Diagnose de vírus

A diagnose do complexo viral foi realizada no laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Epagri/Estação Experimental de Caçador, Caçador/SC, por testes imunoenzimáticos (Tissue printting e Dot-blot) e no Laboratório de Microscopia Eletrônica da UnB através de análise molecular RT-PCR.

Para comprovação da presença do complexo formado pelas espécies OYDV, LYSV e GCLV, bulbos e bulbilhos fornecedores de explantes foram previamente submetidos aos testes imunoenzimáticos tissue printting e Dot-ELISA.

Os materiais provenientes dos experimentos foram testados por Dot-blot e os resultados foram validados por amostragens, através de RT-PCR.

Tissue printting - as avaliações das amostras por tissue printting foram realizadas de acordo com a metodologia proposta por Helguera et al. (1997), com modificações.

Os bulbos e bulbilhos provenientes do Banco Ativo de Germoplasma de alho da Epagri (Caçador/SC), foram seccionados com lâminas de bisturi e impressos em membrana de nitrocelulose (BIO- RAD Trans-Blot®, com poro de 0,2 µm) divididas em pedaços de 4,0 x 6,0cm. As membranas foram bloqueadas por 1 h em temperatura ambiente em solução TBS-1 (50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl) acrescida de Tween 20 (0,5%), leite em pó desnatado (1%) e 20% de soro normal de cabra. Em seguida, as membranas foram incubadas com os anti-soros primários contra OYDV, LYSV e GCLV, previamente

diluídos 1:1000 em tampão TBS-2 (50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 0,05% de Tween 20, 1% leite em pó desnatado) sob leve agitação por 1 hora. As membranas foram lavadas no mesmo tampão e incubadas com anti-soro secundário conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) por outro período de 1 h, seguido de três lavagens com TBS 1/2X (50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl) e reveladas com NBT/BCIP (Sigma) por 30 minutos sob agitação constante. Os borrões foram lavados três vezes com TBS 1/2X e uma vez com água destilada para paralização definitiva da reação.

Dot-blot: os bulbilhos matrizes doadores de explantes e aqueles gerados a partir dos experimentos, foram plantados em potes individuais de 500 ml contendo substrato orgânico esterilizado e mantidos em casa de vegetação sob temperatura de aproximadamente 25o C. Após a emergência dos bulbilhos, os vasos foram transferidos para um telado anti-afídeos e, durante o desenvolvimento inicial das plantas foram feitas amostragens da região mediana de folhas de cada tratamento, as quais foram acondicionadas em sacos plásticos, e imediatamente armazenadas em recipiente refrigerado até o momento do teste.

O Dot-Blot foi desenvolvido a partir da metodologia descrita por Stott (1989). Para cada amostra testada tomou-se 1 grama de massa fresca de folha, na fase inicial de desenvolvimento das plantas, as quais foram maceradas em 1 ml de tampão PBS ½X (10mM NaH2.PO4.H2O

pH 7,4 + 150 mM NaCl ), centrifugadas e mantidas refrigeradas. A membrana de nitrocelulose (MNC) (BIO-RAD Trans-Blot®, com poro de 0,2 µm) foi dividida em pedaços de 5,0 x 3,0 cm e marcadas a lápis por pontos equidistantes. Sobre cada ponto marcado adicionou-se 5 µL de sobrenadante das amostras. Nas membranas sensibilizadas com os antígenos, foram adicionados os controles positivos e negativos (BIOREBA AG, Swizerland) correspondente a cada vírus testado, sendo em seguida acondicionadas em recipiente de acrílico. Sítios livres de ligação de proteínas, eventualmente presentes nas membranas, foram bloqueados pela embebição com tampão PBS-L 1/2X (PBS com 2% de leite em pó desnatado) sob agitação leve por 2 horas.

Decorrido o tempo de agitação, o agente bloqueador foi descartado e em seguida adicionados os anti-soros contra Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek yellow stripe virus (LYSV) e Garlic common latent virus (GCLV) (BIOREBA AG, Swizerland) previamente diluídos 1:1.000 em PBS 1/2X, e incubados nas membranas sob agitação leve por 4 horas. Ao final do período, os anti-soros foram descartados e as membranas

foram incubadas com anti-soro secundário conjugado com fosfatase alcalina (Sigma), diluído 1:2.000 em PBS 1/2X sob agitação leve por 2 horas em temperatura ambiente. Decorrido o tempo de incubação, as membranas foram reveladas com NBT/BCPI diluídos em tampão de revelação (MgCl2.6H2O 5 mM, NaCl 100 mM, Tris HCl pH 8,9 100

mM) sob agitação leve, no escuro, por 30 minutos. Entre cada etapa foram realizadas 4 lavagens das fatias de membranas sendo, uma com PBS-T 1/2X e três com PBS 1/2X. A reação foi paralisada com a imersão das membranas em água destilada durante 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida mantidas em bancada para secar. Na leitura foram considerados positivos todos aqueles soros que desenvolveram uma reação de cor roxa rosada, fraca ou forte. O soro negativo não desenvolveu cor. As reações foram repetidas duas vezes, sendo testadas amostras de todas as plantas, obtidas em cada método de limpeza.

As diluições dos anticorpos primários e secundários, bem como os tempos de incubação, foram previamente ajustadas para à aplicação dos testes sorológicos.

RT-PCR (Transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da polimerase): as amostragens forma feitas nas mesmas plantas utilizadas para o Dot-blot. O terço médio das folhas, em pleno estágio vegetativo, foi identificado e imediatamente armazenados em nitrogênio líquido. De cada amostra foram coletadas três sub-amostras de modo a evitar escape nos resultados. As amostras foram levadas ao laboratório e foram realizadas 24 extrações de RNA total com o reagente Plant RNA Reagent®. Para a detecção de cada espécie viral nas amostras por RT- PCR, foram utilizados 2 µL do cDNA, incubados com 0,5 µL dos primers específicos de OYDV, LYSV, GCLV, GarV-C, GarV-D e GarMbFV (senso e antissenso) a 10 µM, 0,5 µL de dNTP Mix a 10 mM , 5,0 µL de Green Go Taq® Reaction Buffer 5X e 0,125 µL de Go Taq® DNA polymerase (1,25 U), para um volume final de 25 µL. A reação foi amplificada em Termociclador ESCO® modelo Swift Maxi utilizando-se os seguintes parâmetros na reação: desnaturação realizada a 94ºC por 3 min, seguida de 30 ciclos de amplificação (94ºC/1 min; 60ºC/1 min; 72ºC/1 min) e um ciclo final de 72ºC/ 7 min para extensão final.

Como controles positivo e negativo, utilizou-se o DNA plasmidial, contendo o gene da capa protéica de cada espécie viral a ser detectado e a amostra sem DNA (água MilliQ tratada com DEPC e autoclavada), respectivamente, em cada conjunto de reações de RT-PCR realizada.

Os produtos amplificados e o marcador 1Kb DNA Ladder (Invitrogen®) foram aplicados em gel de agarose a 0,8%, preparado em tampão 0,5 x Tris-Borato-EDTA (TBE), submetidos à eletroforese (120 V), corados com brometo de etídio a 0,1 mg/mL e visualizados sob luz ultravioleta no aparelho Alpha Innotech®.