Difração de Raios-X

Os difratogramas do protótipo foram obtidos no difratômetro Miniflex II® _(Rigaku®_),

equipado com ânodo de cobre. As amostras foram analisadas no intervalo de ângulo de 5-40º a uma velocidade dedigitalização de 2º.min-1_{. As amostras foram preparadas em suportes de}

vidro com uma fina camada de pó sem solvente.

4.4 CARACTERIZAÇÃO DA EPI EM SOLUÇÃO AQUOSA

4.4.1 Quantificação Espectrofotométrica na Região do Ultravioleta Visível

As amostras de EPI foram obtidas a partir de uma solução estoque de concentração 65 mg.mL-1 _{do protótipo em ácido clorídrico pré diluído para 0,05 N. Diminutas alíquotas dessa}

solução tampão fosfato pH 6,86 (BRASIL, 2010). Um volume máximo de 3% da solução concentrada na solução diluída foi estabelecido visando manter o pH das soluções de leitura em 6,83 ± 0,3. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro na região do UV-visível Cary 50 (Varian®_{), no modo “fast” e sempre como varredura de 200 a 400 nm. O comprimento de onda}

empregado para leitura dos espectros de ordem zero foi 260 nm, enquanto que para leitura da segunda derivada dos espectros empregou-se comprimento de onda de 275 nm. A segunda derivada do espectro de UV foi empregado sempre que a presença de cristais era possível.

O cálculo da absortividade molar relativa em 220 e 260 nm foi realizado a partir dos valores de absorbância obtidos pelo espectro de ordem zero em cada uma dessas regiões, a partir de uma solução de concentração fixa (150 µg.mL-1_{). De acordo com a Lei de Lambert-}

Beer (Equação 5), foi possível igualar a variável concentração e verificar, proporcionalmente, os valores das absortividades molares (Equação 6).

𝐴₌ = ℇ₌ℓ∁ (Eq. 5) 𝐴_{;;A B:} 𝐴_{;CA B:} = ℇ_{;;A B:} ℇ_{;CA B:} (Eq. 6)

Em que A é a absorbância, ℇ é a absortividade molar, ℓ é a distância percorrida pela luz ao incidir na amostra e ∁ é a concentração.

A influência do pH da absortividade molar também foi avaliada a partir de soluções de EPI de concentração fixa (150 µg.mL-1_{), as quais foram obtidas em solução pré-diluída de}

HCl 0,05N (pH 1,0); solução tampão fosfato (pH 6,86); e água destilada, que na ocasião do experimento possuía pH 8,0. Todas as medidas de pH foram avaliadas em potenciômetro previamente calibrado para os pHs 4, 7 e 10. As amostras de mesma concentração foram lidas no espectrofotômetro de UV-vis, em triplicata, e seus valores de absorbância em 260 nm registrados.

A linearidade das cuvas foi avaliada em uma ampla faixa de concentração (de 50 a 2600 µg.mL-1_{), através do método da regressão linear, efetuado pelo programa Origin Pro8}®_,

que também calculou os valores de R2 _{e demais informações sobre a curva. Uma curva a cada}

dia foi preparada, a partir de soluções concentradas individuais, para averiguar se o comportamento da regressão linear era alterado. Para isso, o coeficiente de variação, em percentual (CV%), do coeficiente angular e das concentrações, foram calculados através do programa Excel (Microsoft®_).

A partir dos dados oriundos da varredura das amostras da linearidade, foi o programa Origin Pro8® _{foi utilizado para cálculo dos valores de segunda derivada. A partir desses dados,}

identificou-se a região do espectro que responde proporcionalmente à variação da concentração e obteve-se a curva de calibração da segunda derivada.

Visando avaliar se a presença do polímero interfere na leitura da EPI, soluções contendo EPI nas mesmas concentrações foram obtidas, porém utilizando como solvente uma solução de polímero (2% p/v) em tampão pH 6,86. A solução de polímero foi utilizada como linha de base para leitura no espectrofotômetro, que teve a segunda derivada dos seus espectros calculada posteriormente. Os valores da inclinação da reta foram empregados para avaliar os parâmetros da regressão linear e comparar com os dados obtidos tanto pela leitura dos espectros de ordem zero quanto pelos dados obtidos pela amostras contendo polímeros.

Quando necessário, uma análise de variância simples (One-way ANOVA) foi empregada para determinar diferenças estatisticamente significativas entre os resultados, com intervalo de confiança de 95%.

4.4.2 Determinação Espectrofotométrica do pKa

O pKa experimental da EPI foi obtido através do equipamento Sirius T3 com auxílio do programa SiriusT3Control®_{, aplicando-se o procedimento chamado de Fast UV pKa}®_,

previamente desenvolvido com base no método de titulação espectrofotométrica (UVmetric®₎

já relatado na literatura (TAM; TAKÁCS-NOVÁK, 2001) e que teve sua confiabilidade comprovada em estudos anteriores (BOX et al., 2003; HOSSAIN, 2014; TAM; TAKÁCS- NOVÁK, 2001). Uma solução 100 mM do protótipo foi preparada em DMSO. Em seguida, 5 µL dessa solução foram retirados e 25 µL de uma solução tampão denominada de Sirius Neutral

Linear UV® _{foram adicionados para facilitar a estabilização do pH da solução após cada}

titulação. Executaram-se três titulações da mesma amostra, sempre do menor pH para o maior, cobrindo uma faixa de pH entre 2 e 12. Como agentes titulantes, foram utilizados o HCl e KOH 0,5 M. As titulações foram executadas em água ultra-purificada. Os espectros de absorção no UV da solução foram monitorados continuamente na amostra a cada titulação por uma sonda de fibra óptica de imersão, realizando-se, desta forma, uma varredura da amostra entre 118 e 1100 nm para construir um gráfico absorvância versus pH e, deste modo, determinar o pKa do protótipo. Os dados coletados foram analisados através do programa SiriusT3Refine® _{e apenas}

os dados obtidos entre 250 e 275 nm foram incluídos na análise. Os números de valores de pKa foram obtidos com auxílio da análise do Target Factor Analysis® _{(TFA), um recurso}

matemático do programa. A temperatura em 25°C e uma atmosfera de nitrogênio a 50 mL.min- 1 _{foi mantida durante todo experimento. Os níveis de CO}

2 também foram monitorados durante

todo o experimento para que não interferissem nos resultados. O experimento foi realizado em triplicata.