No diagnóstico da doença de Gumboro, deve-se ter em consideração o historial do bando e das explorações, os sinais clínicos e as lesões provocadas. As aves com menos de 3 semanas, não apresentam sinais clínicos de doença, e aves com 3 a 6 semanas apresentam os sinais anteriormente descritos, sendo a severidade dos sinais dependente de vários fatores. A necrópsia é essencial para o diagnóstico, visualizando-se as lesões macroscópicas, principalmente alterações na bolsa de Fabricius. A colheita de órgãos para outros meios de diagnóstico pode auxiliar a um melhor diagnóstico, nomeadamente, em casos de doença subaguda (Van Der Berg et al., 2000).
2.7.1. Diagnóstico diferencial
O diagnóstico clínico da forma aguda da doença de Gumboro é baseado na evolução da doença, nomeadamente, na curva de mortalidade com um pico ao 4º dia e recuperação a partir do 5º dia, e a observação dos sinais clínicos e lesões post mortem especialmente na bolsa de Fabricius (Van Der Berg et al., 2000).
Em casos subagudos, pode ser necessário estabelecer alguns diagnósticos diferenciais, tais como, coccidiose aviária, forma visceral da doença de Newcastle, anemia infeciosa aviária, micotoxinas e forma nefrogénica de bronquite infeciosa, assim como, doença de Marek (Van Der Berg et al., 2000).
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2.7.2. Diagnóstico histológico
O diagnóstico histológico pode ser necessário para diagnosticar formas subclínicas da doença de Gumboro. As alterações anteriormente descritas na bolsa de Fabricius confirmam o diagnóstico, assim como, as alterações no timo e baço, além de que, a associação das alterações provocadas nestes 2 últimos órgãos possam sugerir a identificação da virulência das estirpes do vírus (Van Der Berg et al., 2000).
2.7.3. Diagnóstico serológico
Os testes serológicos normalmente utilizados para deteção do vírus da doença de Gumboro são: a técnica de ELISA (ensaio imunoenzimático), neutralização de vírus (VN) e AGID (imunodifusão em gel de agar).
A AGID é útil para uma deteção rápida de antigénios solúveis de grupo específico, ou anticorpos em aves convalescentes, mas apresenta baixa sensibilidade. A não quantificação e a incapacidade de detetar as diferenças serotípicas tornam o seu uso limitado (Phillips, 1981; Nicholas et al., 1985; Raj et al., 1995).
A técnica de ELISA é o teste serológico mais utilizado para deteção de anticorpos do vírus da doença de Gumboro por ser económico, simples, rápido e permitir o processamento de um grande número de amostras ao mesmo tempo sendo passível de automatização (Ashraf, 2005). A técnica de ELISA permite quantificar o título de anticorpos para a doença de Gumboro, sendo útil para monitorizar o estado imunitário dos bandos, comprovar a eficácia da vacinação e prever a diminuição do título de anticorpos maternos (Ashraf, 2005). Existem vários kits de ELISA disponíveis no mercado para a deteção de anticorpos no soro. As infeções subclínicas e qualquer surto da doença nas grandes unidades de produção de aves pode ter um impacto económico significativo, por isso, os bandos são monitorizados regularmente para qualquer alteração no título na linha de base (Ashraf, 2005
)
.Os kits comerciais de ELISA não permitem diferenciar os anticorpos específicos dos 2 serótipos do vírus da doença de Gumboro, assim como, não permitem diferenciar as várias estirpes do serótipo patogénico (Ismail e Saif, 1990; Jackwood et al., 1996). Devido a este facto, é necessário especial atenção à monitorização do título de anticorpos em reprodutoras, pois o serótipo 2 apatogénico está disseminado mundialmente, fornecendo uma ideia errada dos níveis de anticorpos dos bandos (Ashraf, 2005
).
De Wit et al. (2001) compararam 5 kits comerciais de ELISA, entre estes BioChek standard® (BioCheck CV., Gouda, The Netherlands), IDEXX Flock check standard®, IDEXX- XR Flock check® (IDEXX Corp., Portland, Maine), KPL Proflock e KPL Proflock Plus® (Kirkegaard and Perry Labs.,Gaithersburg, Md.) e comprovaram que a especificidade dos testes variava entre 63,8 a 100%. Todos os kits apresentaram sensibilidade de 100% entre os
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dias 14 e 21 após a vacinação com 2 estirpes clássicas e para a estirpe Delawere variante-E. Todos os kits de ELISA e a neutralização de vírus (VN) demonstraram correlação positiva na medição do decréscimo de anticorpos maternos (De Wit et al., 2001).
Vários estudos foram efetuados para comprovar a possibilidade da utilização de gema de ovo para determinar o título de anticorpos por ELISA dos bandos, em vez de soro. Silim e Venne (1989) demonstraram uma correlação positiva entre os títulos de anticorpos do soro de reprodutoras e da gema de ovos em vários vírus, incluído o vírus da doença de Gumboro (Silim e Venne, 1989). No entanto, Keck et al. (1993) demonstraram que os títulos de anticorpos por ELISA na gema, podem ser inferiores aos encontrados no soro, questionando a sua utilização na determinação do título de anticorpos (Keck et al., 1993). Boudaoud e Mamache (2012) demonstraram que os títulos de anticorpo no soro de pintos do dia e gemas de ovos pré incubáveis obtidos por ELISA, apresentaram títulos similares e estavam bem correlacionados com a estimativa da idade de vacinação (menos de um dia de diferença), indicando assim, a possibilidade de uso de gema de ovo para determinar a idade de vacinação (Boudaoud e Mamache, 2012). O uso de gema de ovo em vez de soro é vantajoso, pois a biossegurança não é comprometida e não é necessário sacrificar animais (Ashraf, 2005; Boudaoud e Mamache, 2012)
Diferentes tipos de procedimentos de ELISA estão descritos para deteção de antigénios virais da doença de Gumboro. A técnica de ELISA usa anticorpos monoclonais (AC-ELISA) para deteção e caracterização do vírus da doença de Gumboro, detetando antigénios na bolsa de Fabricius e baço 2 dias após a infeção (Lee, 1992). Os estudos comprovaram que a utilização de anticorpos policlonais no AC-ELISA aumenta a sensibilidade do teste em relação ao AC-ELISA monoclonal (Hassan et al., 1996). No entanto, o uso de anticorpos monoclonais permite uma maior precisão na caracterização do vírus capturado (Van Der Berg et al., 2000).
A VN era o método mais comummente utilizado antes do aparecimento da técnica de ELISA. É o único teste serológico que permite distinguir os dois serótipos, e também diferencia os anticorpos dos diferentes subtipos do vírus da doença de Gumboro (Ashraf, 2005).
2.7.4. Diagnostico virológico
O vírus da doença de Gumboro é geralmente isolado da bolsa de Fabricius na fase aguda da infeção, idealmente nos primeiros 3 dias após o aparecimento de sinais clínicos (Van Der Berg et al., 2000). Também se pode isolar o vírus em outros órgãos, como o timo, fígado e baço. Contudo, devido à replicação nestes órgãos ser menos intensa, o vírus encontra-se em menor quantidade (Ashraf, 2005).
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O isolamento do vírus é feito através da inoculação de uma amostra suspeita em ovos embrionados com 9 a 11 dias provenientes de galinhas livres de anticorpos para o vírus da doença de Gumboro (Van Der Berg et al., 2000). É inoculado um preparado homogeneizado de uma amostra de tecido, geralmente bolsa de Fabricius, contendo antibióticos e uma solução tampão, que é centrifugada para a remoção de partículas de grandes dimensões (Ashraf, 2005). A via corioalantóica é a mais sensível para o isolamento do vírus, embora sejam também praticáveis a via saco vitelino e a via intra-alantóica, sendo estas menos sensíveis (Van Der Berg et al., 2000). A estirpe clássica normalmente mata os embriões em 3 a 5 dias e produz congestão vascular e hemorragias subcutâneas nos embriões, enquanto a estirpe clássica não mata os embriões, mas provoca nanismo, descoloração, esplenomegalia e necrose hepática (Hitchner, 1970 e Lukert 2003 citados por Ashraf, 2005).
Para além de ovos embrionados também podem ser usados para propagação do vírus, as culturas de células de fibroblastos, células da bolsa e rins de embriões de galinhas, no entanto, certas estirpes não se adaptam ao crescimento por estes meios (Lee et al., 1994 citados por Ashraf, 2005).
O isolamento em ovos embrionados não requer adaptação do vírus por várias passagens, e é adequado para isolamento de estirpes hipervirulentas (Van Der Berg et al., 2000). Na ausência de lesões, os embriões da primeira passagem devem ser homogeneizados em condições estéreis, e clarificados em duas passagens adicionais (Van Der Berg et al., 2000).
2.7.5. Outras técnicas de diagnóstico
Outras técnicas podem ser utilizadas para a deteção de antigénios do vírus da doença de Gumboro, tais como, imunofluorescência direta e indireta ou coloração de imunoperoxidase nos folículos da bolsa entre o 4º e 6º dia após inoculação (Van Der Berg et al., 2000).
A transcrição reversa da reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) tem vindo a ser muito usada para deteção e diagnóstico de estirpes do vírus da doença de Gumboro. A RT- PCR permite a deteção de RNA viral em suspensões homogéneas de órgãos infetados, embriões, assim como, em cultura de células, independentemente da viabilidade do vírus (Van Der Berg et al., 2000). A escolha dos genes a amplificar vai depender do objetivo inicial. Se o objetivo for detetar um grande número de estirpes, são selecionados “primers” de zonas de grande preservação genómica. Se o objetivo for a identificação da estirpe, é escolhida, geralmente, a porção variável da VP2. Os fragmentos amplificados são posteriormente caracterizados por sequenciação direta e análise de código de sequenciação aminopeptídica (Liu et al., 1994; Tham et al., 1995).
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Estudos de eletroforese dos fragmentos amplificados após digestão por endonucleases de restrição permitem obter o perfil electroforético (Van Der Berg et al., 2000).