Determinação de contaminantes microbiológicos

O produto solução injetável de cloreto de sódio 0,9% (m/v) deve estar de acordo com os requisitos farmacopéicos, quanto aos ensaios microbiológicos de esterilidade e de endotoxinas bacterianas (UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION, 2010).

4.2.1.11.1 Ensaio de esterilidade

O teste de esterilidade é aplicável a insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos para saúde, enquadrados como estéreis, sendo adequados para revelar a presença de bactérias e fungos. O resultado considerado satisfatório indica que não foi encontrado microorganismo contaminante na amostra examinada (UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION, 2010).

Preparação dos meios de cultura

Os meios de cultura utilizados para testes de esterilidade foram o Meio fluido de tioglicolato e o Caldo de caseína soja:

(a). Meio fluido de tioglicotato: foram pesados 0,5 g de L-cistina, 2,5 g de cloreto de sódio, 5,5 g dextrose, 0,75 g de ágar granulado, 5,0 g de extrato de levedura e 15 g de peptona de caseína, cuja hidrólise tenha sido com pancreatina e 0,001 g de rezasurina sódica e misturados com 1000 mL de água purificada. Após aquecimento e dissolução dos componentes, foi adicionado 0,5 g de tioglicolato de sódio e quando necessário o pH ajustado com hidróxido de sódio 1N, o qual deve ser de 7,1 ± 0,2 após a esterilização. A mistura foi homogeneizada e distribuída

em frascos adequados, com volumes de 100 mL. Os frascos são fechados e esterilizados.

(b). Caldo de caseína soja: foram pesados 17 g de peptona de caseína, cuja hidrólise tenha sido realizada com pancreatina, 3 g de farinha de soja hidrolisada com papaína, 5 g de cloreto de sódio, 2,5 g de fosfato de potássio dibásico, 2,5 g de dextrose. Todos os componentes foram dissolvidos em 1000 mL de água purificada, aquecendo suavemente. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e o pH ajustado com hidróxido de sódio 1N de modo que, após a esterilização, o pH da solução seja de 7,3 ± 0,2. A mistura foi distribuída em frascos adequados com volume de 100 mL de caldo, fechados e esterilizados.

Procedimento

Para a realização do ensaio de esterilidade, foi utilizado o método de Filtração em membrana. Para tanto, foram utilizadas 10 unidades da amostra de cada fabricante A, B, C e D. Todos os equipamentos e aparatos utilizados eram estéreis e todo o ensaio realizado em câmara de fluxo laminar classe II tipo A (máximo de 3520 partículas ≥ 0,5 µm/m3_{), instalada em sala limpa classe B - ISO 7 (máximo 352 000} partículas ≥ 0,5 µm/m3).

Antes de proceder ao teste, retirou-se o invólucro protetor da embalagem primária quando aplicável e realizou-se a assepsia das superfícies externas das embalagens.

Foram utilizadas membranas filtrantes de éster de celulose com porosidade nominal não superior a 0,45 µm e com diâmetro de aproximadamente 50 mm, com eficiência em reter microrganismos. O dispositivo de filtração foi montado e todo o conteúdo de solução de cada amostra foi filtrado, utilizando sucção a vácuo. Após a filtração, foi realizada a lavagem da membrana com três porções de 100 mL de solução de peptona de carne em água purificada. A membrana foi seccionada em duas partes iguais e cada metade foi transferida, assepticamente, para tubos contendo os meios selecionados caldo tioglicolato e caldo caseína soja.

Os tubos foram incubados em estufa bacteriológica em condições de temperatura de 32,5ºC ± 2,5ºC e 22,5ºC ± 2,5ºC, respectivamente, para os meios tioglicolato e caseína soja, por um período de 14 dias. Também foram realizadas

leituras no intervalo de 7 dias de incubação (UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION, 2010).

4.2.1.11.2 Ensaio de endotoxinas bacterianas

O teste é preconizado para detectar endotoxinas de bactérias gram negativas. Para tanto, utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus, preparado e caracterizado como reagente LAL (COMISSÃO FARMACOPÉIA ANVISA V, 2010).

A técnica utilizada neste ensaio foi o método de coagulação em gel, que se trata de método semiquantitativo baseado na formação de coágulo ou gel. Para a realização do ensaio, foram utilizados descartáveis plásticos, como ponteiras e pipetas livres de endotoxinas para que não houvesse interferência no teste. Foi utilizado o reagente LAL, marca Charles River Endosafe®_{, 0,125 EU/mL.}

Determinação da Máxima Diluição Válida (MDV)

A máxima diluição válida é a máxima diluição permitida da amostra em análise onde o limite de endotoxina pode ser determinado. A fórmula utilizada é aplicável quando o limite de endotoxina especificado na monografia estiver em volume (EU/mL). Para tanto, utiliza-se a seguinte equação para o cálculo da MDV:

MDV = limite de endotoxina / λ

Onde: MDV: máxima diluição válida e λ: é a sensibilidade rotulada do reagente de LAL.

O limite de endotoxina bacteriana para a solução injetável de cloreto de sódio 0,9% é de 0,5 unidades de endotoxinas (UE) por mL de cloreto de sódio. A diluição para o teste foi de 4x.

Reconstituição do kit reagente LAL Charles River Endosafe®

Para a preparação do padrão de endotoxina, foram utilizadas as orientações descritas pelo fabricante, certificados no laudo de endotoxina.

Retirou-se o lacre do frasco contendo o reagente liofilizado do LAL ao abrir cuidadosamente, somente para retirada do vácuo. Com o auxílio de uma pipeta

automática, com ponteira apirogênica, adicionou-se 5,2 mL da água apirogênica ao frasco do LAL. O frasco foi fechado e a solução cuidadosamente homogeneizada para evitar a formação de espuma. Conservou-se sob refrigeração entre 2ºC – 8ºC por no máximo quatro semanas para que se pudesse realizar o teste da sensibilidade do reagente LAL.

Sensibilidade do LAL

Foi realizado o teste para confirmação da sensibilidade do reagente LAL, através de uma série de diluições de endotoxina bacteriana com concentrações de 2λ, λ, ½λ, ¼λ, onde λ é a sensibilidade declarada do LAL em EU/mL. O preparo da série de diluições foi realizado ao agitar cada diluição por, pelo menos, um minuto antes da realização da diluição subseqüente. Realizaram-se os cálculos de diluição até a concentração desejada. O teste foi realizado com as quatro concentrações do padrão de endotoxina em quadruplicata e ainda foram incluídos os controles negativos.

A média geométrica logarítmica (MG) das concentrações dos pontos finais de gelificação deve estar entre ½λ e 2λ. O ponto final de gelificação trata-se do último teste da série decrescente de concentração de endotoxina padrão que formou o gel. A sensibilidade do reagente LAL em EU/mL é calculada pela fórmula seguinte:

MG = antilog (∑e/f)

Onde: MG = média geométrica da concentração do ponto final; ∑e = somatória do logaritmo dos pontos finais e f = número de replicatas.

Tabela 2. Confirmação da sensibilidade do LAL (λ) no Tempo 0. Endotoxina

Tubo 2λ Λ ½λ ¼λ Ponto Final

1 (+) (+) (+) (-) 0,5 λ

2 (+) (+) (+) (-) 0,5 λ

3 (+) (+) (+) (-) 0,5 λ

4 (+) (+) (+) (-) 0,5 λ

Tabela 3. Confirmação da sensibilidade do LAL (λ) no Tempo 180 dias. Endotoxina

Tubo 2λ Λ ½λ ¼λ Ponto Final

1 (+) (+) (-) (-) λ

2 (+) (+) (-) (-) λ

3 (+) (+) (-) (-) λ

4 (+) (+) (-) (-) λ

Média Geométrica λ

Preparação de amostras, controles e padrão (a) Controle positivo do kit

Foram transferidos para um tubo de ensaio apirogênico, 100 µL de endotoxina com concentração igual a 0,5 EU/mL e 100 µL de água apirogênica do kit, obtendo- se uma concentração de endotoxina igual a 0,25 EU/mL.

(b) Controle negativo do kit

O controle negativo do kit trata-se de água apirogênica reagente para LAL, sem nenhuma contaminação.

(c) Controle positivo da amostra

Em um tubo de ensaio apirogênico, foram transferidos 1 mL de endotoxina com concentração igual a 0,5 EU/mL e 1mL da amostra, obtendo-se uma concentração de endotoxina igual a 0,25 EU/mL.

(d) Controle negativo da amostra

O controle negativo da amostra trata-se do LAL ressuspendido.

(e) Amostra

Em um tubo de ensaio apirogênico, foram colocados 100µL do reagente LAL ressuspendido e 100µL da amostra.

Procedimento

LAL. Uma alíquota de 100µL das soluções contendo endotoxina bacteriana foi misturada com 100µL de LAL em tubos apirogênicos (10 mm x 75 mm) e incubados a 37 ± 1ºC por 1 hora em banho-maria, evitando vibrações. Após este período, os tubos foram retirados, girando 180 graus e verificou-se a integridade do gel. A unidade do ensaio de endotoxinas bacterianas é expressa em Unidade de Endotoxinas por mililitro (EU/mL). A especificação para o ensaio de Endotoxinas Bacterianas para soluções de cloreto de sódio 0,9% (m/v) é de valores não superiores a 0,5 EU/mL (UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION, 2010).

4.2.2 Estudo II – Caracterização das soluções segundo recomendações de