Determinação do teor de micofenolato de mofetila por cromatografia líquida de alta eficiência

As condições cromatográficas estabelecidas para a determinação do teor de MMF em comprimidos estão relacionadas na Tabela 15.

Tabela 15 - Condições cromatográficas estabelecidas para a determinação do teor de micofenolato

de mofetila em comprimidos.

Parâmetro Especificação

Coluna C8 250 x 4,0 mm; 5 m

Fase móvel Acetonitrila: TEA 1% (30:70)

Fluxo 1,5 ml/min

Temperatura do forno 45 ºC

Detecção UV/DAD 250 nm

Volume de injeção 25 l

Concentração de trabalho 50 g/ml MMF

5.3.6.1 Determinação das condições cromatográficas

A seleção das condições cromatográficas para doseamento de MMF em comprimidos foi realizada com base na revisão bibliográfica, nos parâmetros de conformidade do sistema descritos na Tabela 8 e na seletividade em relação ao placebo e produtos de degradação (seção 5.3.6.2). Utilizou-se coluna LiChrosper 100 (C8 250 x 4,0 mm; 5 µm) e detector ultravioleta λ 250 nm.

Inicialmente, determinou-se o comportamento da eluição de MMF e MPA frente às variações de pH da fase móvel. O estudo foi realizado conforme método cromatográfico descrito na Farmacopéia Européia (2007): fase móvel constituída por acetonitrila e TEA 0,3% V/V na proporção 35:65, fluxo 1,5 ml/min e temperatura do forno controlada em 45 ºC. O pH da solução de TEA foi ajustado com ácido fosfórico em intervalos de 0,5 compreendendo a faixa de 2,5 a 6,0. Injetaram-se, em cada

condição, 25 µl de uma solução de MMF 50 µg/ml e MPA 25 µg/ml em acetonitrila.

Avaliou-se o efeito da variação do pH sobre o tempo de retenção dos compostos.

Posteriormente, verificaram-se os parâmetros cromatográficos do pico de MMF em função da presença de TEA em diferentes concentrações na fase móvel. A composição da fase móvel foi 30% de acetonitrila com 70% de componente aquoso. Os componentes aquosos utilizados foram: tampão fosfato de amônio monobásico 25 mmol/l, TEA 0,3%, TEA 0,5%, TEA 0,7% e TEA 1,0%. Em todas as condições, o pH foi ajustado para 3,0 com ácido fosfórico.

5.3.6.2 Seletividade

A seletividade do método de doseamento de MMF em comprimidos por CLAE foi avaliada em relação ao placebo, conforme composição descrita na Tabela 12. Verificou-se também a capacidade do método em separar os produtos de degradação obtidos por exposição à temperatura, luz e umidade do ambiente e, também, hidrólise ácida.

A solução placebo foi obtida pela transferência de 12,5 mg do placebo para balão volumétrico de 25 ml com auxílio de 15 ml da fase móvel. Deixou-se em ultrassom durante 5 minutos e completou-se o volume com a fase móvel. Após filtração, transferiu-se 1,0 ml para balão volumétrico de 10 ml e completou-se o volume com a fase móvel. Preparou-se solução de MMF padrão de trabalho 50 µg/ml nas mesmas condições. O cromatograma do placebo foi comparado ao do padrão para verificar a existência de interferência dos excipientes.

Deixou-se o fármaco exposto à temperatura, luz e umidade do laboratório. Após 120 dias, avaliou-se o aspecto e preparou-se uma solução a 500 µg/ml na fase móvel para análise cromatográfica.

A hidrólise ácida foi realizada a partir de uma solução de MMF 500 µg/ml em HCl 0,1 mol/l sob refluxo durante 2 horas. Alíquotas nos tempos 0, 30, 60, 90 e 120 minutos de refluxo foram retiradas e diluídas 10 vezes na fase móvel antes de serem

injetadas no cromatógrafo. Avaliaram-se a resolução do pico de MMF em relação ao pico adjacente e a pureza cromatográfica com o auxílio do detector UV/DAD.

Procedeu-se também à hidrólise ácida de MPA. Preparou-se solução de MSD equivalente a 1 mg/ml de MPA em água. Transferiram-se 5 ml para balão volumétrico de 50 ml e completou-se o volume com HCl 0,1 mol/l. A solução ácida foi submetida ao refluxo durante 60 minutos. Em seguida, retirou-se alíquota e diluiu-se 10 vezes na fase móvel antes de injetar no cromatógrafo.

5.3.6.3 Linearidade

A curva analítica foi obtida na faixa 40% a 160% da concentração de trabalho e a linearidade avaliada conforme descrito na seção 5.1.5.3. As soluções foram preparadas como apresentado a seguir.

Preparou-se solução estoque de MMF padrão de trabalho 1,0 mg/ml em acetonitrila. Transferiram-se alíquotas adequadas da solução estoque para balões volumétricos de 25 ml e completou-se o volume com fase móvel, de modo a obter concentrações de 20 a 80 µg/ml (Tabela 16). O procedimento foi realizado em triplicata para cada nível de concentração.

Tabela 16 - Preparo das soluções de micofenolato de mofetila para avaliação da linearidade do

método por cromatografia líquida de alta eficiência.

Nível (%) Volume da solução estoque (ml) Fase móvel q.s.p. (ml) Concentração (µg/ml) 40 0,50 25 20 60 0,75 25 30 80 1,00 25 40 100 1,25 25 50 120 1,50 25 60 140 1,75 25 70 160 2,00 25 80 5.3.6.4 Exatidão

Procedeu-se a exatidão pelo método do placebo contaminado nos níveis de 70%, 100% e 130% da concentração de trabalho, como especificado na seção 5.3.5.3. A

solução estoque e as soluções contaminadas foram preparadas como descrito a seguir.

Preparou-se solução estoque de MMF padrão de trabalho 2,5 mg/ml em acetonitrila. Transferiram-se alíquotas da solução estoque para balões volumétricos de 25 ml contendo cerca de 12,5 mg de placebo, conforme apresentado na Tabela 17. Adicionaram-se 15 ml da fase móvel e deixou-se em ultrassom por 5 minutos. Completou-se o volume com a fase móvel. Após filtração, transferiram-se 2,0 ml para balão volumétrico de 10 ml e completou-se o volume com a fase móvel. Preparou-se solução padrão de MMF 50 g/ml nas mesmas condições.

Tabela 17 - Preparo das soluções de placebo contaminado para avaliação da exatidão do método de

doseamento de micofenolato de mofetila em comprimidos por cromatografia líquida de alta eficiência.

Nível (%) Quantidade de placebo (mg) Volume da solução estoque (ml) Concentração após diluição (µg/ml) 70 12,5 1,75 35,0 100 12,5 2,50 50,0 130 12,5 3,25 65,0 5.3.6.5 Precisão

Realizaram-se seis determinações em três dias de análises com analistas diferentes (n = 18). A repetitividade e a precisão intermediária foram avaliadas conforme seção

5.1.4.1. O preparo das soluções amostra e padrão estão descritos a seguir.

Solução amostra: os comprimidos utilizados na determinação de peso foram

pulverizados até a obtenção de pó fino e homogêneo. Transferiram-se quantidade do pó equivalente a 25 mg de MMF para balão volumétrico de 50 ml com auxílio de 30 ml de fase móvel. Deixou-se em ultrassom durante 10 minutos e completou-se o volume com o mesmo solvente. Após filtração, transferiram-se 2,5 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com a fase móvel.

Solução padrão: transferiram-se, exatamente, cerca de 12,5 mg de MMF SQR para

balão de 25 ml. Dissolveu-se e completou-se o volume com fase móvel. Transferiram-se 2,5 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com fase móvel.

A solução padrão foi injetada cinco vezes no cromatógrafo. O desvio padrão relativo entre as cinco injeções não deve ser superior a 1,0% (U.S. FOOD..., 1994).

5.3.6.6 Robustez

A robustez foi verificada mediante as variações dos seguintes parâmetros: pH da solução de TEA, temperatura do forno, fluxo da fase móvel e proporção de acetonitrila na fase móvel. Realizaram-se seis determinações a 100% da concentração de trabalho em cada condição apresentada na Tabela 18. As soluções amostra e padrão foram preparadas como descrito em 5.3.6.5. Os resultados foram comparados por Anova (α = 0,05).

Tabela 18 - Condições cromatográficas utilizadas para verificação da robustez do método de

doseamento de micofenolato de mofetila em comprimidos por cromatografia líquida de alta eficiência.

Parâmetros Nominal 1 2 3 4 5 6 7 8

pH TEA 3,0 3,2 2,8 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Fluxo (ml/min) 1,5 1,5 1,5 1,3 1,7 1,5 1,5 1,5 1,5

Temperatura (ºC) 45 45 45 45 45 50 40 45 45

% ACN 30 30 30 30 30 30 30 32 28

5.3.6.7 Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação foram estimados pela curva analítica e determinados pela relação entre sinal e ruído, de acordo com o especificado em

5.1.5.7.

5.3.6.8 Estabilidade em solução

Preparou-se uma solução de MMF padrão de trabalho 50 µg/ml em fase móvel. Injetou-se no cromatógrafo nos tempos 0, 4, 8 e 24 horas após o preparo. As variações das áreas não deverão ser superiores a ± 2% em relação à resposta inicial (GREEN, 1996).

5.3.7 Comparação entre os métodos de determinação de micofenolato de