Identificação de uma invertase no transcriptoma de S levis

Seguindo a mesma tendência das PCWDE, até muito recentemente a existência de β-fructofuranosidases (invertases) não era conhecida no reino animal. Assim como as α-glucosidases, as invertases atuam na hidrólise de sacarose. No entanto, as últimas atacam a ligação β da frutose, enquanto as α-glucosidases promovem a hidrólise pela outra extremidade, nas ligações α da glicose e são amplamente encontradas no trato digestivo de insetos (Terra e Ferreira, 2011). Apesar da aparente ausência nos genomas eucariotos, a atividade de invertases tem sido relatada em lepidópteros (Santos e Terra, 1986; Sumida et al., 1994; Carneiro et al., 2004).

Os primeiros relatos da ocorrência de transcritos de invertases em animais foram em uma biblioteca intestinal de larvas de Helicoverpa armigera (Pauchet et al., 2008), assim como em Bombyx mori, organismo no qual a enzima foi caracterizada e imulocalizada no intestino e glândulas de seda das larvas (Daimon et al., 2008). Posteriormente, uma nova invertase foi identificada no transcriptoma de larvas de Manduca sexta (Pauchet et al., 2010a), todos insetos da ordem Lepidoptera. A ausência desses genes em outros organismos superiores, assim como a similaridade com as invertases bacterianas indicam a provável ocorrência de um evento de transferência horizontal para um ancestral comum desses insetos (Pauchet et al., 2008; Daimon et al., 2008).

Em coleópteros, a atividade de invertases é erroneamente relatada em trabalhos da década de 80, nos quais o termo invertase refere-se a quaisquer enzimas com atividade hidrolítica sobre a sacarose, sem menção alguma à atividade β-fructosidásica específica. Para o nosso conhecimento, nenhum transcrito que codifica uma invertase foi identificado em transcriptomas de coleópteros até o presente. Além disso, foram realizadas análises para verificar a ocorrência de um gene homólogo no genoma de T. castaneum, mas nenhum provável transcrito ou motivo conservado foram identificados. Dessa maneira, é relatada pela primeira vez neste estudo a identificação de um EST que codifica uma invertase proveniente de um coleóptero, o Sphenophorus levis.

O contig 198 é formado por três sequências, que codificam a provável β- fructofuranosidase, ou invertase, proveniente de Sphenophorus levis. Os transcritos de cDNA apresentam UTRs 3' e 5', sinal de poliadenilação (AATAAA) e cauda poli-a,

o que indica que é de procedência eucariótica (Figura 1.14). A ORF de 1434 pb, codifica uma proteína de 478 aminoácidos, que apresenta maior similaridade com as invertases bacterianas. No entanto, as análises de códon usage (Anexo 1) evidenciam que os códons da invertase de S. levis são muito mais similares àqueles preferencialmente identificados paras as peptidases digestivas do inseto do que os códons observados para outras invertases bacterianas.

Figura 1.14: Caracterização da sequência de cDNA de um clone que codifica a invertase identificada no transcriptoma de S. levis. A: Sequência completa do cDNA da invertase e da enzima codificada. Verifica-se a ocorrência de regiões não transcritas (UTRs) 5' e 3', além do sinal de poli adenilação (aataaa) e da cauda poli-a, indicada em vermelho. B: Eletroferograma da região UTR 3' do cDNA que evidencia a ocorrência da cauda poli-A característica de RNAs mensageiros eucarióticos.

Apesar da baixa frequência dos transcritos da invertase na biblioteca de S. levis (0,08%) em condições de dieta artificial, a enzima está sendo estudada em detalhes em nosso laboratório pelo estudante de iniciação científica Rafael Pedezzi. A comprovação da presença da invertase no genoma de S. levis deve esclarecer a importância da mesma para os processos digestivos do inseto, desde que a média do conteúdo de sacarose em plantas de cana-de-açúcar selecionadas chega até a 18,1% do total da biomassa vegetal (Papini-Terzi et al., 2009). O perfil de expressão

gênica da invertase de S. levis, analisado por qRT-PCR e indicado na figura 1.6, assemelha-se àquele obtido para outras enzimas digestivas. Além disso, na figura 1.5 é indicada a transcrição da invertase exclusivamente no intestino médio das larvas de S. levis.

Acredita-se que a ocorrência da invertase no genoma de B. mori pode ter relação com a capacidade de adaptação aos alcalóides sintetizados pelas amoreiras, que mimetizam os açúcares, atuando como inibidores específicos de α - glucosidases (Daimon et al., 2008). Nesse sentido, a ocorrência da invertase em S. levis também poderia ser vantajosa visto que flavonóides isolados do melaço de cana-de-açúcar tem a capacidade de inibir a atividade de α-glucosidase e α-amilase in vitro (Holt et al., 2003). O alinhamento da sequência completa da invertase identificada no transcriptoma de S. levis, com outras invertases provenientes de lepidópteros e bactérias é indicado na figura 1.15.

Figura 1.15: Alinhamento da sequência de proteína da invertase de S. levis com as invertases homólogas de lepidópteros e bactérias. Os prováveis resíduos de aminoácidos conservados do sítio

ativo são indicados por cabeças de seta. O asterisco indica outro resíduo de aminoácido conservado, também provavelmente envolvido na catálise, de acordo com o descrito para as invertases caracterizadas de micro-organismos.

Os resíduos de aminoácidos conservados provavelmente envolvidos na catálise, de acordo com o descrito para as enzimas de micro-organismos, são também destacados na figura 1.15. A análise filogenética apresentada na figura 1.16 indica a maior semelhança da invertase de S. levis com as enzimas de origem bacteriana, o que reforça a teoria de aquisição desse gene por transferência horizontal, como proposto para os lepidópteros (Daimon et al., 2008; Pauchet et al., 2008; Pauchet et al., 2010a).

Figura 1.16: Análise filogenética da invertase identificada na biblioteca de S. levis com outras invertases provenientes de diversos organismos. A maior similaridade da sequência de S. levis com invertases bacterianas reforça a teoria de aquisição desse gene por transferência horizontal, como proposto para os lepidópteros (Daimon et al., 2008; Pauchet et al., 2008). A análise foi conduzida no programa Mega 5.05 utilizando o método de Neighbor Joining com 10.000 repeticões. Os valores de