Determinação do Perfil Hormonal

As análises de adiponectina, grelina e leptina séricas, assim como de insulina plasmática foram realizadas utilizando-se os seguintes kits de método imunoenzimático (ELISA): EZRADP-62K, EZGAC-86K, EZRL-83K e EZRMI-13K, respectivamente, provenientes do Laboratório Linco Research. Neste método de detecção imunológica, anticorpos específicos ligam-se a enzimas, que por sua vez, unem-se a antígenos, os quais são detectados quantitativa e qualitativamente por meio de uma reação colorimétrica.

3.7.5.1 Adiponectina Sérica

Na determinação da adiponectina sérica, primeiramente todos os reagentes foram deixados em repouso até atingirem temperatura ambiente. Em seguida, a solução

Assay Buffer foi diluída 10 vezes utilizando água deionizada. Para a realização do kit, a

amostra foi inicialmente diluída 500 vezes utilizando-se o Assay Buffer, preparado anteriormente. Posteriormente, a solução Wash Buffer foi diluída 10 vezes com água deionizada. Os pocinhos foram então lavados 3 vezes com 300 µL de solução Wash

Buffer diluída. Foram adicionados 100 µL e 80 µL de Assay Running Buffer nos pocinhos

referentes ao Branco e nos demais, respectivamente. Em duplicata, foram adicionados 20 µL de Padrão de Adiponectina para Ratos preparados anteriormente em concentrações ascendentes, Controle 1 e 2 e as amostras de soro. A placa foi coberta e

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incubada por 2 horas a temperatura ambiente sob agitação. Em seguida, a mesma foi novamente lavada 3 vezes com 300 µL de solução Wash Buffer. Foram acrescentados 100 µL da solução Detection Antibody, a placa foi novamente incubada a temperatura ambiente sob agitação por 1 hora e em seguida lavada 3 vezes com 300 µL de Wash

Buffer. Na etapa seguinte, foram adicionados 100 µL de Enzyme Solution e a placa

incubada por 30 minutos sob agitação a temperatura ambiente. Foram realizadas 3 novas lavagens com 300 µL de Wash Buffer. Em seguida, 100 µL de Substrate foram adicionados em todos os pocinhos e a placa incubada por 20 minutos a temperatura ambiente sob agitação. Ao final, 100 µL de Stop Solution foram adicionados e a leitura realizada no comprimento de onda de 450 nm e 590 nm em equipamento Tunable

Microplate Reader VERSAmax, Molecular Devices. Os valores obtidos foram então

comparados a uma curva padrão e os resultados expressos em ng de adiponectina/mL de soro.

3.7.5.2 Grelina Sérica

Para a determinação da grelina sérica, os reagentes repousaram até atingirem temperatura ambiente. Em seguida, a solução HRP Wash Buffer foi diluída 10 vezes utilizando água deionizada. Inicialmente, todos os pocinhos foram lavados 3 vezes com 300 µL de solução HRP Wash Buffer diluída. Foram adicionados 20 µL de Solução Matriz nos pocinhos referentes ao Branco, Padrões e Controles. Na etapa seguinte, foram acrescentados 30 µL de solução Assay Buffer nos pocinhos referentes ao Branco e amostras e 10 µL, nos pocinhos da Curva padrão e Controles 1 e 2. Posteriormente,

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foram adicionados 20 µL das concentrações crescentes da Curva Padrão, dos Controles 1 e 2 e das amostras de soro. Em seguida, acrescentou-se 50 µL de Detection Antibody em todos os pocinhos e a placa foi incubada sob agitação a temperatura ambiente por 2 horas. Novamente a placa foi lavada por 3 vezes com 300 µL de Wash Buffer. Na etapa

seguinte, foram adicionados 100 µL de Enzyme Solution e a placa incubada por 30 minutos sob agitação a temperatura ambiente. Foram realizadas 3 novas lavagens

com 300 µL de Wash Buffer. Em seguida, 100 µL de Substrate foram adicionados em todos os pocinhos e a placa incubada por 15 minutos a temperatura ambiente sob agitação. Ao final, 100 µL de Stop Solution foram adicionados e a leitura realizada no comprimento de onda de 450 nm e 590 nm em equipamento Tunable Microplate Reader

VERSAmax, Molecular Devices. Os valores obtidos foram então comparados a uma curva

padrão e os resultados expressos em ng de grelina/mL de soro.

3.7.5.3 Leptina Sérica

Na determinação da leptina sérica os reagentes ficaram em repouso até atingirem temperatura ambiente. Em seguida, a solução HRP Wash Buffer foi diluída 10 vezes utilizando água deionizada. Inicialmente, todos os pocinhos foram lavados 3 vezes com 300 µL de solução Wash Buffer diluída. Foram acrescentados 30 µL de

Assay Buffer nos pocinhos referentes a Curva Padrão e aos Controles, e 40 µL da mesma

solução nos pocinhos referentes ao Branco e as amostras. Em seguida, foram acrescentados 10 µL da Solução Matriz nos pocinhos Branco, Curva Padrão e Controles 1 e 2. Na etapa seguinte, foram acrescentados 10 µL de soluções com concentrações

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crescentes dos Padrões e dos Controles 1 e 2. Também foram adicionados 10 µL de amostras de plasma em duplicata nos respectivos pocinhos. Na etapa seguinte, foram acrescentados 80 µL de Detection Antibody em todos os pocinhos e a placa foi incubada sob agitação a temperatura ambiente por 2 horas. Novamente a placa foi lavada por 3 vezes com 300 µL de Wash Buffer. Posteriormente, foram adicionados 100 µL de

Enzyme Solution e a placa incubada por 30 minutos sob agitação a temperatura

ambiente. Foram realizadas 3 novas lavagens com 300 µL de Wash Buffer. Em seguida, 100 µL de Substrate foram adicionados em todos os pocinhos e a placa incubada por 15 minutos a temperatura ambiente sob agitação. Ao final, 100 µL de Stop Solution foram adicionados e a leitura realizada no comprimento de onda de 450 nm e 590 nm em equipamento Tunable Microplate Reader VERSAmax, Molecular Devices. Os valores obtidos foram então comparados a uma curva padrão e os resultados expressos em ng de leptina/mL de soro.

3.7.5.4 Insulina Plasmática

Na determinação da insulina plasmática, os reagentes permaneceram em repouso até atingirem temperatura ambiente. Em seguida, a solução Wash Buffer foi diluída 10 vezes utilizando água deionizada. Inicialmente, todos os pocinhos foram lavados 3 vezes com 300 µL de solução Wash Buffer diluída. Foram acrescentados 10 µL de Assay Buffer nos pocinhos referentes ao Branco e as amostras. Em seguida, foram acrescentados 10 µL de soluções com concentrações ascendentes dos Padrões e os Controles 1 e 2. Também foram adicionados 10 µL de amostras de plasma em duplicata

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nos respectivos pocinhos. Na etapa seguinte, foram acrescentados 80 µL de Detection

Antibody em todos os pocinhos e a placa foi incubada sob agitação a temperatura

ambiente por 2 horas. Novamente a placa foi lavada por 3 vezes com 300 µL de Wash

Buffer. Posteriormente, foram adicionados 100 µL de Enzyme Solution e a placa incubada

por 30 minutos sob agitação a temperatura ambiente. Foram realizadas 3 novas lavagens com 300 µL de Wash Buffer. Em seguida, 100 µL de Substrate foram adicionados em todos os pocinhos e a placa incubada por 15 minutos a temperatura ambiente sob agitação. Ao final, 100 µL de Stop Solution foram adicionados e a leitura realizada no comprimento de onda de 450 nm e 590 nm em equipamento Tunable Microplate Reader

VERSAmax, Molecular Devices. Os valores obtidos foram então comparados a uma curva

padrão e os resultados expressos em ng de insulina/mL de plasma.

3.7.6 Determinação da Expressão Gênica das Enzimas Carnitina Palmitoil