Determinação do estresse oxidativo celular

Para determinação do estresse oxidativo celular foram utilizadas as células mononucleares obtidas previamente. A seguir, foram realizados teste Mitosox Red e quantificação da glutationa total.

3.10.2.1. Mitosox Red

A produção de O2●- de origem mitocondrial foi medida usando o marcador MitoSox Red (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). As células mononucleares isoladas anteriormente foram adicionadas em meio RPMI 1640 (Invitrocell) juntamente com 5 mM de MitoSox Red e incubadas em 37ºC em incubadora de CO2 durante 10 minutos. O sinal de fluorescência emitido pelo MitoSox Red oxidado foi detectado por citometria de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), equipado com laser de argônio e software CellQuest (v. 4.1) com comprimento de onda de excitação e emissão de 488 nm e

620 nm, respectivamente. Foi coletado um mínimo de 10.000 eventos (99). MitoSox Red é o nome comercial dado ao composto Hidroetidina (HE) conjugado a um grupamento trifenilfosfonio (evidenciado pelo círculo vermelho na Figura 5). A ligação da porção trifenilfosfonio ao HE aumenta o acúmulo deste marcador na mitocôndria, e faz com que assim que o O2●– seja produzido, reaja com o MitoSox Red, dando origem ao 2-hidroxietídio (2-OH-E+) (também conjugado ao grupamento trifenilfosfonio). O 2-OH-E+ é um composto vermelho altamente fluorescente capaz de ser detectado por citometria de fluxo (100).

Figura 5. Reação do MitoSox Red com o radical ânion superóxido formando

2-hidroxietídio. Legenda: HE= hidroetidina; 2-OH-E+= 2-hidroxietídio; O2●– = radical ânion superóxido, círculo vermelho: grupamento trifenilfosfônio.

Os resultados são apresentados em histogramas e gráficos de pontos gerados pelo software (Figura 6). Os gráficos de pontos mostram a identificação das populações celulares quanto ao tamanho (eixo X) e granulosidade (eixo Y) (gráficos à esquerda na figura). Nestes gráficos são selecionados o gate (G) que define a população de linfócitos de acordo com as suas características morfológicas, representados pelos círculos vermelhos na figura. As células selecionadas no gate tem sua fluorescência apresentada nos histogramas (gráficos à direita na figura) e o próprio software já fornece a fluorescência média das células

selecionadas. Quanto maior a média de fluorescência apresentada, maior a produção de O2● – pelas mitocôndrias dos linfócitos do paciente.

Figura 6. Figuras representativas de gráficos obtidos por meio do teste Mitosox

Red. Legenda: Resultado de um paciente específico (A) antes e (B) após primeiro ciclo de quimioterapia com sorafenibe; G = gate (círculo vermelho); FSC = Forward

Scatter (tamanho relativo da célula); SSC = Side Scatter (granulosidade da célula);

3.10.2.2. Quantificação de glutationa total

A quantidade de glutationa total [glutationa reduzida (GSH) e glutationa oxidada (GSSG)] foi avaliada por meio de método colorimétrico enzimático de reciclagem, utilizando kit comercial (Cayman Chemical, cat nº 703002).

Após a realização do teste MitoSox Red, as células restantes foram transferidas para tubo eppendorf de 1,5 mL e centrifugadas em 2.000 g, 4°C durante 10 minutos. Após a centrifugação o PBS foi retirado e o “pellet” de células ressuspendido em 250 µL de tampão contendo 50 mM de MES pH 6-7 (Sigma, cat nº M8250) e 1 mM de EDTA (Fisher Scientific, cat 17892). Em seguida, as amostras foram sonicadas (Sonicator 3000, Misonix, New Highway, NY, USA) por 45 s (3 ciclos de 15 s com intervalo de repouso de 10 s entre eles), com potência (power

setting) entre 0,5 e 1. Logo após, as amostras foram homogeneizadas em vórtex e

a concentração de proteína total foi medida utilizando o método colorimétrico de Bradford (Sigma, cat nº B6916; Bradford, 1976). Após a quantificação das proteínas, as amostras foram centrifugadas a 10.000 g, 4ºC por 15 minutos, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e o pellet, descartado. O sobrenadante foi submetido à desproteinização, utilizando-se igual volume de ácido metafosfórico 10% (Sigma, cat nº 239275). As amostras foram agitadas em vórtex e incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foi realizada a centrifugação (2.500 g, 5 minutos) e o sobrenadante foi coletado e armazenado a -80ºC para medição da glutationa total. Imediatamente antes desta medição, foi adicionado trietanolamina 4 M ((d 1.120) P.A. –SYNTH) às amostras (50 µL por mL de amostra). A adição de trietanolamina eleva o pH da amostra, permitindo a atividade das enzimas envolvidas no processo de reciclagem.

O ensaio colorimétrico enzimático é baseado na reação da glutationa com o ácido 5,5’-ditiobis-2nitrobenzoico (composto DTNB ou reagente de Ellman), produzindo ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (cromóforo amarelo TNB, com máxima absorbância a 412 nm) e o complexo glutationa oxidadaTNB (GSTNB). O complexo GSTNB é reduzido continuamente pela enzima glutationa redutase (GR) em presença de fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADPH), formando novamente a GSH. A taxa de formação do TNB, medida em 405 – 414 nm, é proporcional à quantidade de glutationa na amostra. Uma vez que a GR reduz a GSSG formada produzindo 2 GSH, a quantidade de glutationa medida neste protocolo reflete os níveis de glutationa total na amostra (Figura 7). O aumento linear da absorbância a 405 nm em função do tempo foi aferido usando leitora de placa (PowerWave XS 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

As reações de concentrações conhecidas de glutationa e dos grupos experimentais foram monitoradas minuto a minuto por meia hora gerando uma reta cuja inclinação é denominada i-slope. Foi construída uma curva padrão com as concentrações conhecidas de glutationa, na qual os valores em µM foram representados no eixo X e o i-slope de cada concentração conhecida no eixo Y, gerando uma reta em que a inclinação é denominada f-slope. Para o cálculo de glutationa total das amostras, utilizou-se o valor do i-slope das amostras, tomando- se por base a curva padrão acima mencionada. Os resultados foram multiplicados por 2 para compensar a diluição da amostra pelo ácido metafosfórico. Resumindo, o cálculo de concentração de glutationa total pode ser representado pela fórmula abaixo:

Onde Y-intercept é o valor em que o i-slope da concentração 0 da curva padrão intercepta o eixo Y. Os valores de concentração obtidos em µM foram divididos pela concentração de proteína total na amostra (mg/mL) e, então, foi obtido o valor correspondente à quantidade de glutationa total, a qual foi expressa em nmol de glutationa por mg de proteína.

Figura 7. Reações químicas que ocorrem durante o método enzimático para

quantificação da glutationa total. (Cayman Chemical,

http://www.caymanchem.com/pdfs/703002.pdf). Legenda: GSSH = glutationa oxidada; GSH = glutationa reduzida; TNB = 5-tio-2-nitrobenzoico; GSTNB = complexo glutationa oxidadaTNB; DTNB = 5,5’ditiobis-2nitrobenzoico.