Determinação do número de células em biofilme

Observou-se que células de L. monocytogenes 747 (Figura 16) em cultura simples foram capazes de aderir (4 ºC) e formar biofilme, a 25 ºC e 37 ºC, em aço inoxidável austenítico AISI 304, acabamento no 4. Embora a temperatura ótima de

multplicação celular ser entre a faixa de 30 ºC a 37 ºC (PETRAN; ZOTTOLA, 1989), a maior contagem de células viáveis desta estirpe foi observada a 25 ºC (7,60 log CFU.cm-2) (p < 0,05). Entretanto, verificou-se que considerável número de células foi capaz de aderir e multiplicar em aço a 4 ºC (3,31 log CFU.cm-2).

Verificou-se nas Figuras 16 e 17 diferença (p < 0,05) no número de células viáveis em biofilme de P. fluorescens ATCC 27663, quando em cultura simples, nas diferentes temperaturas testadas, com variação nas contagens variaram de 7,26 log CFU.cm-2 (25 ºC) a 5,26 log CFU.cm-2 (37 ºC). Embora a temperatura ótima de multiplicação para este micro-organismo seja próxima de 25 ºC, o número de células viáveis não diferiu (p > 0,05) a 25 ºC e a 4 ºC (7,00 log CFU.cm-2).

Figura 16 - Logarítmo do número de células viáveis de L. monocytogenes 747 e de

P. fluorescens ATCC 27663 em biofilmes (CFU) em aço inoxidável

austenítico AISI 304, acabamento no 4, em diferentes temperaturas.

Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p > 0,05).

Apesar de L. monocytogenes 994 ser diferente de L. monocytogenes 774, os números de células viáveis dessas estirpes em biofilme foram semelhantes para as diferentes temperaturas. As médias das contagens foram de 4,15 log CFU.cm-2, a 4 ºC, 7,45 log CFU.cm-2, a 25 ºC, e 7,23 og CFU.cm-2, a 37 ºC, portanto, houve

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 4 25 37 L o g C F U .c m -2 Temperatura (ºC)

L. monocytogenes 747- Cultura Simples P. fluorescens ATCC 27663- Cultura Simples L. monocytogenes 747- Cultura Mista P. fluorescens ATCC 27663 - Cultura Mista

a _b b b c cd h g de f e f

diferença significativa (p < 0,05) entre os valores de maior média em relação à menor média (Figura 17).

Figura 17 - Logarítmo do número de células viáveis de L. monocytogenes 994 e de

P. fluorescens ATCC 27663 em biofilmes (CFU) em aço inoxidável

austenítico AISI 304, acabamento no 4, em diferentes temperaturas.

Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p > 0,05).

Os resultados acima discutidos diferem daqueles relatados por Herald e Zottola (1988) ao referirem que L. monocytogenes cultivada em laboratório em cultura simples, em meios de cultivo como TSB e BHI, não apresentaram alto potencial de formação de biofilmes e, em geral, não formam microcolônias em superfícies utilizadas para o processamento de alimentos, como aço inoxidável.

Entretanto, no presente trabalho, como em outros estudos (MAFU et al., 1990, 1991; HELKE; WONG, 1994; SMOOT; PIERSON, 1998; NORWOOD; GILMOUR, 1999; BERESFORD et al., 2001; SILVA et al., 2008; RODRIGUES, 2010), L.

monocytogenes aderiu e formou biofilme em diferentes materiais e condições de

multiplicação (atividade de água [aw], temperatura e pH), até mesmo em temperatura de refrigeração, em condições laboratoriais quando em cultura simples.

Esta capacidade de sobrevivência e multiplicação a baixas temperaturas pode ser relacionada com mudanças na fluidez da membrana celular. De acordo com

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 4 25 37 L o g C F U .c m -2 Temperatura (ºC)

L. monocytogenes 994 - Cultura Simples P. fluorescens ATCC 27663- Cultura Simples L. monocytogenes 994 - Cultura Mista P. fluorescens ATCC 27663 - Cultura Mista

f g b cd a _ab cd c ab e d e

Gandhi e Chikindas (2007), estas mudanças ocorrem no aumento do grau de insaturação, na redução do número de carbonos (de C17:0 para C15:0) e isomeria da cadeia principal. Possivelmente, estas modificações na membrana também causem diferenças na sua hidrofobicidade.

Segundo Mai e Conner (2007), a hidrofobicidade celular está relacionada com a temperatura, sendo que o estresse causado pela sua modificação possivelmente alterou a hidrofobicidade em células de L. monocytogenes. Esta explicação pode ser uma possível justificativa para a diferença (p < 0,05) na contagem de células aderidas ou em biofilme, afinal as bactérias podem ter apresentado modificação na hidrofobicidade nas diferentes temperaturas (Tabela 7).

L. monocytogenes pode aderir rapidamente e firmemente a superfícies inertes

utilizadas na indústria de alimentos e sabe-se que esta bactéria apresenta mecanismos de proteção contra estresse físico e químico quando aderida ou quando em biofilme. Além disso, observa-se que diferentes estirpes apresentam diferentes capacidades de adesão e formação de biofilme (HARVEY et al., 2007).

Rodrigues (2010), ao estudar a formação de biofilmes de L. monocytogenes 747 e 994 em diferentes tempo (12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h) e temperatura de multiplicação (4 ºC, 25 ºC, 37 ºC), também observou diferença de contagem celular (p < 0,05). Os seus resultados apontaram aumento de biomassa (medida por densidade ótica) em maiores temperaturas. Mai e Conner (2007), após cultivarem células de L. monocytogenes ATCC 19.111 em BHI ou em um meio mínimo (10% de um filtrado de água de lagoa; 90% água destilada esterilizada), relataram que a adesão bacteriana foi favorecida não somente pelo aumento de temperatura como pelo meio de cultivo enriquecido (BHI). Ambos os estudos corroboram com os resultados da presente pesquisa.

Ao contrário do que foi observado para as estirpes de L. monocytogenes, a adesão de células viáveis de P. fluorescens, em cultura simples não foi favorecida pelo aumento de temperatura (Figuras 16 e 17).

A adesão das estirpes de L. monocytogenes e P. fluorescens em aço inoxidável em diferentes condições de temperaturas confirmou a previsão teórica calculada por meio da variação de energia de interação total de um processo termodinamicamente favorável (∆Gadesão < 0).

O número de células aderidas, após 72 h de incubação, de L. monocytogenes e de P. fluorescens foi menor quando cultivadas em cultura mista, comparado aos resultados quando em cultura pura (p < 0,05) (Figuras 16 e 17).

A 4 ºC não foi observada a formação de colônias em placa por nenhuma das estirpes de L. monocytogenes, entretanto houve uma contagem de 6,30 log CFU.cm- 2

para P. fluorescens (p < 0,05) (Figuras 16 e 17). Já a 37 ºC, maiores valores de contagens foram constatados para as estirpes de L. monocytogenes que atingiu 6,06 log CFU.cm-2. Por fim, a 25 ºC, P. fluorecens apresentou-se em maior número que L.

monocytogenes 747 (p < 0,05), mas igualmente aderida (p > 0.05) quando em

cultura mista com L. monocytogenes 994. Estes resultados podem contradizer ou confirmar relatos da literatura, uma vez que trabalhos afirmam que a presença de células de P. fluorescens favorecem a adesão de L. monocytogenes (MARSHALL; SCHMIDT, 1988; FARRAG; MARTH, 1989b; MARSHALL et al., 1992; GUÐBJÖRNSDÓTTIR et al., 2005); ou inibem (FARRAG; MARTH, 1989a; FREEDMAN et al., 1989; CHENG et al. 1995; BUCHANAN; BAGI, 1999; GUÐBJÖRNSDÓTTIR et al., 2005); ou, ainda, não apresentam nenhum efeito (FARRAG; MARTH, 1989c; MARSHALL et al., 1992; GUÐBJÖRNSDÓTTIR et al., 2005), ressaltando-se que as condições de multiplicação bacteriana favorecem as três possibilidades (GUÐBJÖRNSDÓTTIR et al., 2005).

Segundo Guðbjörnsdóttir et al. (2005), a inibição da adesão de L.

monocytogenes, em geral, está associada a baixas temperaturas (4 ºC) e

concentrações de cloreto de sódio (NaCl; 5 g.L-1 a 25 g.L-1) durante incubação. Além disso, estes pesquisadores relataram que a síntese de sideróforos por P.

fluorescens, ou algum outro mecanismo, aumentou a aquisição de ferro por este

micro-organismo e, portanto, originou uma competição por micronutrientes com L.

monocytogenes. Esta pode ser uma possível explicação para a inibição de L. monocytogenes, a 4 oC, quando aderida em cupons de aço inoxidável em cultura mista com P. fluorescens (Figura 16 e 17).