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6. DISCUSSÃO
Os efeitos da infecção por parasitos do gênero Leishmania na ativação, maturação e migração de células dendríticas é dependente de inúmeros fatores, como a espécie ou a cepa do parasito e o estágio de desenvolvimento do mesmo, o subtipo de célula dendrítica analisada, assim como as condições experimentais do estudo (in vivo ou in vitro, com ou sem estimulação adicional, etc.), como revisado por Soong (Soong, 2008).
Inicialmente, fizemos uma análise comparativa do nível de infecção de células dendríticas por diferentes espécies de Leishmania. Os resultados da Figura 6 sugerem que
L. amazonensis é mais eficiente para infectar células dendríticas porque essa espécie foi
capaz de infectar uma maior quantidade de células após 3 horas de incubação, quando comparada à L. braziliensis ou L. major. Porém, as taxas de infecção se igualaram após 20 horas de infecção. É importante considerar que durante uma infecção natural, esses parasitos despendem poucas horas para infectarem suas células hospedeiras, já que são protozoários intracelulares obrigatórios. Uma vez que L. amazonensis é mais rápida para infectar células hospedeiras, isso poderia favorecer a sobrevivência e permanência do parasito. Existe uma carência de análises comparativas sobre a capacidade de diferentes espécies de Leishmania de infectarem células dendríticas, mas um estudo sugere que a associação entre moléculas presentes na superfície dos parasitos e o receptor de célula dendrítica DC-SIGN determinam o sucesso de uma ou outra espécie de Leishmania (Colmenares e cols., 2004).
É amplamente aceito que a interação de promastigotas de Leishmania com células dendríticas causará a ativação dessas células (Qi e cols., 2001; Xin e cols., 2008), como mostrado pelo aumento da expressão de MHCII e co-estimuladores (CD40, CD80, CD83 e CD86) e o estímulo à proliferação de células T CD4+. Porém, com exceção de um número limitado de estudos, a avaliação da ativação de células dendríticas foi feita em culturas totais, sem analisar separadamente as células infectadas e as células não infectadas. Quando esse cuidado foi tomado, a infecção de células dendríticas foi associada à inibição da ativação dessas células (Carvalho e cols., 2008; Prina e cols., 2004). Nossos dados (Figura 8) corroboram esses estudos por mostrarem que células dendríticas infectadas com
Leishmania são refratárias à ativação por LPS, uma vez que a expressão de MHCII e CD86
foi diminuída quando comparada à expressão em células tratadas com LPS e não infectadas. A possibilidade dos parasitos prejudicarem a ativação de células dendríticas por interferirem com a sinalização do LPS via receptor TLR-4 foi descartada porque a infecção
65 por Leishmania foi capaz de inibir a ativação das células mesmo na ausência de LPS (dados não mostrados).
No que diz respeito à expressão de CD40, enquanto a infecção com L. braziliensis ou L. major estimulou a expressão de CD40 em células infectadas, a infecção por L.
amazonensis não alterou a expressão dessa molécula, mantendo-a em valores semelhantes
ao encontrado para células não infectadas (Figura 8). Discrepâncias na expressão de CD40 em células dendríticas infectadas com diferentes espécies de Leishmania já foram observadas. Foi mostrado que a expressão de CD40 foi menor em células dendríticas infectadas com L. amazonensis que em células dendríticas infectadas com L. major (Boggiatto e cols., 2009). Nossos resultados confirmam essas observações e ainda estendem a análise para a infecção por L. braziliensis. Adicionalmente, uma menor expressão de CD40 foi observada em macrófagos infectados com L. donovani (Buates & Matlashewski, 2001) e células dendríticas infectadas com L. infantum (Neves e cols., 2010). Ainda é possível associar o prejuízo na expressão de CD40 à geração de células T reguladoras e à susceptibilidade à infecção por L. donovani (Martin e cols., 2010). Um trabalho de nosso grupo mostrou que camundongos C57BL/6J são mais susceptíveis à infecção por L. amazonensis que à infecção por L. braziliensis ou L. major (Marques-da- Silva e cols., 2008). É importante lembrar que apenas L. amazonensis foi capaz de inibir a expressão de CD40 em células dendríticas.
Os mecanismos pelos quais a infecção por Leishmania inibe a ativação de células dendríticas não são completamente conhecidos, embora um aumento na produção de IL-10 venha sendo frequentemente sugerido como um possível fator (Belkaid e cols., 2001; Vasquez e cols., 2008; Xin e cols., 2008). No entanto, já foi demonstrado que a neutralização de IL-10 não reverte a inibição de células dendríticas, ao menos no que diz respeito à produção de IL-12 (Soong, 2008). Em nosso trabalho, o envolvimento de IL-10 na supressão da ativação de células dendríticas infectadas foi dependente da espécie de
Leishmania utilizada. A inibição da ativação de células dendríticas foi parcialmente
dependente do receptor de IL-10 durante a infecção por L. braziliensis ou L. major. Por outro lado, não foi encontrada nenhuma evidência que IL-10 pode estar envolvida na inibição da ativação de células dendríticas infectadas por L. amazonensis (Figura 10).
Nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares têm sido mostrados como capazes de afetar a ativação e a migração de células dendríticas. Por exemplo, o ATP extracelular induz a maturação de células dendríticas e a ativação de células do tipo Th1 enquanto a adenosina inibe a ativação de células dendríticas e a produção de citocinas pró-
66 inflamatórias (Hofer e cols., 2003; La Sala e cols., 2001; Panther e cols., 2003; Schnurr e cols., 2000). O ATP extracelular é acumulado em situações de injúria celular ou infecção e é considerado um “sinal de perigo” (La Sala e cols., 2003). A liberação de ATP pode ser mediada por receptores P2X7, que não somente sinalizam concentrações extracelulares
dessa molécula, mas também estão envolvidos com a sua secreção (Pellegatti e cols., 2005). Interessantemente, L. amazonensis aumenta a expressão do receptor P2X7 em
macrófagos murinos (Chaves e cols., 2009). É possível que esse mesmo mecanismo esteja presente em células dendríticas infectadas com Leishmania.
Como já foi descrito, parasitos do gênero Leishmania expressam em sua superfície ectonucleotidases capazes de converter ATP à adenosina (Marques-da-Silva e cols., 2008). Baseados nessa observação, e de que L. amazonensis é a espécie com maior expressão dessas enzimas, hipotetizamos que a produção de adenosina pela enzima do parasito estaria envolvida na inibição da ativação de células dendríticas infectadas com L. amazonensis. Nossos resultados, no entanto, demonstraram que a incubação prévia do parasito com suramina, o que levaria à maior concentração de ATP por inibir sua degradação por ENTPDase, não alterou o estado de ativação da célula infectada (Figura 11). Porém, esse resultado não descarta o papel das ectonucleotidases presentes em parasitos do gênero
Leishmania como fatores de virulência e como moduladores da resposta imune, já que
durante a infecção, in vivo, essas enzimas podem ser importantes para a modulação de outros tipos celulares, como neutrófilos, macrófagos e linfócitos. Curiosamente, quando suramina foi adicionada no momento da infecção de células dendríticas, fomos capazes de restaurar a habilidade do LPS de estimular a expressão de MHCII e CD86 por células infectadas (Fig. 11). Estes resultados sugerem que o inibidor atuou em enzimas da própria célula dendrítica, e não em enzimas do parasito. Isto nos encorajou a investigar a expressão e o papel de ectonucleotidases expressas em células dendríticas.
Em mamíferos, as concentrações de ATP extracelular e adenosina também são controladas pela ação dessas enzimas: ENTPDase (CD39), que hidrolisa ATP para ADP e então para AMP, e 5’-nucleotidase (CD73), que converte o AMP a adenosina (Berchtold e cols., 1999; Bours e cols., 2006). A expressão de CD39 e CD73 foi significativamente aumentada em células dendríticas infectadas, assim como a atividade ectonucleotidásica dessas células, independentemente da espécie de parasito utilizada para a infecção (Figuras 12-13). O aumento da expressão e da atividade de ectonucleotidases pode ser benéfico para os parasitos, uma vez que esse mecanismo garante a produção de adenosina extracelular mesmo após sua internalização, então prevenindo a ativação de células dendríticas.
67 Essa hipótese foi inicialmente confirmada para todas as espécies de parasitos utilizadas neste trabalho, pela recuperação da expressão de MHCII e CD86 na presença de suramina (Figura 16), que poderia prevenir a hidrólise de ATP por inibir a atividade da ENTPDase, e então diminuir o substrato (AMP) disponível para a 5’-nucleotidase, com uma consequente redução na produção de adenosina.
Schnurr e colaboradores mostraram que o tratamento com suramina foi capaz de diminuir a expressão de CD86 em células dendríticas, por atuar em receptores de ATP (Schnurr e cols., 2000). Em nosso estudo, a suramina aumentou, ao invés de diminuir, a expressão de MHCII e CD86, sugerindo que ela atuou, predominantemente, sobre a atividade da ENTPDase (CD39). Além disso, quando utilizada numa concentração de 30 µM (concentração suficiente para bloquear os receptores P2, mas não inibir a atividade da ENTPDase), a suramina não foi capaz de alterar a expressão de marcadores de ativação em células dendríticas infectadas (Figura 11).
A adenosina exerce seus efeitos pelos receptores A1, A2A, A2B e A3 (Abbracchio &
Ceruti, 2007). Alguns estudos têm apontado o receptor A2B como o principal receptor
envolvido na inibição da resposta de células dendríticas no modelo murino (Novitskiy e cols., 2008; Wilson e cols., 2009). Consistente com o papel da adenosina na inibição da resposta de células dendríticas em nossos experimentos, o bloqueio do receptor A2B
também foi capaz de reverter a diminuição da expressão dos marcadores de ativação em células dendríticas infectadas, como previamente mostrado para suramina. Porém, esse receptor foi envolvido somente na infecção por L. amazonensis, independentemente do marcador de ativação avaliado (MHCII, CD86 e CD40) (Figura 16), corroborando a expressão diferenciada desse receptor entre células dendríticas infectadas com L.
amazonensis, L. braziliensis ou L. major (Figura 14). Curiosamente, a expressão de MHCII
e CD86 foi aumentada somente nas células infectadas, enquanto a expressão de CD40 foi aumentada nas células infectadas e nas células que permaneceram não infectadas após o contato com o parasito. É possível que a expressão de CD40 seja estimulada, após o tratamento com MRS1754, por algum fator secretado pelas células infectadas, que será capaz de agir em todas as células vizinhas, inclusive as não infectadas. É possível, ainda, que células tratadas tenham perdido a capacidade de secretar aquele fator que mantinha a expressão de CD40 baixa. Nós ainda não temos evidências sobre quais seriam esses fatores, mas sabe-se que a expressão de CD40 é estimulada por TNF-α e inibida por TGF-β (Benveniste e cols., 2004). Apesar de células dendríticas infectadas por L. braziliensis ou
68 dessas células, nada impede que a adenosina produzida por células infectadas interfira sobre as funções de outras células imunes.
Embora L. amazonensis tenho sido capaz de favorecer a expressão dos receptores A2A e A2B (Figura 14), somente o receptor A2B mostrou-se importante no processo de
inibição da resposta de células dendríticas induzida por esses parasitos (Figura 16). Um trabalho recente mostrou que o receptor A2A está envolvido com a expressão do receptor
A2B na superfície celular (Moriyama & Sitkovsky, 2010), e talvez seja essa a relevância
para a presença desse receptor na superfície de células dendríticas infectadas com L.
amazonensis. Não podemos descartar a possibilidade de que maior atividade do receptor
A2B pode, ainda, ser devida a ausência de expressão dos receptores A1 e A3 em células
dendríticas infectadas com L. amazonensis. Por esse motivo, essas células não teriam a regulação dos receptores A1 e A3 e a imunossupressão mediada pelo receptor A2B
prevaleceria (Abbracchio & Ceruti, 2007).
A infecção por L. amazonensis é caracterizada pela diminuição da proliferação de linfócitos tanto em humanos como no modelo murino (Barral e cols., 1995; Maioli e cols., 2004), e esse efeito foi reproduzido em nosso modelo. Somente células dendríticas infectadas com L. amazonensis perderam sua habilidade de estimular a proliferação de linfócitos, e o tratamento com suramina ou MRS1754 restaurou a habilidade dessas células (Figuras 17). Em nosso trabalho, a expressão de CD40 mostrou-se essencial para a indução de uma resposta celular, uma vez que células dendríticas infectadas com L. amazonensis foram incapazes de expressar CD40 e o tratamento com suramina ou MRS1754 estimulou a expressão desse marcador. Apesar de diminuírem a expressão de MHCII e CD86, células dendríticas infectadas com L. braziliensis ou L. major, e que apresentaram maior expressão de CD40, foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos (Figuras 17). Num estudo que avaliou as contribuições de diferentes moléculas co-estimuladoras nas reações de rejeição a transplantes, foi demonstrado que CD40 de origem suína foi capaz de co- estimular células T CD4+ humanas, independentemente da expressão de CD80/CD86 (Rogers e cols., 2003). Um segundo estudo mostrou que a ausência de CD40 ou CD40L impedem células dendríticas de induzirem uma resposta adequada tanto de linfócitos T CD4+ quanto de linfócitos T CD8+, mesmo quando células dendríticas expressam altos níveis de peptídeo conjugado a moléculas de MHC e de moléculas co-estimuladoras (CD80 e CD86) (Fujii e cols., 2004). Por fim, a interação entre o CD40 expresso em células dendríticas e o CD40 ligante expresso em linfócitos ativados estimula a expressão de marcadores de ativação e moléculas de adesão em células dendríticas (Ni & O'Neill,
69 1997), o que poderia reverter a inibição da expressão de MHCII e CD86 em células dendríticas infectadas com L. braziliensis ou L. major.
Como mencionado anteriormente, a expressão diferenciada de CD40 por diferentes espécies de Leishmania já foi avaliada (Boggiatto e cols., 2009). Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na regulação da expressão de CD40. Boggiato e cols. (2009) demonstraram que a inibição da fosforilação de ERK1/2 restaurou a expressão de CD40 em células dendríticas infectadas com L. amazonensis. Interessantemente, a ativação do receptor A2B também induz a fosforilação de ERK1/2 (Schulte & Fredholm, 2003). Então,
é possível que o bloqueio do receptor A2B em células dendríticas infectadas com L.
amazonensis leva à inibição da fosforilação de ERK1/2, com consequente restauração da
expressão de CD40.
A presença de adenosina no meio extracelular pode facilitar a permanência de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro, devido às inúmeras propriedades imunossupressoras dessa molécula (Bours e cols., 2006; Deaglio e cols., 2007; Hofer e cols., 2003; Kumar & Sharma, 2009; Panther e cols., 2003). Um estudo recente mostrou que a expressão de CD39 e a produção de adenosina foram aumentadas numa população de células dendríticas tolerogênicas, caracterizadas por baixos níveis de CD40 e IL-12p40 e menor habilidade de induzir a proliferação de células T (Torres-Aguilar e cols., 2010). Outro trabalho apontou o AMPc (resultante da ativação de receptores A2, por exemplo)
como um componente chave para a inibição da expressão de marcadores de ativação em células dendríticas mediada por células T reguladoras, enquanto a IL-10 não teve nenhuma influência nesse aspecto, só sendo importante para a diminuição da produção de IL-12 e IL-6 num momento mais tardio (Fassbender e cols., 2010). Encontramos resultados similares quando células dendríticas foram infectadas com L. amazonensis. Além disso, a ativação de receptores A2B prejudica a maturação de células dendríticas e,
consequentemente, reduz sua habilidade de ativar células T CD4+, em adição ao prejuízo das funções de outras células imunes (Hasko e cols., 2009; Wilson e cols., 2009). Interessantemente, recentemente foi mostrado que células de Langerhans, a população de células dendríticas presente na pele, são reguladores negativos da resposta anti-
Leishmania, principalmente por estimular a expansão e a ativação de células T reguladoras
(Kautz-Neu e cols., 2011). Sem desconsiderar todas essas informações prévias, nosso trabalho é inovador por mostrar, pela primeira vez em nosso conhecimento, que a infecção de células dendríticas por parasitos protozoários (L. amazonensis) leva a uma diminuição
70 na ativação de células dendríticas por um mecanismo dependente da expressão de ectonucleotidases a ativação de receptores A2B.
Nossos resultados contribuem para o conhecimento dos mecanismos de evasão da resposta imune por L. amazonensis, que é responsável por uma das mais graves formas de leishmaniose cutânea, isto é, a leishmaniose cutânea difusa, uma doença caracterizada pela anergia de células T em pacientes afetados. Em contrapartida, a infecção por L. braziliensis ou L. major é, na maioria das vezes, caracterizada por uma forte resposta imune celular, que parece levar ao controle do parasito (Da-Cruz & Pirmez, 2005). De acordo com nossos dados, não observamos o envolvimento de receptores A2B em células dendríticas infectadas
por esses parasitos. Nesse caso, uma diminuição menos intensa da ativação de células dendríticas foi observada, e que parece ser parcialmente mediada por IL-10. Em resumo, nosso trabalho demonstrou um novo mecanismo de evasão da resposta imune por L.
amazonensis, via ativação de receptores A2B em células dendríticas infectadas (Figura 18).
Figura 18. Mecanismos utilizados por L. amazonensis, L. braziliensis e L. major para inibir funções de células dendríticas e evadir a resposta imune. Infecção por L. amazonensis aumenta a expressão de CD39 e CD73, garantindo
a produção de adenosina (ADO). Adenosina ativa o receptor A2B e prejudica a ativação de células dendríticas infectadas,
especialmente por deficiência da expressão de CD40 e, consequentemente, reduz sua capacidade de estimular a proliferação de linfócitos. L. braziliensis e L. major, apesar de induzirem o aumento da expressão de CD39 e CD73 e a produção de adenosina, não ativam o receptor A2B. Estas duas espécies diminuem a expressão de MHCII e CD86, com a
participação de receptor de IL-10 (IL-10R), mas aumentam a expressão de CD40, e não afetam significativamente a capacidade de células dendríticas de estimular a proliferação celular.
Futuramente, pretendemos caracterizar as vias de sinalização envolvidas com a possível ativação por receptores de adenosina e a participação desses mecanismos na migração de células dendríticas, in vivo. Além disso, a partir da descrição que células de
71 Langerhans são importantes para a geração de células T reguladoras e consequente supressão da resposta anti-Leishmania (Kautz-Neu e cols., 2011), pretendemos avaliar a indução de células T reguladoras a partir da infecção por diferentes espécies de
Leishmania, bem como o envolvimento da sinalização purinérgica nesse processo.
Considerando que as leishmanioses consistem num grave problema de saúde pública, que a manifestação da doença está intimamente relacionada à montagem da resposta imune pelo hospedeiro, e que células dendríticas são células essenciais nessa resposta, investigações de novos fatores de virulência do parasito e o melhor entendimento das relações parasito-hospedeiro e dos mecanismos de evasão envolvidos abrem um caminho para novas propostas terapêuticas para o controle da infecção por Leishmania.