998). Estudos têm mostrado que estas enzimas apresentam pH ótimo entre 2,0 e 8,0 e uma temperatura ótima entre 45 e 70 ºC (RIZZATTI, 2004). A termoestabilidade e o pH ótimo destas enzimas, são parâmetros de particular interesse devido principalmente ao fato de suas possíveis aplicações biotecnológicas (COLLINS et al., 2005).
Um crescente número de aplicações biotecnológicas tem sido descrito para xilanases, sozinhas ou em combinação com outras enzimas. Entre estas aplicações estão: o biobranqueamento de polpa celulósica, sacarificação de biomassa lignocelulósica, manufatura de pão, fabricação de ração animal, e indústria de sucos de frutas (COUTRIN et al., 1999; LEE, 1997; HAKI e RAKSHIT, 2003). Estas aplicações requerem enzimas capazes de operar sobre condições específicas e freqüentemente não naturais. Biobranqueamento em particular requer enzimas termoestáveis e com pH ótimo alcalino (KULKARNI et al., 1999). Endo-xilanases da família 11 podem ser de especial interesse devido ao seu menor tamanho, o qual pode facilitar a penetração da enzima na fibra de celulose (SAPAG et al., 2002).
2.2.3. Mananases
As mananases estão classificadas nas famílias 5 e 26 das glicosil hidrolases (HENRISSAT E BAIROCH, 1993). São capazes de hidrolisar as ligações 1,4-β-D-manopiranosil das mananas e glicomananas. A enzima 1,4-β-manosidase (EC 3.2.1.25) age sinergicamente com as endo-mananases, hidrolisando ligações 1,4-β-D-manosil das extremidades não redutoras de mano-oligossacarídeos e de glicopeptídeos contendo manose (XU et al., 2002).
Estudos com 1,4-β-manosidases e 1,4-β-mananases fúngicas mostraram que as enzimas foram ativas em vários substratos naturais e que muitas vezes também exibiram atividades junto a p-nitrofenil-β-D-manosideo, carboximetilcelulose e xilanas (FRANGOS, 1999; FERREIRA e FILHO, 2004). A capacidade de degradar vários substratos talvez possa ser explicada pela diferença de especificidade existente entre as enzimas, pois uma multiplicidade
de mananases tem sido observada em várias espécies de fungos (GÜBITZ et al., 1996a). Mananases mais ou menos específicas foram estudadas e mananases com domínios de ligação à manana e à celulose, foram caracterizadas e apresentaram maior capacidade de ligarem-se a substratos mais complexos do que as mananases que apresentaram apenas domínio catalítico (SUNNA et al., 2001; HÄGGLUND et al., 2003). Em estudos com
T. reesei duas isoformas de mananase foram purificadas e indicaram ser
expressas por um único gene (STALBRAND et al., 1995), porém para fungos anaeróbicos três genes homólogos para mananase foram encontrados (MILLWARD-SADLER et al., 1994; HÄGGLUND et al., 2003).
Além da sua habilidade de hidrolisar diferentes mananas, algumas β-D-mananases têm sido estudadas para transglicosilação de mano-oligossacarídeos (HARJUNPÃÃ et al., 1995; BIELY, 1985). Uma endo-mananase de S. rolfsii clivou várias mananas e mano-oligossacarídeos, mas nenhuma manose foi formada durante a hidrólise de manotetrose, indicando uma reação de transglicosilação (GÜBITZ et al., 2000).
A maioria das mananases fúngicas apresenta ponto isoelétrico (pI) ácido entre 3,5 e 5,5, e pH ótimo entre 3,0 e 6,0 e somente algumas mananases têm apresentado atividade máxima em pH alcalino acima de 9,0. (AKINO e NAKAMURA, 1988; XU et al., 2002). A determinação da temperatura ótima de várias mananases mostrou uma atividade máxima destas enzimas entre 50 e 92º C e uma massa molar entre 35 e 65 kDa (GÜBITZ et al., 1996b). Uma exceção foi descrita para duas mananases de Enterococcus casseliflaus que possuem massas molares de 137 kDa e 142 kDa (ZAKARIA e YAMAMOTO, 1998).
Mananases podem ser aplicadas na indústria alimentícia para a diminuição da viscosidade de sucos de frutas, extrato de café, chocolate e licor de cacau (McCLEARY, 1990; ZAKARIA e YAMAMOTO, 1998) e na indústria farmacêutica para produzir oligossacarídeos (AKINO e NAKAMURA., 1988; HOSSAIN et al., 1996). Mananases foram também avaliadas em combinação com xilanases em estudos de biobranqueamento da polpa celulósica, levando a uma redução significativa na quantidade de produtos químicos necessários para o branqueamento (VIIKARI et al., 1994; LAHTINEN et al., 1995; BHAT, 2000).
2.2.4. Celulases
Devido à constituição física da molécula de celulose e ao fato de que na natureza a celulose ocorre sempre associada à lignina e hemicelulose, a solubilização completa da celulose requer ações coordenadas de várias enzimas (KUBICEK, 1992).
Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação da celulose vêm sendo particularmente bem estudados em dois fungos: T. reesei e no fungo causador de podridão branca P. chrysosporium. A degradação da celulose ocorre pela ação de três classes principais de enzimas que atuam sinergicamente causando a hidrólise da celulose até glicose (KUHAD et al., 1997). Estas classes de enzimas hidrolíticas compreendem as
endo-1,4-β-glucanases (EC 3.2.1.4), as exo-1,4-β-glucanases ou
celobiohidrolases (EC 3.2.1.91) e as 1,4-β-glicosidases (EC 3.2.1.21)
(SINSABAUGH e LIPTAK, 1997; BHAT e BHAT, 1997). Esse modelo de biodegradação de celulose tem sido assumido como verdadeiro para a maioria dos fungos, porém sabe-se que há fungos deficientes na produção de exo-1,4-β-glucanases e a biodegradação completa do polímero pela via enzimática parece limitada.
As endoglucanases clivam a cadeia de celulose aleatoriamente em regiões menos cristalinas, criando então novas extremidades de cadeia. Exoglucanases (celobiohidrolases) agem em seqüência em tais extremidades, ou seja, são capazes de se ligar aos domínios cristalinos e liberar celobiose ou glicose das extremidades. Embora celobiohidrolases são freqüentemente categorizadas como exocelulases, medidas da atividade indicaram que elas podem também promover um endo-ataque inicial, criando extremidades onde iriam continuar a sua ação. A contribuição relativa e a significância da ação “endo” da celobiohidrolase operando sob condições naturais ainda não foi confirmada. A hidrólise completa da celulose ocorreria então pela ação das β-glicosidases, as quais hidrolisam celobiose e outras celodextrinas solúveis em glicose (FIGURA 8) (MUÑOZ et al., 2001).
FIGURA 8 – Mecanismo da decomposição da celulose pela ação do complexo celulolítico.
Além das enzimas hidrolíticas acredita-se que, enzimas oxidativas, também contribuem para a degradação da celulose. A celobiose desidrogenase (CDH) (EC 1.1.9.18) oxida as extremidades de celobiose ou celodextrinas maiores na presença de adequado aceptor de elétrons, porém a função biológica da enzima ainda não foi totalmente esclarecida (HENRIKSSON et al., 2000a; SIGOILLOT et al., 2002).
Uma multiplicidade das principais classes de celulases tem sido detectada nos extratos de cultivo dos fungos e mais de uma proteína distinta de cada classe também tem sido encontrada. Assim, foi encontrado em culturas de Trichoderma spp., três endoglucanases, duas celobiohidrolases e duas β-glicosidades. Tem sido geralmente aceito que essencialmente a mesma situação é também verdadeira para outros fungos, porém com diferenças na
quantidade de enzimas secretadas (WOOD e GARCIA-CAMPOYO, 1990). O sistema celulolítico do fungo causador de podridão branca P. chrysosporium tem sido extensivamente estudado e, diferentemente do T. reesei, foram encontradas cinco endoglucanases, uma celobiohidrolase e duas β-glicosidades (ERIKSSON e PETTERSSON, 1975; WOOD E GARCIA-CAMPOYO, 1990). Estudos recentes com P. chrysosporium incluíram celobiohidrolases ao complexo celulolítico deste fungo, celobiohidrolases 58, celobiohidrolases 62 e celobiohidrolases 50, sendo as duas primeiras consideradas similares as celobiohidrolases I e a última a celobiohidrolases II de T. reesei (HENRIKSSON et al., 2000b). Estas endo-glucanases de
P. chrysosporium apresentaram massas molares entre 28 e 37 kDa, sendo que
as endo-glucanases fúngicas têm apresentado massas molares entre 25 e 50 kDa (ERIKSSON et al., 1990) com um pI e um pH ótimo ácido ou levemente alcalino.
O sistema celulolítico do basidiomiceto causador de podridão branca
Irpex lacteus, também foi caracterizado e foram descritas três
celobiohidrolases, e uma endocelulase. A análise da seqüência de aminoácidos da celobiohidrolase 3 revelou significante homologia com as celobiohidrolases 1 e 2 do mesmo fungo e com celobiohidrolases I de P. chrysosporium e celobiohidrolases I de T. reesei (HAMADA et al., 1999).
Através das décadas, muitos dos esforços para esclarecer a bioquímica da decomposição da celulose ficaram direcionados para poucos gêneros de fungos: Trichoderma, Phanerochaete, Aspergillus, Penicillium, Fusarium solani
e S. rolfsii (ERIKSSON et al., 1990). Estudos comparando os modelos para a
hidrólise da celulose de T. reesei e P. chrysosporium na década de 80 já consideravam a existência de múltiplas enzimas nos complexos celulolíticos destes fungos.
Nestes estudos já era evidente que a hidrólise da celulose requeria dois tipos de endoglucanases diferindo na presença ou ausência de centros adicionais de adsorção mais tarde chamados de Domínio de Ligação à Celulose (CBD). Foi sugerido que endoglucanases de ligações fracas à celulose hidrolisavam regiões amorfas deixando as partes cristalinas intactas (RABINOVICH et al., 2002). Estas endoglucanases foram tidas como componentes minoritários do sistema celulolítico do T. reesei e
P. chrysosporium. Mais tarde as enzimas destes fungos foram identificadas
como endoglucanase III e endoglucanase 28, respectivamente. Porém, o papel central na decomposição da celulose cristalina foi dado às enzimas que possuíam uma ligação mais forte neste sistema, representadas por endoglucanases I e II, e celobiohidrolases I e II (RABINOVICH et al., 2002).
A multiplicidade destas enzimas tem levado a consideráveis problemas na designação das verdadeiras especificidades aos substratos de componentes individuais do sistema celulolítico e assim na determinação do provável modo e seqüência de ataque para a completa solubilização da celulose (WOOD e GARCIA-CAMPOYO, 1990). O modelo de ataque à celulose descrito acima inclui a possibilidade de ataque preferencial, mas não explica detalhadamente como ocorre o sinergismo.
Estudos têm mostrado que a degradação da celulose cristalina não ocorre quando os componentes do sistema celulolítico estão presentes individualmente no meio. No entanto, quando estão combinados agem de maneira sinérgica tornando a celulose solúvel. Quatro tipos de sinergismos têm
sido reportados entre celulases de fungos. Incluindo: a) endo e
celobiohidrolase; b) duas celobiohidrolases imunologicamente relacionadas e distintas; c) entre β-glicosidase e endoglucanases e d) entre β-glicosidase e celobiohidrolase. As dificuldades para uma explicação satisfatória para as especificidades aos substratos dos componentes do sistema celulolítico aparentemente purificados, o seu modo de ataque e a significância da ação sinérgica têm levado a trabalhos consideráveis de clonagem de genes, análises de seqüências e análises estruturais para celulases fúngicas e bacterianas. Destes estudos têm sido concluído que a maioria das celulases são constituídas de três regiões principais: um domínio catalítico (CD), uma região “dobradiça” altamente glicosilada rica em prolina, treonina e resíduos de serina, e um domínio de ligação à celulose (CBD) (ARCHER e WOOD, 1994).
As celulases têm atraído bastante interesse comercial devido às suas várias aplicações em áreas como bioconversão de materiais celulósicos, alimentação, têxteis, farmacêuticos, detergentes, tratamento de efluentes e processamento de frutas e vegetais. O interesse na aplicação de enzimas na indústria e papel tem aumentado nos anos recentes, e uma das principais aplicações tem sido a remoção de tintas de papéis reciclados. As celulases
também têm sido utilizadas com sucesso na indústria têxtil para o “bio-stoning” de jeans e o “bio-polishing” de algodão e de outras fibras celulósicas (KUHAD et al., 1997; BHAT, 2000).
2.3. Ceriporiopsis subvermispora
Apesar da importância de C. subvermispora na biopolpação, o sistema extracelular que esse microrganismo utiliza para decompor a madeira seletivamente ainda não está bem esclarecido, pois ainda não se consegue explicar muito bem como as enzimas envolvidas na biodegradação penetram na parede celular da madeira. Vários trabalhos têm demonstrado que enzimas lignocelulolíticas não penetram na parede celular intacta (BLANCHETTE et al., 1997; SREBOTNIK et al., 1998; KIRK e CULLEN, 1998). No entanto, BLANCHETTE et al. (1997) demonstraram que C. subvermispora causa alterações estruturais significativas na lignina presente na parede celular e na lamela média, mesmo antes da parede celular vegetal ser permeável a proteínas de 5730 Da. Dessa forma, vários trabalhos têm sugerido que alguns compostos de baixa massa molar poderiam atuar nos estágios iniciais de biodegradação da madeira, degradando componentes da parede celular a ponto de permitir a penetração de enzimas oxidativas e hidrolíticas. Sem dúvida, estas enzimas são ativas ao longo das envolturas da hifa em contato com a parede celular da madeira. A produção e penetração da micro-hifa e de envolturas extracelulares de fungos por alguns fungos causadores de podridão branca na parede celular de madeiras sugerem que processos degradativos nestas instâncias podem ser diferentes, e que proteínas com grandes massas molares aparentam ter acesso rápido a áreas degradadas nas paredes celulares (MESSNER et al., 2003) Considerando que os fungos causadores de podridão branca formam um grupo de organismos tão grande e diverso, muitas formas diferentes de ataque à parede celular são encontradas (BLANCHETTE et al., 1997).
As enzimas extracelulares produzidas por este fungo compreendem as lacases e as manganês peroxidases, o complexo xilanolítico completo e parte do complexo celulolítico (SETHURAMAN et al., 1998; FERRAZ et al., 2003) Estudos do sistema lignolítico do C. subvermispora revelaram que este fungo
não produz lignina peroxidase em culturas líquidas e sólidas, sugerindo que diferentes estratégias devem ser usadas para degradação da lignina (SALAS et al., 1995; ENOKI et al., 1999; LOBOS et al., 2001; HOFRICHTER, 2002; HAKALA et al., 2004; SOUZA-CRUZ et al., 2004).
A produção de um sistema celulolítico incompleto tem sido considerada um dos motivos para a inexpressiva degradação de celulose pois as exocelulases são produzidas em pequenas quantidades, embora endo-celulases e β-glicosidases são produzidas em quantidades comparáveis às reportadas por outros basidiomicetos de decomposição branca (SETHURAMAN et al., 1998; SOUZA-CRUZ et al., 2004). Como em vários basidiomicetos, a expressão dessas enzimas é dependente do substrato (SETHURAMAN et al., 1998), e quando estudada em meios sintéticos, nem sempre reflete os acontecimentos do sistema in situ ou in vivo.
3. OBJETIVO
O processo de biopolpação de madeira utilizando C. subvermispora já se encontra em vias de implementação industrial, porém poucos aspectos químicos e bioquímicos da interação do fungo na madeira foram elucidados. Uma das razões é que o sistema extracelular que o C. subvermispora produz durante a biodegradação da madeira ainda não foi completamente descrito. O presente trabalho, teve como objetivo, a purificação e a caracterização de algumas enzimas hidrolíticas produzidas por C. subvermispora em cavacos de
P. taeda visando a melhor compreensão de sua importância e função na
biopolpação.
Para atingir esse objetivo foram desenvolvidas as seguintes etapas: 9 Obtenção do extrato enzimático bruto de C. subvermispora cultivado por
30 dias em um sistema de fermentação sólida;
9 Análise da atividade das enzimas hidrolíticas extracelulares produzidas durante o processo de biodegradação;
9 Purificação das enzimas;
9 Caracterização das enzimas purificadas quanto as suas constantes cinéticas, temperatura ótima, pH ótimo, inibição por metais e especificidade aos substratos.
4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. SOLUÇÕES TAMPÕES
Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4
Solução de ácido acético 0,2 M 8,8 mL
Solução de acetato de sódio 0,2 M 41,2 mL
Água destilada (q.s.p.) 200 mL
Tampão acetato de sódio 20 mM, pH 5,4
Solução de ácido acético 0,2 M 8,8 mL
Solução de acetato de sódio 0,2 M 41,2 mL
Água destilada (q.s.p.) 500,0 mL
Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8
Solução de ácido acético 0,2 M 20,0 mL
Solução de acetato de sódio 0,2 M 30 mL
Água destilada (q.s.p.) 200 mL
Tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0
Fosfato de sódio monobásico 0,2 M 87,7 mL
Fosfato de sódio dibásico 0,2 M 13,3 mL
Água destilada (q.s.p.) 400 mL
Tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0
Fosfato de sódio monobásico 0,2 M 39,0 mL
Fosfato de sódio dibásico 0,2 M 61,0 mL
Tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0
Fosfato de sódio monobásico 0,2 M 5,3 mL
Fosfato de sódio dibásico 0,2 M 94,7 mL
Água destilada (q.s.p.) 400 mL
Tris-HCI 50 mM, pH 9,0
Trisma-base 0,2 M 50 mL
HCI 0,2 M 5,0 mL
Água destilada (q.s.p.) 200 mL
Tampão Citrato fosfato 0,05 M
Ácido cítrico (mL) Fosfato de sódio
dibásico (mL) pH 44,6 5,4 2,6 39,8 10,2 3,0 33,9 16,1 3,6 30,7 19,3 4,0 26,7 23,3 4,6 24,3 25,7 5,0 21,0 29,0 5,6 17,9 32,1 6,0 13,6 36,4 6,6 6,5 43,6 7,0
4.2. FUNGO
O fungo utilizado neste estudo foi o basidiomiceto de decomposição branca C. subvermispora (Pilat) Gilbn & Ryv, pertencente à classe dos Basidiomycetes, proveniente da micoteca da Universidad de la República, Montevideo, UY, gentilmente cedido pela Profª. M. Speranza.
4.3. MANUTENÇÃO DA CEPA
A linhagem foi repicada e mantida em placa de Petri com meio contendo 2,0 % de extrato de malte, 0,2 % de extrato de levedura e 2 % de agar e
cultivados a 27 ± 2 ºC durante 10 dias. Todo o processo de repicagem e
inoculação foi realizado em uma câmara de fluxo laminar.
4.4. PREPARAÇÃO DA MADEIRA
A madeira utilizada como substrato nos experimentos de biodegradação foi obtida de um exemplar de P. taeda (aproximadamente 28 anos) doado pelo Parque Estadual de Campos do Jordão - SP. A composição desta madeira foi determinada por MENDONÇA et al. (2002) (TABELA 2).
Os cavacos foram preparados manualmente (cerca de 2,5 x 1,8 x 0,2 cm), secos ao ar e estocados dentro de sacos de polietileno.
Previamente aos experimentos de biodegradação, os cavacos foram imersos em água por um período de 16 horas.
TABELA 2 – Constituição química do P. taeda utilizado neste trabalho
Componentes % dos componentes na madeira
Celulose 47,8 ± 0,9
Poliose 23,1 ± 0,9
Lignina 28,6 ± 0,4
Substâncias extraíveis em etanol e
