DIAGNÓSTICO

Sendo o diagnóstico clinico de difícil realização, a deteção da infeção é realizada através de métodos biológicos, serológicos ou histológicos (Dubey e Odening, 2001). Segundo Lopes (2011) o diagnóstico laboratorial da infeção pode ser feito de 3 maneiras.

a) Identificação do parasita em tecidos removidos por biópsia ou durante necropsia, ou em fluidos corporais e em esfregaços feitos por aposição de lesões (tecidos), usando técicas histopatológicas, imuno-histoquímicas ou moleculares de PCR; ou até mesmo por análise de fezes.

b) Isolamento do agente por bioensaio em animais de laboratório e cultivo in vitro (cultura de células) a partir de fluidos corporais, sangue ou de biópsia de tecidos e tecidos colhidos post mortem.

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6.1. DETEÇÃO DO AGENTE

6.1.1. Histopatologia e imuno-histoquimica

Pode ser realizada uma análise citológica obtendo-se para o efeito secreções, excreções ou fluidos corporais como o líquido cefalorraquidiano (LCR) e a lavagem bronco- alveolar ou transtraqueal (Dubey e Odening, 2001). Na análise histológica, a amostra é obtida por biopsia ou através da remoção post-mortem de tecidos com lesões macroscópicas (Dubey e Odening, 2001). Nestes casos, o isolamento do parasita é feito através da inoculação em animais de laboratório ou culturas de células, ou através da técnica imuno-histoquímica em que os anticorpos são conjugados com fluoresceína ou peroxidase (Dubey e Odening, 2001). Neste último caso, secções de tecido com 4 a 5 µm de espessura são cortados, desparafinizados em xileno e desidratados em etanol. Ocorre, assim, digestão pela pepsina. É necessário que as lâminas não estejam engorduradas e a adição cromo-gelatina na água de banho ajuda na aderência das secções às lâminas. Esta técnica pode ser usada para diferenciar os taquizoitos dos bradizoitos (Dubey, 2010).

6.1.2. Coprologia

Para o exame coprológico pode ser utilizado um método de flutuação, porém a probabilidade de se conseguir detetar oocistos é bastante reduzida. Várias razões explicam esta situação incluindo o facto de menos de 1% dos gatos se encontrarem a eliminar oocistos num dado momento (Dubey, 1986), e esta é efetuada apenas durante alguns dias a algumas semanas (Dubey e Beattie, 1988). Por outro lado, é difícil a visualização e identificação microscópica de oocistos devido ao seu reduzido tamanho e pela quantidade de detritos nas amostras fecais (Dubey e Beattie, 1988).

6.1.3. Reação em cadeia da polimerase

A reação em cadeia da polimerase (“polimerase chain reaction” – PCR) é uma técnica molecular bastante sensível, específica e de rápido diagnóstico (Dubey, 2010). Nesta técnica, é detetado o ADN do parasita mesmo quando este se encontra em pequenas quantidades, podendo ser usado para o efeito amostras de músculo cardíacos e esquelético, placenta,

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cordão umbilical e cérebro, entre outras. O uso da PCR em tempo real também quantifica o ADN do parasita e é considerado o mais adequado para as espécies animais (Dubey, 2010). Apesar de a deteção do ADN ser bastante específico, pode observar-se reações cruzadas na diferenciação de oocistos de T. gondii e Hammondia hammondi (Dubey, 2010).

6.1.4. Bioensaios

De modo a aumentar a sensibilidade e a especificidade destas técnicas, pode ser realizado o bioensaio em murganhos ou em gatos seronegativos, podendo a amostra ser submetida a uma digestão prévia com sucos gástricos (Hill e Dubey, 2002). Contudo, o número de quistos tecidulares na carne de animais contendo o parasita pode ser bastante baixo. Assim, um resultado negativo não significa necessariamente que todo o órgão ou tecido esteja livre do parasita (Hill e Dubey, 2002).

6.1.5. Ensaio in vitro (cultura de células)

T. gondii pode ser cultivado em animais de laboratório, embriões de galinhas e

culturas de células (Dubey, 2010). Apesar do bioensaio ser, atualmente, considerado o método de eleição para o isolamento de T.gondii de amostras biológicas, a ética é questionável além de que a inoculação em murganhos é dispendiosa e laboriosa (Cortes et al., 2011). Como alternativa temos, então, o ensaio in vitro utilizando culturas celulares. Contudo, o investimento nesta área é bastante reduzido não se encontrando muitos estudos com a utilização desta técnica (Cortes et al., 2011). Os taquizoítos multiplicam-se na maioria das linhagens celulares de mamíferos em culturas tecidulares (Dubey, 2010). Relativamente aos bradizoítos, a maioria das estirpes de T. gondii desenvolve espontaneamente quistos tecidulares nas culturas de células sem manipulação, porém o seu número é reduzido (Dubey, 2010).

6.2. PESQUISA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS

A pesquisa de anticorpos específicos é um dos métodos de diagnóstico mais utilizado. Vários testes serológicos têm vindo a ser utilizados incluindo o teste de lise de Sabin e

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Feldman (“dye test” - DT), o teste de hemaglutinação indireta (“indirect hemagglutination test” – IHAT), o IFAT, o MAT, o LAT e ELISA (Dubey e Odening, 2001). Estes testes variam quanto à sensibilidade, especificidade e valores preditivos (Dubey et al., 1995).

Segundo Lopes (2011), os títulos de anticorpos podem variar devido a fatores relacionados com o hospedeiro, com o parasita e com as características do teste usado. A determinação das IgG ou uma combinação de IgG/IgM são maioritariamente usados por aqueles que pretendem determinar a seroprevalência da infeção (Dubey e Thulliez, 1989). Para o diagnóstico de infeção aguda é necessário a detecção dos níveis séricos de IgM (Omata

et al., 1990). Já a pesquisa de títulos positivos de IgG, numa única amostra de soro, apenas

indica exposição, e não demonstra a presença de infecção activa ou recente (Lin, 1998). De entre os diferentes testes serológicos disponíveis, o MAT revelou ser um método simples de realizar, sensível e específico para o serodiagnóstico da infeção por T. gondii em animais silváticos (Gauss et al., 2005; Literák et al., 1999), sendo utilizado no diagnóstico de uma infeção crónica uma vez que deteta IgG (Dubey e Odening, 2001). Este foi validado em carnívoros como linces-ruivos, guaxinins (Procyon spp.), coiotes (Canis latrans), raposas- vermelhas (Vulpes vulpes), raposas-cinzentas (Urocyon cinereoargenteus) e ursos-pretos (Ursus americanus) (Dubey et al., 2004). Este teste serológico não necessita inclusive de nenhum equipamento especial e funciona bem para todas as espécies de aves (Dubey, 2002), raposas (Vulpes spp.) (Dubey et al., 1999) e suínos testados (Dubey, 1997; Dubey et al., 1995).

Este teste tem como princípio a aglutinação do parasita tratado com formalina, sendo os taquizoítos formolados aglutinados na presença de diluições de soros que contenham anticorpos (IgG) específicos (Fulton e Turk, 1959). Com a incorporação de 2-beta- mercaptoetanol (2-ME), Desmonts e Remington (1980) conseguiram aperfeiçoar o MAT (Lopes, 2011). O 2-ME inactiva as IgM o que permite confirmar apenas a presença de IgG específicas em caso de reacção positiva (Desmonts e Remington, 1980). Posteriormente, Dubey e Desmonts (1987) modificaram ligeiramente a técnica pela adição do mercaptoetanol apenas na última etapa, de modo a minimizar a exposição do operador ao cheiro desagradável e aos vapores tóxicos deste reagente, denominando-o de “teste de aglutinação modificado” (MAT) (Lopes, 2011).

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Na Figura 6, estão sumarizadas as principais técnicas utilizadas para o diagnóstico da infeção por T. gondii.

Figura 6: Desenho esquemático das principais técnicas utilizadas para o diagnóstico da infeção por Toxoplasma

gondii.