Digestão de proteínas e a variabilidade de Sl-CathLs

Dentre as prováveis enzimas digestivas identificadas no transcriptoma, 67,35% dos ESTs estão relacionados à digestão de proteínas que é fundamentada pela atividade de diversas variantes de cisteíno peptidases do tipo catepsinas L (54,29%). Em uma análise manual e mais detalhada das catepsinas L que foram agrupadas inicialmente em 7 contigs, foi possível a identificação de ao menos 32 variantes protéicas das Sl-CathLs, baseando-se apenas na comparação das extremidades 5' dos cDNAs, correspondente a aproximadamente 136 aminoácidos da região N-terminal das proteínas codificadas. Essas enzimas foram agrupadas em 3 grandes classes, de acordo com a similaridade com a variante mais abundante da Sl-CathL 1, correspondente à enzima recombinante caracterizada no capítulo 2, e a distribuição dessas variantes é indicada na tabela 1.2.

Tabela 1.2: Variantes da Sl-CathL indicadas de acordo com a abundância de ESTs e variantes de proteínas identificadas em cada contig a partir da análise manual.

Classe  Contig  ESTs (N)  Clusters de ESTs  Variantes protéicas 

Sl‐CathL 1  13  261 32 12  14  2 1 1  16  1 1 1  17  1 1 1  Sl‐CathL 2  15  44 8 7  63  22 4 3  Sl‐CathL 3  33  26 4 3  34  5 1 1  35  21 3 3 

Para a divisão das catepsinas elas foram classificadas de acordo com a similaridade da sequência de proteína com a rSl-CathL, que codifica a variante mais abundante das catepsinas, formada por 107 sequências que compõem a variante protéica mais abundante do contig 13. As catepsinas classificadas como Sl-CathL 1 apresentam similaridade maior que 90% na sequência de aminoácidos com a rSl- CathL, enquanto as Sl-CathL 2 e Sl-CathL 3 compartilham mais de 75% e 45% de identidade de sequência protéica, respectivamente, com a enzima mais abundante identificada. A análise inicial das catepsinas no programa dCAS gerou os 7 contigs

que são mostrados na tabela 1.3. O alinhamento entre as sequências completas das proteínas obtidas para cada um dos clusters é mostrado na figura 1.9B. A cabeça de seta indica o resíduo de cisteína do sítio ativo da enzima, que em uma das variantes da Sl-CathL 3 é substituído por uma serina.

Figura 1.9B: Alinhamento entre as sequências completas de algumas das variantes das Sl-CathLs 1, 2 e 3. Todas as variantes tem o peptídeo sinal identificado para a Sl-CathL e também a pró região com o motivo inibitório de catepsinas L (E42R46F50N53I57N61) conservados indicados pelas caixas seccionadas cinza e preta, respectivamente. A seta aponta o sítio de clivagem da pró-região identificado para a rSl-CathL e a cabeça de seta indica o resíduo de cisteína do sítio ativo (Cys138), que é substituído por uma serina em uma das variantes do contig 35. A nomenclatura das variantes segue o padrão da primeira sequência do alinhamento correspondente à rSl-CathL (GenBank: ACK38176) a mais abundante entre todas as catepsinas L identificadas: pertencente ao contig 13 (13), variante protéica 1 (_1) codificada por 107 sequências (n107), distribuídas em 13 clusters de cDNA (c13).

A partir da análise do genoma de T. castaneum foi verificada a expansão das cisteíno peptidases C1, que incluem catepsinas B e L, em cinco famílias divididas em quatro grandes clusters (Richards et al., 2008). Nas análises iniciais de anotação do genoma de T. castaneum foram identificados 165 genes que codificam serino

peptidases, 25 para cisteíno peptidases e outros 12 para carboxipeptidases (Prabhakar et al., 2007). A grande representação quantitativa, assim como a diversidade de peptidases identificadas em transcriptomas do intestino de outros besouros, como identificado para Tenebrio molitor (Prabhakar et al., 2007) e Chrysomela tremulae (Pauchet et al., 2009) não é diferente da diversidade de catepsinas L observadas no transcriptoma das larvas de S. levis e reforça a importância dessas peptidases nos processos digestivos das larvas de coleópteros.

Curiosamente, a maioria dessas catepsinas B identificadas no genoma de T. castaneum apresentam mutações em resíduos relacionados à atividade catalítica que é associada com a perda da atividade catalítica (Richards et al., 2008). Contudo, essas variantes também foram identificadas no transcriptoma o que indica que essas peptidases desempenham alguma função, como por exemplo, a atuação em mecanismos de defesa contra inibidores de cisteíno peptidases (Morris et al., 2009). No transcriptoma de S. levis também foram identificadas variantes abundantes da Sl-CathL 3, com a cisteína do sítio ativo substituída por uma serina (Figura 1.10).

Figura 1.10: Alinhamento entre os fragmentos N-terminais das variantes das Sl-CathLs 1, 2 e 3. O grupo correspondente à Sl-CathL 2 está ressaltado com uma caixa seccionada horizontal preta. As sequências acima dessa caixa correspondem às variantes da Sl-CathL 1, e aquelas abaixo da caixa são as variantes da Sl-CathL 3. Todas as variantes possuem o motivo conservado E42R46F50N53I57N61 da pró-região inibitória, o que está destacado na primeira seção do alinhamento. A cabeça de seta indica o resíduo de cisteína (Cys138) do sítio ativo conservado, com exceção das três variantes da Sl-

CathL 3 pertencentes ao contig 35, nas quais a caixa vermelha indica a mutação para o resíduo de

serina. O asterisco aponta o resíduo de glutamina (Gln132) conservado, também envolvido no mecanismo de catálise.

No alinhamento entre as sequências completas das variantes da Sl-CathL, indicado na figura 1.9, é possível verificar que os resíduos de asparagina e histidina que compõem a tríade catalítica da Sl-CathL são conservados entre todas as variantes. Apesar das mutações observadas no resíduo reativo de cisteína das sequências da Sl-CathL 3 que formam o contig 35 aparentemente implicarem na perda de funcionalidade da enzima, estudos mais detalhados são necessários para confirmar a perda da atividade assim como a função dessas variantes.

O resultado do experimento desenhado para verificar a expressão diferencial das sequências de Sl-CathLs provenientes das bibliotecas de insetos cultivados em dieta artificial e no campo é indicado na figura 1.11. Foram utilizadas 58 sequências provenientes de cada tratamento. As sequências provenientes da análise do transcriptoma das larvas também são incluídas nessa análise e as frequências dessas variantes são indicadas na figura (n). O agrupamento das sequências realizado pelo método de Neighbor Joining facilitou a identificação de sequências similares, que aponta a provável expressão diferencial de variantes da Sl-CathL 2 nas diferentes dietas. Em função do reduzido número de clones analisados, análises de qRT-PCR são necessárias para confirmar as diferenças nos níveis de expressão encontradas a partir da análise dessas bibliotecas.

O ramo destacado em vermelho corresponde às variantes da Sl-CathL 2 abundantemente produzidas em condições de dieta natural do inseto, alimentando- se de cana-de-açúcar. O ramo em azul evidencia outra variante da Sl-CathL 2 também identificada na biblioteca, não tão abundante, que é aparentemente transcrita preferencialmente em condições de dieta artificial. Cabe ainda destacar que, a partir do sequenciamento dos clones provenientes dessas bibliotecas de Sl- CathL, novas variantes da enzima foram identificadas, as quais não foram encontradas na biblioteca da qual milhares de clones foram sequenciados.

Figura 1.11: Agrupamento das Sl-CathLs baseando-se na similaridade da região N-terminal das proteínas. As sequências obtidas em condição de dieta artificial estão indicadas como “lab” enquanto o termo "campo" é utilizado para as sequências provenientes do tratamento em condicões de dieta natural. A análise de similaridade indica a abundância de variantes da Sl-CathL 2 preferencialmente transcritas em condições de dieta natural, indicadas no ramo vermelho. Os clusters de Sl-CathL mais abundantes do transcriptoma são indicados pelos ramos mais espessos, em preto.

É conhecido que as plantas produzem diversos inibidores protéicos contra as peptidases digestivas de insetos. Como proteínas de defesa, esses inibidores dificultam a digestão de proteínas por meio da diminuição da disponibilidade das enzimas digestivas, impedindo a síntese de proteínas essenciais para o desenvolvimento e reprodução de parasitas ou predadores (Broadway e Duffey, 1986; Lawrence e Koundal, 2002).

A grande diversidade de variantes de peptidases encontradas nos insetos está certamente relacionada à capacidade de remodelamento do sistema digestivo pela produção de peptidases insensíveis a esses inibidores, como detectado para as serino peptidases dos lepidópteros Helicoverpa armigera (Bown et al. 1997) e Spodoptera frugiperda (Paulillo et al., 2000). O mesmo foi relatado para as larvas do besouro Tribolium castaneum que, quando desafiadas com inibidores de cisteíno peptidases, são capazes de remodelar a produção das enzimas cisteíno peptidases digestivas, produzindo fundamentalmente serino peptidases insensíveis aos inibidores (Oppert et al., 2005).

Apesar dessa plasticidade do sistema digestivo dos insetos dificultar as estratégias de proteção contra insetos que envolvem a expressão de inibidores de peptidases em plantas (Jongsma et al., 1995; Zhu-Salzman et al., 2003; Gruden et al., 2004), essa abordagem ainda sim tem se mostrado uma eficiente abordagem para o desenvolvimento de culturas resistentes a insetos praga (Leplé et al., 1995; Lawrence e Koundal, 2002; Haq et al., 2004). Nesse sentido, a identificação das principais classes de peptidases digestivas pela abordagem transcriptômica é fundamental para o delineamento de estratégias de controle adequadas para o controle de insetos.