Este trabalho teve por objetivo iniciar a caracterização dos TbEIF4G1 e TbEIF4G2, dois homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G encontrados em T. brucei, através da determinação de sua localização subcelular nas células desse parasita. Essas proteínas foram selecionadas visto que o estudo dos demais ortólogos encontrados em T. brucei, TbEIF4G3-5, já se encontra em andamento (REIS et al., manuscrito em redação). O interesse pela localização desses polipeptídeos é que esta fornece indícios importantes da função que a proteína desempenha na célula, podendo direcionar o foco da pesquisa.
Tanto o alinhamento do TbEIF4G1 quanto o do TbEIF4G2 com seus respectivos ortólogos em T. cruzi e em L. major demonstraram conservação da seqüência do domínio HEAT e da região C-terminal, onde há um possível motivo W2, como esperado para o eIF4G (PREVOT, DARLIX e OHLMANN, 2003; ARAVIND e KOONIN, 2000), apesar da similaridade entre as seqüências dos fatores não ser tão elevada (47% entre TbEIF4G1 e
LmEIF4G1 e 49% entre TbEIF4G2 e LmEIF4G2) (DHALIA et al., 2005). Essa conservação
das regiões foi verificada inclusive nas análises de polimorfismos das seqüências clonadas com relação àquelas depositadas no banco de dados de T. brucei. Foram observadas poucas variações de seqüência e mesmo as duas que o TbEIF4G1 exibiu nas regiões mais conservadas (uma no domínio HEAT e outra na região W2, entretanto sem afetar os resíduos de triptofano) não parecem afetar uma possível função biológica (visto que são resíduos não- conservados), embora isto deva ser melhor investigado.
Após a clonagem dos genes e expressão das proteínas recombinantes, foram produzidos os soros policlonais que se mostraram capazes de reconhecer de suas respectivas proteínas recombinantes, tanto do fragmento correspondente ao domínio HEAT central, quanto à proteína completa. Esses anticorpos foram empregados em ensaios de “western-blot”
com extratos protéicos totais de T. brucei e foi observado o reconhecimento do TbEIF4G1 na forma procíclica. Entretanto o TbEIF4G1, na forma sanguínea, e o TbEIF4G2, em ambas as formas, parecem ser raros ou ausentes (ao menos nas fases exponenciais de ambas as formas de desenvolvimento do parasita). Enquanto para o TbEIF4G1, esse perfil indica expressão estágio-específica, para o TbEIF4G2, a pequena quantidade de proteína não parece vincula-lo à síntese protéica diretamente, visto que em geral os fatores associados a essa via são abundantes (DHALIA et al., 2006), podendo ambos estar relacionados não propriamente à iniciação da tradução, mas à sua regulação (global ou mRNA-específica) que, nesses organismos, é pós-transcricional (CLAYTON, 2002). O fato de o TbEIF4G2 ser muito mais raro que o TbEIF4G1 (como observado pelos ensaios de “western-blot”) também esclarece porque o ensaio de imunocitoquímica do segundo é mais nítido que o do primeiro.
Os resultados da imunocitoquímica para os TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e da superexpressão, para este último, demonstram claramente que ambas as proteínas são citoplasmáticas. Esse resultado é similar ao encontrado para o TbEIF4AI, que provavelmente desempenha função na iniciação da tradução (DHALIA et al., 2006). Entretanto, a análise da região HEAT-MIF4G dos LmEIF4G1 e LmEIF4G2 demonstrou que estes não possuem capacidade de interação com o LmEIF4AI (DHALIA et al., 2005) e, visto que estes
LmEIF4Gs possuem maior similaridade aos seus ortólogos em T. brucei do que ao humano
(DHALIA et al., 2005), é possível que os TbEIF4G1 e TbEIF4G2 não sejam capazes também de se ligar ao TbEIF4AI, o que indicaria novamente que não possuem função na iniciação da tradução, exercendo possível função regulatória, não obstante seja necessária essa confirmação por análise de interação.
Outros resultados podem auxiliar a compreensão do papel que esses polipeptídeos estudados desempenham no metabolismo do parasita. Um exemplo é o fato de que o
primeiro (interação clássica eIF4G/PABP), apesar da ligação dos fatores LmEIF4G3 e
LmEIF4G4, que possuem mais evidências de sua participação na iniciação da tradução,
empregarem possivelmente seu domínio HEAT (REIS, 2009). Isto sugere mais uma vez um possível papel deste fator na regulação da tradução, visto que ele é incapaz de se ligar ao
LmEIF4AI (DHALIA et al., 2005). Se os fatores forem realmente ortólogos entre si e
apresentarem capacidades de interação semelhantes, pode ser válido inferir o mesmo para o
TbEIF4G1 (mas deve ser confirmado por ensaios de interação adequados). Para os TbEIF4G3-5 em T. brucei, foi demonstrado que os fatores se mostram essenciais para
viabilidade celular, mas apresentam funções diferentes pois o TbEIF4G4 está associado com a integridade da morfologia celular e o TbEIF4G3 com a iniciação da tradução propriamente dita, visto que sua depleção leva à interrupção da proliferação celular e à diminuição da taxa de síntese protéica (MOURA, 2007; MOURA, comunicação pessoal).
Este trabalho além de fornecer informações novas sobre as proteínas alvo de estudo, também gerou ferramentas novas que vão impulsionar o conhecimento sobre a função das mesmas no futuro. Os genes clonados, assim como os soros obtidos contra as proteínas recombinantes, poderão ser empregados em ensaios de interferência de RNA, a fim de verificar a viabilidade celular na ausência dos respectivos fatores e sua repercussão no metabolismo celular. Será possível também a quantificação da expressão dos mesmos, e a análise dessa expressão nas fases do ciclo de vida do parasita. Ambos os métodos são importantes para identificar sua função, conforme já observado em outros trabalhos (DHALIA et al., 2006). Além disso, como mencionado anteriormente nessa discussão, é imprescindível realizar ensaios como imunoprecipitação, “pull-down” e TAP-TAG, por exemplo, para verificar a capacidade de interação desses fatores com outros já descritos ou mesmo proteínas ainda não descritas. Os resultados obtidos nesse trabalho e outros que o
sucederem se provam assim importantes no auxílio da caracterização de fatores relevantes para a iniciação da tradução, e seu controle, nos tripanossomatídeos.