Determinação do teor de micofenolato de mofetila por espectrofotometria no ultravioleta

A determinação do teor de MMF em comprimidos por espectrofotometria no ultravioleta foi realizada conforme o método proposto por Verma et al. (2008). Utilizou-se HCl 0,1 mol/l como solvente e λ 250 nm.

5.3.5.1 Seletividade

A seletividade do método de doseamento de MMF em comprimidos por espectrofotometria no ultravioleta foi avaliada em relação aos principais excipientes. Preparou-se o placebo a partir da mistura homogênea dos componentes da formulação simulada (Tabela 12), na ausência do princípio ativo. As quantidades de excipiente presentes na formulação simulada foram definidas com base nas especificações porcentuais descritas por Kibbe (2000).

Tabela 12 - Formulação simulada para comprimidos de micofenolato de mofetila.

Componente % MMF 60,0 Celulose microcristalina 30,0 Croscarmelose sódica 4,0 Estearato de magnésio 1,0 Povidona K-90 1,5 Hidroxipropilmetilcelulose 2,3 Dióxido de titânio 1,0

Laca de indigo carmim 0,1

Óxido de ferro amarelo 0,1

Cerca de 12,5 mg do placebo foram transferidos para balão volumétrico de 25 ml com auxílio de 15 ml de HCl 0,1 mol/l. Deixou-se em ultrassom durante 5 minutos e completou-se o volume com o mesmo solvente. Após filtração, transferiram-se 5,0 ml para balão volumétrico de 100 ml e completou-se o volume com HCl 0,1 mol/l.

Preparou-se uma solução de MMF padrão de trabalho a 25 µg/ml nas mesmas condições. O espectro da solução do placebo na faixa λ 200 a 400 nm foi sobreposto

ao espectro da solução de MMF. A presença de interferentes não deve alterar o resultado final em mais de 0,5% (GREEN, 1996).

5.3.5.2 Linearidade

Preparou-se uma solução estoque a 1,0 mg/ml de MMF padrão de trabalho em HCl 0,1 mol/l. Transferiram-se alíquotas adequadas da solução estoque para balões volumétricos de 50 ml, de modo a obter concentrações de 20% a 200% da concentração de trabalho (25 µg/ml), conforme apresentado na Tabela 13. O procedimento foi realizado em triplicata para cada nível de concentração.

Traçou-se a curva analítica e calculou-se a equação de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados ordinários. Avaliaram-se os parâmetros de normalidade, independência e homoscedasticidade dos resíduos, o coeficiente de correlação, o intercepto da curva e o ajuste dos dados ao modelo de regressão linear, conforme seção 5.1.5.3.

Tabela 13 - Preparo das soluções de micofenolato de mofetila para avaliação da linearidade do

método de doseamento por espectrofotometria no ultravioleta.

Nível (%) Volume da solução estoque (ml) HCl 0,1 mol/l q.s.p. (ml) Concentração (µg/ml) 20 0,25 50 5 40 0,50 50 10 60 0,75 50 15 80 1,00 50 20 100 1,25 50 25 120 1,50 50 30 140 1,75 50 35 160 2,00 50 40 180 2,25 50 45 200 2,50 50 50 5.3.5.3 Exatidão

A exatidão do método foi avaliada pelo método de contaminação do placebo em um dia de análise e determinada em triplicata em três níveis de concentração (INTERNATIONAL..., 2005; ASOCIACIÓN..., 2001). Quantidades conhecidas de

MMF foram incorporadas ao placebo de modo a obter soluções com concentrações equivalentes a 70%, 100% e 130% da concentração de trabalho.

Preparou-se uma solução estoque de MMF padrão de trabalho 2,5 mg/ml em HCl 0,1 mol/l. Transferiram-se alíquotas da solução estoque para balões volumétricos de 25 ml contendo cerca de 12,5 mg do placebo, conforme apresentado na Tabela 14. Adicionaram-se 15 ml de HCl 0,1 mol/l e deixou-se em ultrassom por 5 minutos. Completou-se o volume com o mesmo solvente. Após filtração, transferiram-se 2,5 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com HCl 0,1 mol/l. Preparou-se solução padrão de MMF a 25 g/ml nas mesmas condições.

Tabela 14 - Preparo das soluções de placebo contaminado para avaliação da exatidão do método de

doseamento de micofenolato de mofetila em comprimidos por espectrofotometria no ultravioleta.

Nível (%) Quantidade do placebo (mg) Volume da solução estoque (ml) Concentração após diluição (µg/ml) 70 12,5 1,75 17,5 100 12,5 2,50 25,0 130 12,5 3,25 32,5

A porcentagem de recuperação foi calculada pela relação entre a concentração determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, utilizando a equação (7).

% Recuperação = Concentração experimental x 100 (7) Concentração teórica

Aplicou-se a estatística t (α = 0,05) para verificar a existência de diferença significativa entre a recuperação média e o valor teórico de 100%, conforme Equação (4) (seção 5.1.5.4 ).

5.3.5.4 Precisão

Realizaram-se seis determinações do teor de MMF em CellCept® em três dias de análises com analistas diferentes (n = 18). A repetitividade e a precisão intermediária foram avaliadas como descrito na seção 5.1.4.1.

Solução amostra: os comprimidos utilizados na determinação de peso foram

pulverizados até a obtenção de pó fino e homogêneo. Transferiram-se quantidade do pó equivalente a 50 mg de MMF para balão volumétrico de 100 ml com auxílio de 50 ml de HCl 0,1 mol/l. Deixou-se em ultrassom durante 5 minutos. Em seguida, completou-se o volume com o mesmo solvente e filtrou-se utilizando papel de filtro. Transferiram-se 5 ml para balão volumétrico de 100 ml e completou-se o volume com HCl 0,1 mol/l.

Solução padrão: transferiram-se, exatamente, cerca de 12,5 mg de MMF padrão de

trabalho para balão volumétrico de 50 ml. Dissolveu-se e completou-se o volume com HCl 0,1 mol/l. Transferiram-se 5 ml para balão volumétrico de 50 ml e completou-se o volume com o mesmo solvente.

5.3.5.5 Robustez

A robustez do método foi avaliada pelo doseamento de CellCept® utilizando equipamentos distintos. Realizaram-se seis determinações a 100% da concentração de trabalho, conforme descrito em 5.3.5.4. As leituras de absorvância foram medidas nos espectrofotômetros HP 8453 e Shimadzu UV-1800.

Os resultados obtidos nas duas condições foram comparados utilizando a estatística t para dados pareados (α = 0,05). O valor de t experimental foi calculado de acordo com a equação (8). experimental d

d n

=

S

t

d = diferença das médias entre os pares de valores; n = número de pares;

5.3.5.6 Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação foram estimados com base na inclinação e no desvio padrão do intercepto obtido na curva analítica, de acordo com as equações (5) e (6), respectivamente (seção 5.1.5.7).

5.3.6 Determinação do teor de micofenolato de mofetila por cromatografia