Análise da expressão e localização subcelular dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 do fator de iniciação da tradução eIF4G de Trypanosoma brucei

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA. ANÁLISE DA EXPRESSÃO E LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DOS HOMÓLOGOS TbEIF4G1 e TbEIF4G2 DO FATOR DE INICIAÇÃO DA TRADUÇÃO eIF4G de Trypanosoma brucei. Rodrigo Pontes de Lima. Recife, PE 2009.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA. Rodrigo Pontes de Lima. ANÁLISE DA EXPRESSÃO E LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DOS HOMÓLOGOS TbEIF4G1 e TbEIF4G2 DO FATOR DE INICIAÇÃO DA TRADUÇÃO eIF4G de Trypanosoma brucei. Dissertação apresentada ao Curso de Pósgraduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) como um dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Genética.. Orientador: Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto. RECIFE, 2009.

(3) Lima, Rodrigo Pontes de Análise da expressão e localização subcelular dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 do fator de iniciação da tradução eIF4G de Trypanosoma brucei / Rodrigo Pontes de Lima. – Recife: O Autor, 2009. 102 folhas: il., tab. Orientador: Osvaldo Pompílio de Melo Neto. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Programa de PósGraduação em Genética, 2009. Inclui bibliografia. 1. Trypanossoma brucei - Genética 2. Trypanossoma brucei Clonagem 3. Tripanossom íase Africana 4. Doença do Sono I Título. 579.4 CDD(22.ed.). UFPE CCB – 2009- 179.

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(5) AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu orientador, Dr. Osvaldo, pela oportunidade dada e por ser um exemplo de pesquisador consciente, ético e dedicado e pelo amor ao seu objeto de trabalho, uma característica nem sempre encontrada entre os pesquisadores, mas muito, muito valiosa. Aos órgãos fomentadores de pesquisa, sem os quais seria muito mais difícil a realização de pesquisa científica no Brasil. Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, com todos os seus trabalhadores, onde esse trabalho foi realizado. Em especial aos integrantes do Departamento da Microbiologia, do NIT e do Biotério, bem como aos da Entomologia, Imunologia, LaViTE: obrigado pelo apoio sempre diligente e carinhoso (sem vocês seria difícil a realização de tudo o que foi feito aqui). Ao Departamento de Genética, onde foi desenvolvido o Mestrado, pelos conhecimentos obtidos e pela oportunidade. Aos meus familiares e amigos (todos) pelo suporte emocional, pois SEMPRE estavam perto quando precisei de ouvidos pra reclamar de experimentos que não davam certo e conselhos pra seguir em frente. Agradeço aqueles que sabem que são meus amigos e os que não sabem, pois embora não saibam, tem o meu afeto e lhes dou o mesmo valor. E finalmente, mas não menos importante, a Deus. Pois sem Ele, não haveria criação e não haveria o que estudar. Sou grato também por ter colocado no coração das pessoas a dúvida, a curiosidade, o inconformismo e o medo da morte, o que fez com os humanos criassem todas as Ciências e, dentre essas, a que eu humildemente estudo: a Genética..

(6) DEDICATÓRIA. Às pessoas sempre presentes em meu coração. Todas fizeram parte da minha vida e deixaram sua marca indelével no tempo, no espaço e na minha história. Em especial, uma que se foi durante o desenvolvimento deste trabalho, mas que como todas as demais que eu amo, não sai da minha alma..

(7) “Os escritos são a descendência da alma assim como as crianças o são do corpo”. (Clemente de Alexandria) “O coração de um homem é uma roda de moinho que trabalha sem cessar; se nada for jogado para moer correrá o risco de que ele triture a si mesmo”. (Lutero).

(8) ÍNDICE. AGRADECIMENTOS .......................................................................................................... IV DEDICATÓRIA ...................................................................................................................... V 1. LISTA DE FIGURAS E TABELAS ............................................................................. VIII 1. 1. Figuras ....................................................................................................................... VIII 1. 2. Tabelas..........................................................................................................................IX 2. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................................ X 3. RESUMO...........................................................................................................................XII 3. 1. Resumo ....................................................................................................................... XII 3. 2. Abstract...................................................................................................................... XIII 4. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................14 5. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..........................................................................................16 5. 1. Ordem Kinetoplastida e Família Tripanosomatidae.....................................................16 5. 2. Trypanosoma brucei .....................................................................................................17 5. 3. Doença do sono ............................................................................................................18 5. 3. 1. Epidemiologia.......................................................................................................18 5. 3. 2. Sintomatologia......................................................................................................20 5. 3. 3. Ciclo de vida.........................................................................................................22 5. 4. Biologia molecular dos tripanossomatídeos .................................................................23 5. 4. 1. Regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos.......................................23 5. 4. 2. Organização do genoma .......................................................................................24 5. 4. 3. RNA polimerases..................................................................................................26 5. 4. 4. Processamento em trans (trans-splicing) e poliadenilação dos mRNAs..............28 5. 4. 5. Degradação de mRNAs e grânulos de estresse e P-bodies...................................29 5. 5. Síntese protéica em eucariotos .....................................................................................31 5. 5. 1. Complexo eIF4F e PABP .....................................................................................33 5. 5. 2. Fator eIF4G ..........................................................................................................36 5. 6. Iniciação da tradução em tripanossomatídeos ..............................................................38 6. OBJETIVOS .......................................................................................................................42 6. 1. Objetivo Geral ..............................................................................................................42 6. 2. Objetivos específicos....................................................................................................42 7. MATERIAIS E MÉTODOS ..............................................................................................43 7.1. Extração de DNA genômico total de Trypanosoma brucei...........................................43.

(9) 7. 2. Amplificação dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD......................................................................................................................44 7.3. Eletroeluição dos fragmentos amplificados por PCR....................................................47 7.4. Clonagem no vetor plasmidial pGEM T Easy...............................................................48 7.5. Extração de DNA plasmidial.........................................................................................49 7. 6. Análise de seqüências dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 clonados............................50 7.7. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a ........................................................................52 7. 8. Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis, TbEIF4G26xHis, TbEIF4G1HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis em Escherichia coli...............................................................54 7. 9. Purificação das proteínas TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis ............................55 7. 10. Imunização de coelhos para obtenção do soro policlonal ..........................................56 7. 11. Purificação dos anticorpos obtidos por imunoadsorção .............................................57 7. 12. Ensaios de reconhecimento das proteínas recombinantes pelo soro policlonal .........58 7.13. Ensaios de Imunocitoquímica......................................................................................59 7. 14. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 no vetor p2216 .............................60 7.15. Superexpressão dos fatores in vivo fusionados a proteína fluorescente amarela (EYFP)..................................................................................................................................61 8. RESULTADOS ...................................................................................................................63 8. 1. Análise das seqüências dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 do fator de iniciação da tradução eIF4G encontrados em Trypanosoma brucei ....................................................63 8. 2. Amplificação dos fragmentos TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y ..............................................................................................67 8. 3. Clonagem no vetor plasmidial pGEM T Easy..............................................................72 8. 4. Análise de seqüências dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 clonados em vetor plasmidial pGEM T Easy .....................................................................................................74 8. 5. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a ........................................................................76 8. 6. Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis, TbEIF4G26xHis, TbEIF4G1HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis em Escherichia coli...............................................................78 8. 7. Purificação das proteínas TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis ............................80 8. 8. .Ensaios de reconhecimento das proteínas recombinantes pelo soro policlonal ..........81 8. 9. Ensaios de Imunocitoquímica......................................................................................84 8. 10. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 no vetor plasmidial p2216 ...........85 8. 11. Ensaios de Superexpressão do TbEIF4G2Y fusionado à EYFP................................86 9. DISCUSSÃO .......................................................................................................................88 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................92 Referências eletrônicas:......................................................................................................100.

(10) Lima, R. P.. VIII. 1. LISTA DE FIGURAS E TABELAS. 1. 1. Figuras Figura 1: Cinetoplasto de Trypanosoma lewisi ......................................................................16 Figura 2: Trypanosoma brucei ................................................................................................18 Figura 3: Distribuição e prevalência da doença do sono......................................................19 Figura 4: Mosca tsetsé .............................................................................................................20 Figura 5: Distribuição do T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense...............................21 Figura 6: Ciclo de vida do T. brucei .......................................................................................23 Figura 7: Disposição policistrônica dos genes nos cromossomos dos tripanossomatídeos 26 Figura 8: Região STS e áreas de iniciação da transcrição ...................................................27 Figura 9: Acoplamento de trans-splicing e poliadenilação em tripanossomatídeos...........28 Figura 10: Vias de degradação do mRNA em eucariotos ....................................................30 Figura 11: Esquema simplificado da iniciação da tradução ................................................32 Figura 12: Esquema da atuação do fator eIF4F, eIF4B e PABP na iniciação da tradução...........................................................................................................................34 Figura 13: Circularização do mRNA pela interação dos eIF4E e PABP via eIF4G .........36 Figura 14: Esquema do fator eIF4GI.....................................................................................38 Figura 15: Esquema da clonagem dos fragmentos TbEIF4G1 e TbEIF4G1-HD no vetor plasmidial pET21a..........................................................................................................53 Figura 16: Esquema da clonagem dos fragmentos TbEIF4G2Y e TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a..........................................................................................................53 Figura 17: Esquema da subclonagem dos fragmentos TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y no vetor plasmidial p2216 .............................................................................................................60 Figura 18: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do EIF4G1 dos bancos de dados de genoma de T. brucei, T. cruzi e L. major ..................................................................65 Figura 19: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do EIF4G2 dos bancos de dados de genoma de T. brucei, T. cruzi e L. major ..................................................................66 Figura 20: Extração de DNA genômico total de Trypanosoma brucei ................................68 Figura 21: Amplificações por PCR dos fragmentos TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y .............................................71 Figura 22: Eletroeluição dos fragmentos amplificados TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y .............................................72 Figura 23: Digestão das clonagens em pGEM T Easy com as enzimas de restrição BamH I e Hind III.......................................................................................................................74.

(11) Lima, R. P.. IX. Figura 24: Eletroeluição das digestões das construções plasmidiais com pGEM T Easy..................................................................................................................................77 Figura 25: Digestão das clonagens em pET21a com as enzimas de restrição BamH I e Hind III e Hind III e Not I..............................................................................................78 Figura 26: Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis, TbEIF4G16xHis, TbEIF4G2-HD6xHis e TbEIF4G26xHis..............................................................................79 Figura 27: Purificação das proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD 6xHis com resina de Níquel em condições desnaturantes ..............................................81 Figura 28: Reconhecimento das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis e TbEIF4G1HD6xHis e TbEIF4G26xHis e TbEIF4G2-HD6xHis por seus respectivos anti-soros purificados.......................................................................................................................82 Figura 29: Reconhecimento das proteínas nativas TbEIF4G1 (A) e TbEIF4G2 (B) por seus respectivos anti-soros purificados.........................................................................83 Figura 30: Ensaio de imunocitoquímica dos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 nas células procíclica de T. brucei ......................................................................................................................84 Figura 31: Eletroeluição dos fragmentos TbEIF4G1Y, TbEIF4G2Y e p2216 digeridos....85 Figura 32: Digestão das clonagens TbEIF4G1Y/p2216 e TbEIF4G2Y/p2216 com as enzimas de restrição Hind III e BamH I.......................................................................86 Figura 33: Ensaio de superexpressão do TbEIF4G2 fusionado à EYFP nas células procíclica de T. brucei.....................................................................................................87. 1. 2. Tabelas Tabela 1: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e do domínio HEAT TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD.............................46 Tabela 2: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos genes TbEIF4G1 (TbEIF4G1Y) e TbEIF4G2 (TbEIF4G2Y) com sítios de enzimas próprios para clonagem no p2216 .........................................................................................................47 Tabela 3: Seqüência dos primers utilizados para sequenciamento dos fragmentos TbEIF4G1 e TbEIF4G1Y clonados no vetor palsmidial pGEM T Easy ....................51 Tabela 4: Seqüência dos primers utilizados para sequenciamento do fragmento TbEIF4G2Y clonado no vetor palsmidial pGEM T Easy............................................51 Tabela 5: Fragmentos amplificados com seus respectivos sítios de restrição, tamanho, posição na seqüência original e vetor de destino .........................................................69 Tabela 6: Polimorfismos encontrados para seqüência do gene TbEIF4G1 em relação à depositada em banco de dados de genoma de T. brucei ..............................................75 Tabela 7: Polimorfismos encontrados para seqüência do gene TbEIF4G2 em relação à depositada no banco de dados de genoma de T. brucei ...............................................76.

(12) Lima, R. P.. X. 2. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. 4E-BP. eIF4E Binding Protein – Proteína de ligação ao eIF4E. aa. aminoácido. BSA. Bovine Serum Albumin – Albumina bovina sérica. Dcp. Decapping protein – Proteína de decapeamento. D.O.. Densidade Ótica. EDTA. Ethylenediaminetetraacetic Acid – Ácido etilenodiaminotetraacético. EF. Elongation Factor – Fator de elongação. eIF. eukaryotic Initiation Factor – Fator de iniciação eucariótico. EJC. Exon Junction Complex – Complexo de junção dos éxons. EYFP. Enhanced Yellow Fluorescent Protein – Proteína fluorescente amarela de expressão aumentada. HAT. Human African Trypanosomiasis – Tripanossomíase africana humana. HD. HEAT Domain – Domínio HEAT. HEAT. Huntinting, EF3, PR/65A, e Target of rapamicin 1. HSP. Heat Shock Protein – Proteína de choque térmico. IgG. Imunoglobulina G. IPTG. Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo. IRES. Internal Ribosome Entry Site – Sítio Interno de Entrada Ribossomal. LB. meio Luria Bertani. m7GTP. cap 7-metilguanosine-triphosphate – cap 7-metilguanosina-trifosfato. Met-tRNAiMet Metionil-tRNA iniciador Mnk. MAP-kinase signal-integrating kinases – Proteína MAP quinase de integração de sinal. nt. nucleotídeo(s). PABP. Poli(A) Binding Protein – Proteína de Ligação à Cauda Poli(A). PBS. Phosphate Buffered Saline – Tampão Fosfato Salino. PVDF. Fluoreto de Polivinilideno. RHS. Retrotransposons Hot Spot – Domínios hot spots de retrotransposons. RNA pol. RNA polymerase – RNA polimerase. SDS-PAGE. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis –.

(13) Lima, R. P.. XI. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio SL RNA. RNA Spliced Leader. STS. Strand Switch Region – Região de troca de fita. TBP. TATA Binding Protein – Proteína de ligação ao motivo TATA. TBS. Tris-Buffered Saline – Tampão salino de tris. TBE. Tampão Tris-Borato-EDTA. TE. Tampão Tris-EDTA. Tritryp. Tri-Trypanosomatidae. VSG. Variant Surface Glycoprotein - Glicoproteína variante de superfície. WHO. World Health Organization – Organização Mundial da Saúde. Xrn1. exorribonuclease 1.

(14) Lima, R. P.. XII. 3. RESUMO 3. 1. Resumo Os tripanosomatídeos, agentes causadores de enfermidades de impacto mundial, se destacam dos demais eucariotos por apresentarem um conjunto de processos moleculares únicos, inclusive a ausência de controle da sua transcrição. Dessa forma, o controle de sua expressão gênica deve ocorrer após a transcrição. Assim, um ponto importante de controle é a iniciação da tradução, um processo ainda pouco conhecido nos tripanosomatídeos. Em eucariotos, de forma geral, esta começa com a ligação ao mRNA do complexo eIF4F, formado pelos polipeptídeos: eIF4E, eIF4A e eIF4G. A subunidade eIF4G atua como proteína estruturadora do complexo se ligando às demais subunidades e a outros fatores de tradução. Em Trypanosoma brucei foram identificados cinco homólogos do eIF4G, conservados em Leishmania major, denominados de TbEIF4G1-5. Este trabalho buscou contribuir com a caracterização dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 a partir da amplficação e clonagem dos seus genes, completos e/ou fragmentos contendo seu domínio HEAT central, em vetor de expressão bacteriano. A análise das sequências clonadas apresentou divergências genéticas em relação às descritas na literatura, mas, a princípio, de baixo significado biológico. Em seguida, realizou-se a expressão das respectivas proteínas recombinantes e obtenção de soro policlonal em coelhos. Estes soros foram utilizados em ensaios de “western-blot” e imunocitoquímica para analisar a expressão das proteínas nativas e sua localização subcelular. Os mesmos genes foram também clonados em vetor plasmidial para superexpressão da proteína recombinante fusionada à EYFP em T. brucei. Observou-se que o TbEIF4G1 é expresso na fase procíclica, mas é raro ou ausente na sanguínea. Já o TbEIF4G2 é expresso raramente ou ausente em ambas as fases. Ambas as proteínas se mostraram exclusivamente citoplasmáticas, o que reforça um papel na tradução que merece ser melhor estudado com as ferramentas, proteínas e anticorpos, produzidos neste estudo..

(15) Lima, R. P.. XIII. 3. 2. Abstract. The trypanosomatids, the causative agents of various diseases of worldwide impact, are distinguished from other eukaryotes by the unique molecular processes which they possess, including lack of regulation of their gene transcription. Thus, control of gene expression occurs post-transcriptionally. A relevant target for regulation mechanism would be the initiation of translation, a process still not well known in trypanosomatids. In eukaryotes, in general, translation starts with the binding to the mRNA of the eIF4F complex, formed by the polypeptides eIF4E, eIF4A and eIF4G. The eIF4G subunit is a scaffolding protein which binds to the other subunits of the complex as well as to other translation initiation factors. In Trypanosoma brucei five eIF4G homologues have been identified, all conserved in Leishmania major, named TbEIF4G1-5. This study aimed to contribute to the characterization of the homologues TbEIF4G1 and TbEIF4G2 through the amplification and cloning of their genes, full length or fragments containing the central HEAT domain, in a bacterial expression vector. Analysis of the cloned sequences confirmed several polymorphisms in comparison with the ones described in the literature, but of little biological significance. Subsequently the respective recombinant proteins were expressed and used to produce polyclonal sera in rabbits. These were used in western-blots and immunocytochemistry assays to analyse the expression of the native proteins and their subcellular localization. Both genes were also cloned in a plasmid vector for overexpression in T. brucei of recombinant proteins fused with EYFP. TbEIF4G1 was found to be expressed in the procyclic but not in the bloodstream phase of the parasite life cycle. TbEIF4G2 is rarely expressed or absent in both phases. Both proteins are exclusively cytoplasmic, implying a role in translation which needs to be better investigated with the tools, proteins and antibodies, generated in this study..

(16) Lima, R. P.. 14. 4. INTRODUÇÃO Os tripanossomatídeos são protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida e estão agrupados na família Trypanosomatidae. Seus representantes mais conhecidos são espécies patogênicas pertencentes aos gêneros Trypanosoma e Leishmania, devido ao impacto na saúde pública que as doenças causadas por esses parasitas provocam. Esses organismos são agentes de diferentes enfermidades tropicais, como a doença do sono (Trypanosoma brucei), doença de Chagas (Trypanosoma cruzi), e as diversas formas de Leishmaniose (Leishmania sp.). Tais enfermidades apresentam-se como grave problema devido, principalmente, ao difícil controle e tratamento pouco eficaz. Por isso, avanços nestes campos demandam ainda um maior conhecimento da biologia básica do seu agente patogênico. Os tripanossomatídeos possuem um conjunto de características metabólicas que os diferenciam dos demais eucariotos entre as quais se destaca a ausência de regulação da expressão gênica em nível transcricional. Portanto, devido às grandes modificações bioquímicas e morfológicas que esses organismos sofrem na alternância entre os diferentes hospedeiros, essa regulação tem de ocorrer em nível pós-transcricional, seja por estabilidade do RNA mensageiro (mRNA), por regulação da taxa de degradação do mesmo, ou por controle da sua tradução em proteínas. A tradução, apesar de bem descrita em plantas, mamíferos e leveduras, não se encontra completamente caracterizada nos tripanossomatídeos. Nos eucariotos de forma geral, ela se inicia pela ligação e reconhecimento do mRNA pelo complexo de iniciação da tradução eIF4F que sinaliza para o recrutamento da subunidade menor ribossomal 40S. O eIF4F é um complexo heterotrimérico composto pelas subunidades polipeptídicas: eIF4E, eIF4A e eIF4G. O eIF4G é a proteína ancoradoura, estruturadora do complexo, que interage com as demais subunidades do eIF4F, bem como com o mRNA e outros fatores que atuam na iniciação da tradução..

(17) Lima, R. P.. 15. Com a publicação do resultado do projeto genoma de tripanossomatídeos, foram identificados possíveis homólogos de vários fatores atuantes da tradução, entre os quais 5 homólogos para o eIF4G. A presença desses múltiplos homólogos endossa a hipótese de que haja certa complexidade na iniciação da tradução, sendo a função destas proteínas um ponto importante de controle da expressão gênica nesses parasitas. Assim, com o intuito de contribuir na caracterização da iniciação da tradução nesses parasitas, este trabalho visou o estudo da localização subcelular de dois dos possíveis homólogos ao fator de iniciação eIF4G em T. brucei, TbEIF4G1 e TbEIF4G2. Para isso, o trabalho contemplou a clonagem dos genes completos correspondentes, e/ou fragmentos destes, em vetor de expressão e produção das respectivas proteínas recombinantes em Escherichia coli. Os fragmentos clonados foram seqüenciados para verificação da ocorrência de polimorfismos em domínios funcionais em potencial. As proteínas recombinantes foram utilizadas na produção de soro policlonal que subsequentemente serviram de ferramenta em ensaios de imunocitoquímica. Os genes foram clonados também em vetor para superexpressão de proteína recombinante fusionada à proteína fluorescente amarela (EYFP) em T. brucei para corroborar a localização subcelular das respectivas proteínas por outra técnica distinta. Os resultados obtidos são importantes para entendimento da função que essas proteínas desempenham no metabolismo dos tripanossomatídeos..

(18) Lima, R. P.. 16. 5. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 5. 1. Ordem Kinetoplastida e Família Tripanosomatidae Os kinetoplastídeos são protozoários flagelados pertencentes à ordem Kinetoplastida, a qual abrange desde organismos de vida livre a parasitas obrigatórios (SIMPSON, STEVENS e LUKES, 2006). Esses protozoários possuem várias organelas e estruturas citoplasmáticas especiais, tais como peroxissomos, acidocalcissomos, bolso flagelar, reservossomo e megassomo (DE SOUZA, 2002), mas a sua organela mais marcante, que os distingue e de onde advém a denominação da ordem, é o cinetoplasto, uma região rica em DNA, presente na única mitocôndria desses organismos (STUART et al., 2008). O cinetoplasto (figura 1) se apresenta como uma rede de DNA interligado composta por milhares de cadeias menores, denominadas minicírculos, entrelaçadas a dúzias de cadeias maiores, maxicírculos. Os maxicírculos são responsáveis pela codificação de enzimas mitocondriais essenciais e rRNA e os minicírculos codificam os RNAs mitocondriais envolvidos principalmente na etapa de edição (LIU et al., 2005; LUKES, HASHIMI e ZÍKOVÁ, 2005).. Figura 1: Cinetoplasto de Trypanosoma lewisi. A seta indica o cinetoplasto, estrutura em forma de disco formada pela ligação das diversas cadeias que formam a rede de DNA. Fonte: Adaptado de BUCKELEW, 2009..

(19) Lima, R. P.. 17. Dentre os kinetoplastídeos, destaca-se a família Trypanosomatidae devido aos gêneros Trypanosoma e Leishmania. Estes incluem importantes patógenos de animais domésticos e humanos, por causarem enfermidades tropicais de caráter endêmico e de grande incidência (ZELEDÓN, 1996). Ambos os gêneros apresentam como características comuns sua organização genômica e estruturas celulares similares, assim como ciclo de vida digenético, envolvendo dois hospedeiros: um invertebrado e outro vertebrado. Devido à grande diferença entre esses hospedeiros, os parasitas sofrem importantes mudanças morfológicas e metabólicas durante seus ciclos de vida (STUART et al., 2008).. 5. 2. Trypanosoma brucei Do gênero Trypanosoma, destacam-se duas espécies patogênicas ao homem, o T. brucei, causador da Tripanossomíase Humana Africana (HAT, do inglês: Human African Trypanosomiasis), também denominada doença do sono, e o T. cruzi, agente etiológico da Tripanossomíase Humana Americana, ou doença de Chagas, que diferem em sintomatologia, hospedeiro invertebrado (inseto vetor), habitat natural e distribuição geográfica (BARRET et al., 2003). A espécie T. brucei (figura 2) pode ser subdividida em três sub-espécies: T. b. gambiense, T. b. rhodesiense e T. b. brucei, das quais apenas as duas primeiras têm o homem como hospedeiro. Essas subespécies são morfologicamente indistinguíveis entre si (DESPOMMIER, CHEN, e MURAKAMI, 2004). Todas possuem pleomorfismo, medindo entre 15-42 µm comprimento (30µm em média), cinetoplasto pequeno e flagelo. Diferenciamse do T. cruzi por possuírem uma região terminal posterior mais arredondada (ZELEDÓN, R. 1996)..

(20) Lima, R. P.. 18. Figura 2: Trypanosoma brucei. Foto de microscopia eletrônica de Trypanosoma brucei. Fonte: BROADHEAD et al., 2006.. Uma característica interessante do T. brucei é a expressão de glicoproteínas variantes de superfície (VSG, do inglês: Variant Surface Glycoprotein) apresentadas exclusivamente na fase tripomastigota (sanguínea). O parasita é coberto em grande parte de sua membrana por esse antígeno que é mudado com determinada freqüência, em diferentes isoformas sucessivamente, levando à variação antigênica que possibilita a evasão do parasita às respostas desenvolvidas pelo sistema imune do hospedeiro vertebrado. A expressão de VSG cessa quando o parasita deixa a corrente sanguínea e passa a habitar o trato digestivo do inseto vetor (CUMMINGS e SALVATORE, 2009; MACHADO et al., 2006).. 5. 3. Doença do sono 5. 3. 1. Epidemiologia A doença do sono é fatal se não tratada, ocorre em 36 países da África subSaariana, e é considerada a terceira doença parasitária mais importante, depois da malária e da esquistosomose (KENNEDY, 2008). Desses 36 países, em 3 a doença possui caráter epidêmico; em 8, endêmico; em 10, há endemicidade moderada e nos 15 restantes, não é mais registrada transmissão da doença há décadas. Não obstante, há grande dificuldade de relatar o.

(21) Lima, R. P.. 19. real estado epidemiológico dos países devido à falta de vigilância epidemiológica eficaz e à dificuldade de diagnóstico (WHO, 2006a) (figura 3).. Distribuição mundial da doença do sono Caráter epidêmico Endêmico Endemicidade baixa Ausência da doença. Figura 3: Distribuição e prevalência da doença do sono. A HAT se restringe à África, especificamente África subSaariana, devido à presença exclusiva do inseto vetor nessa área. Fonte: Adaptado de WHO, 2009a.. A doença é veiculada por insetos de espécies pertencentes ao gênero Glossina (mosca tsetsé) (figura 4), estritamente hematófaga, tanto os machos quanto as fêmeas do gênero, e sua área geográfica de incidência corresponde às regiões de distribuição da mosca, encontradas em diferentes habitats de acordo com sua espécie: em vegetações adjacentes a rios e lagos, em matas de galeria e em savanas (GOODING, HAINES e PEARSON, 2005). Entretanto, por fatores desconhecidos, existem locais onde as moscas são encontradas, mas a doença não se dissemina (WHO, 2006a)..

(22) Lima, R. P.. 20. Figura 4: Mosca tsetsé. O vetor da Tripanossomíase africana, um inseto do gênero Glossina, realizando repasto sanguíneo em humano. Fonte: BYGOTT, 2009.. Em 2006, estimou-se que o nível de infecção chegara a 300.000 novos casos, dos quais 25.000 foram notificados (WHO, 2006b). Em 2000, acreditava-se que entre 50 e 60 milhões de pessoas viviam em áreas de risco nos 260 focos existentes espalhados por essas regiões. Ainda assim, grande parte das pessoas infectadas não são diagnosticadas e tratadas, devido à dificuldade de acesso a centros diagnósticos e do serviço de controle epidemiológico à população por causa da característica rural da mesma (WHO, 2009a).. 5. 3. 2. Sintomatologia A doença do sono pode ser dividida em duas formas clínicas segundo a subespécie que a causa: a forma aguda, que tem como agente etiológico o T. brucei rhodesiense e ocorre nas regiões setentrional e oriental da África, e a crônica, causada pelo T. brucei gambiense, presente nas regiões central e ocidental (figura 5) (BARRET et al., 2003). Essa prevalência geográfica das formas se deve à distribuição dos subgrupos de mosca tsetsé que cada subespécie de tripanossoma está adaptada a ter como seu hospedeiro invertebrado (DESPOMMIER, CHEN, e MURAKAMI, 2004; ZELEDÓN, R. 1996). A terceira.

(23) Lima, R. P.. 21. subespécie, o T. brucei brucei, o qual é incapaz de infectar humanos, é responsável por uma patologia letal em gado, conhecida como “Nagana”, apresentando forte impacto econômico (WHO, 2009b).. Distribuição das formas da HAT T. brucei gambiense T. brucei rhodesiense. Figura 5: Distribuição do T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense. As distintas formas clínicas da doença do sono se distribuem em regiões diferentes: a forma crônica, causada pelo T. brucei gambiense, na região subSaariana centro-ocidental, e a forma aguda, causada pelo T. brucei rhodesiense, na meridio-oriental. Fonte: Modificado de KENNEDY, 2008.. A diferença entre as duas formas clínicas deve-se à velocidade da progressão dos sintomas, visto que em ambas os sinais e sintomas desenvolvidos são similares. A infecção crônica humana pode levar anos sob a forma latente, enquanto a aguda evolui em poucas semanas ou meses. Essas formas também podem ser subdivididas em duas fases de acordo com a localização do parasita no organismo e com os sintomas apresentados: a presença do parasita na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado causa os sintomas da fase precoce,.

(24) Lima, R. P.. 22. conhecida como fase hemolinfática, enquanto a sua travessia pela barreira hematoencefálica e instalação no sistema nervoso central caracteriza a fase neurológica (WHO, 2006a). A fase hemolinfática compreende nos primeiros dias anemia e o cancro tripanosômico (cancro de inoculação), este último devido à proliferação do tripanossoma no sítio de inoculação e reação inflamatória local. Decorridos vários dias da infecção pelo parasita, são observados cefaléia, vertigens, febre, dores articulares e musculares e linfonodos aumentados. Um sinal clínico característico da fase precoce da doença é a tumefação dos linfonodos cervicais, conhecido como sinal de Winterbottom (REY, 2001). Na fase neurológica ou encefálica, estado avançado da doença, podem ser verificadas desordens psiquiátricas, de sono, motoras, sensoriais e reflexos anormais culminando, em geral, com coma e morte. Entretanto, ainda é discutido se estes sintomas seriam devidos à ação do parasita ou às respostas do sistema imune do próprio hospedeiro (KENNEDY, 2006).. 5. 3. 3. Ciclo de vida O T. brucei é um organismo heteroxênico necessitando de dois hospedeiros, um vertebrado e outro invertebrado, para realizar todo o seu ciclo de vida. A transmissão do parasita se inicia com a picada da mosca tsetsé infectada, durante repasto sanguíneo, no qual ocorre a inoculação intradérmica de formas tripomastigostas metacíclicas (infectantes) do tripanossoma. Estas logo se diferenciam na forma sanguínea, alongada e delgada, e se multiplicam por divisão binária no espaço intersticial, podendo ocasionar a formação do cancro de inoculação. Os parasitas então migram para a linfa e posteriormente para a corrente sanguínea. No sangue, o tripanossoma pode atravessar a barreira hemato-encefálica e se alojar no sistema nervoso central, quando causa as complicações neurais. Os tripanossomas que permanecem na corrente sanguínea podem se diferenciar em formas menores que não se dividem, capazes de infectar o inseto durante seu repasto. No inseto vetor, após ingeridas,.

(25) Lima, R. P.. 23. estas formas se desenvolvem em tripomastigotas procíclicas, e se dividem por cerca de 10 dias quando migram do intestino médio para as glândulas salivares do vetor e diferenciam em epimastigotas. Lá se multiplicam até se desenvolverem em tripomastigotas metacíclicas, novamente com capacidade infectiva para hospedeiros vertebrados, e reiniciam o ciclo ao serem inoculados pela mosca (figura 6). Em todas essas fases a reprodução desses organismos é por divisão binária e eles apresentam parasitismo extracelular, diferentemente dos T. cruzi e Leishmania sp. (DESPOMMIER, CHEN, e MURAKAMI, 2004).. Figura 6: Ciclo de vida do T. brucei. O ciclo pode ser dividido entre as fases do vetor e do hospedeiro vertebrado (metades superior e inferior da ilustração, respectivamente). Observam-se as formas epimastigota, presente apenas no hospedeiro invertebrado, na glândula salivar da mosca tsetsé (setas pretas) e a tripomastigota, representada no restante da imagem. Fonte: TDR, 2009.. 5. 4. Biologia molecular dos tripanossomatídeos 5. 4. 1. Regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos Os tripanossomatídeos atraem um interesse especial devido ao seu parasitismo obrigatório a diversos vertebrados. Além do que esses organismos se destacam dos demais.

(26) Lima, R. P.. 24. devido à presença de diversas características em sua biologia molecular que, apesar de algumas serem encontradas também em outros eucariotos, apresentam-se agrupadas de forma única nesses parasitas. É o caso da edição de RNAs, a transcrição policistrônica e o transsplicing (CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003). Não obstante, sua particularidade mais marcante é que, diferentemente da grande maioria dos outros eucariotos, a regulação da expressão gênica nos tripanossomatídeos não é determinada qualitativamente no nível da iniciação da transcrição (CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003). Isto é evidenciado devido à escassez de promotores clássicos para RNA polimerase II (RNA pol II) (CLAYTON, 2002). Visto que os tripanossomatídeos apresentam transcrição policistrônica constitutiva de seus genes, não sendo verificada transcrição diferencial entre as distintas fases de seu ciclo de vida, caracterizadas por grandes dessemelhanças metabólicas (COHEN-FREUE et al., 2007; MARTINEZ-CALVILLO et al., 2004), os mecanismos que diferenciam a expressão de RNAs estágio-específicos são eventos de processamento do mesmo e outros eventos póstranscricionais, que também podem alterar a estabilidade dos mRNAs, e a sua tradução (CLAYTON, 2002). Apesar dessa forma de controle da expressão gênica parecer um desperdício energético, devido à manutenção de uma transcrição constitutiva, é possível que o fornecimento contínuo desses transcritos possibilite uma rápida adaptação ao meio, auxiliando a sobrevivência do organismo frente a alterações ambientais (PALENCHAR e BELLOFATTO, 2006).. 5. 4. 2. Organização do genoma Os tripanossomatídeos apresentam uma grande quantidade de genes conservados entre diferentes espécies, conforme constatado nos genoma dos três tripanossomatídeos mais estudados, T. brucei, T. cruzi e L. major (também chamados de Tritryps), com a finalização.

(27) Lima, R. P.. 25. dos respectivos projetos genomas. Esta observação demonstra um notável grau de conservação ainda que esses organismos tenham divergido entre 200 e 500 milhões de anos atrás (BERRIMAN et al., 2005; EL-SAYED et al., 2005a; IVENS et al., 2005; KISSINGER, 2006). Os genomas dos Tritryps apresentam 22Mb, 33Mb e 55Mb e 9068, 8311 e cerca de 12000 genes para T. brucei, L. major e T. cruzi, respectivamente, dos quais 6158 genes são ortólogos, com 1262 domínios conservados entre as espécies. Apenas 5% dos domínios encontrados são espécie-específicos, o que demonstra a proximidade filogenética desses organismos (KISSINGER, 2006). Não obstante, há notáveis diferenças entre esses parasitas que decorrem, possivelmente, da adaptação a diferentes vetores e tropismo a diferentes tecidos. Assim, em T. brucei há expansão gênica para proteínas que codificam para adenilato e guanilato ciclase e com domínio rico em leucina. Já o T. cruzi apresenta expansões para glicoproteínas semelhantes à mucina, leishmanolisina e domínios hot spot de retrotransposons (RHS). Por fim, em L. major, se observa expansões de famílias de proteínas como carregadores mitocondriais e proteína de choque térmico (HSP) 90 (EL-SAYED et al., 2005b). Os genes das três espécies são arranjados sintenicamente nos cromossomos e transcritos em policístrons, mesmo que não possuam funções preditas relacionadas (GINGER, 2005) (figura 7) e aqueles que necessitam de uma maior quantidade de produto gênico são repetidos em tandem para transcrição de múltiplas cópias de mRNA (IVENS et al., 2005)..

(28) Lima, R. P.. 26. rRNA. RNA pol I. Genes codificantes de proteínas. RNA pol II. tRNA/pequeno RNA (sRNA). RNA pol III. Telômero. Figura 7: Disposição policistrônica dos genes nos cromossomos dos tripanossomatídeos. Os genes são dispostos em seqüência sintênicas similares para T. brucei, T. cruzi e L. major e são transcritos policistronicamente, mesmo que não possuam associação funcional. Modificado de CLAYTON, 2002.. 5. 4. 3. RNA polimerases Em eucariotos são empregadas três diferentes RNA polimerases para transcrever seu DNA nuclear, RNA pol I, II e III. Cada enzima é responsável pela transcrição de diferentes tipos de RNA (como pode ser visualizado na figura 7, acima). Em tripanossomatídeos, essas três enzimas também são encontradas, apesar das diferenças observadas nas maquinarias de transcrição nesses organismos, como a ausência de alguns fatores basais da transcrição (DAS, BANDAY e BELLOFATTO, 2008), e também uma RNA polimerase mitocondrial, (CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003). Além da presença destas três enzimas altamente conservadas, há também conservação da sua função. A RNA pol I transcreve pré-rRNAs e, em T. brucei, VSG e prociclinas (essas últimas expressas apenas quando esse parasita infecta o inseto vetor). Já a RNA pol II sintetiza os mRNAs, como esperado, e o RNA Spliced Leader (SL RNA), que atua no trans-splicing, enquanto que a RNA pol III transcreve tRNAs, 5S RNA (outro rRNA) e snRNAs ricos em Uracila (PALENCHAR e BELLOFATTO, 2006)..

(29) Lima, R. P.. 27. Apesar de verificados promotores para RNA pol I e RNA pol III em T. cruzi, T. brucei e L. major, o mesmo não ocorre para RNA pol II (CLAYTON, 2002). Em um arranjo cromossomal típico, uma grande quantidade de genes codificantes transcritos pela RNA pol II é precedida por uma região não-transcrita de 1-13kb nomeada de região de troca de fitas (STS, do inglês Strand Switch Region) (figura 8). A partir desta, um segundo grupo de genes pode ser codificado na outra fita em sentido contrário. Nesta situação a transcrição de ambos os grupos de genes se inicia bidirecionalmente a partir da região STS, entretanto até o momento não foram verificadas seqüências promotoras em nenhuma STS (MARTINEZCALVILLO et al., 2003; PALENCHAR e BELLOFATTO, 2006). Foi observado ainda que enquanto a transcrição pela RNA pol II se inicia a partir das STS distribuídas ao longo dos cromossomos, ela deve finalizar em áreas onde se inicie a transcrição realizada pela RNA pol I ou III (CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003; MARTINEZ-CALVILLO et al., 2004).. tRNA Genes em policístron transcrito pela RNA pol II. Região STS. Sítio de iniciação de transcrição de RNA pol II. Figura 8: Região STS e áreas de iniciação da transcrição. Vários blocos de genes são encontrados dispostos em volta de seqüências STS, de onde partem bidirecionalmente a transcrição pela RNA pol II. Em geral, a transcrição é terminada próximo aos promotores de RNA pol I e III. Modificado de GINGER, 2005..

(30) Lima, R. P.. 28. 5. 4. 4. Processamento em trans (trans-splicing) e poliadenilação dos mRNAs Na maioria dos eucariotos, após a transcrição de um pré-mRNA monocistrônico, este sofre um processo de cis-splicing (remoção dos íntrons de dentro da seqüência por um complexo denominado spliceossomo), capeamento (inserção de um cap de 7-metilguanosinatrifosfato, m7GTP, na extremidade 5’ do transcrito) e poliadenilação (adição de uma cauda de poliadeninas, cauda poli-A, na região 3’ do pré-mRNA) (MOORE e PROUDFOOT, 2009). Nos tripanossomatídeos o pré-mRNA policistrônico é maturado por processos acoplados de trans-splicing, no qual os transcritos são capeados, e poliadenilação que permitem a clivagem do policístron em monocístrons (HAILE e PAPADOPOULOU, 2007) (figura 9).. ORF I. ORF II. ORF III. DNA. pré-RNA. RNA maduro ORF I. ORF II. ORF III. SL RNA AAA cauda poli-A. Figura 9: Acoplamento de trans-splicing e poliadenilação em tripanossomatídeos. A maturação do prémRNA em tripanossomatídeos passa pelos processos de trans-splicing e poliadenilação para separação das ORFs do mRNA policistrônico. Modificado de CLAYTON, 2002.. O trans-splicing é caracterizado pela adição de uma seqüência de 39 a 41nt, o SL RNA, com uma estrutura cap hipermodificada (o cap4, visto que os 4nt seguintes ao m7GTP.

(31) Lima, R. P.. 29. são modificados) na porção 5’ de cada cístron (ver figura 9). O sítio de splicing é sinalizado por uma curta seqüência de polipirimidinas na região não traduzível do mRNA precursor, e durante o processamento é formada uma estrutura em “Y” que permite tanto a inserção do cap no transcrito quanto a retirada da região do pré-mRNA que não estará presente no mRNA maduro (LIANG et al., 2003). A poliadenilação por sua vez é a adição de uma seqüência de adeninas na porção 3’ de um mRNA anterior, sendo esta adição sinalizada pela inserção do SL RNA na 5’-UTR do mRNA seguinte (ver figura 9). A poliadenilação também ocasiona a separação dos mRNAs anterior e posterior (LEBOWITZ, 1993; MATTHEWS, TSCHUDI e ULLU, 1994; LIANG et al., 2003) e ocorre entre 80 e 140nt de distância do sinal de splicing para o SL RNA (BENZ et al., 2005). Apesar de rara, foi também observada a presença de íntrons em genes de tripanossomatídeos, apenas quatro exemplos nos três genomas, o que evidencia uma importância muito reduzida do cis-splicing e corrobora a importância do trans-splicing para esses parasitas (GINGER, 2005).. 5. 4. 5. Degradação de mRNAs e grânulos de estresse e P-bodies Outros mecanismos importantes pós-transcricionais e que podem desempenhar uma função imprescindível no controle da expressão gênica nos kinetoplastídeos são aqueles responsáveis pela degradação do mRNA e que alteram seu tempo de vida (CLAYTON et al., 2008). Em organismos eucarióticos, de forma geral, essa degradação pode ocorrer em duas vias. A primeira é iniciada pela desadenilação do mesmo por uma poli-A nuclease e posterior decapeamento, pelo complexo Dcp1/Dcp2, e conseqüente degradação do RNA nos sentido 5’3’ pela exorribonuclease Xrn1 (CLAYTON e SHAPIRA, 2007). Já a segunda, também é.

(32) Lima, R. P.. 30. precedida de desadenilação, mas é seguida pela ação do complexo exossomo no sentido 3’-5’ (figura 10) (HAILE e PAPADOPOULOU, 2007).. Degradação 5’-3’. Degradação 3’-5’. Dcp1/Dcp2 Exossomo Xnr1. cap AAAAA cauda poli-A. Região UTR Enzima (ou complexo enzimático). Figura 10: Vias de degradação do mRNA em eucariotos. As duas principais vias de degradação do mRNA em eucariotos, em geral, ocorrem após desadenilação de sua região 3’-UTR. Numa via, ocorre primeiro o decapeamento e posteriormente a degradação no sentido 5’-3’ (ilustração à esquerda), enquanto em outra a continuação se dá pela ação do exossomo (ilustração à direita). Modificado de CLAYTON, 2002.. O modelo atual para esse processo em tripanossomatídeos é similar ao acima descrito envolvendo também duas vias e as principais enzimas envolvidas na degradação são ortólogos daquelas encontradas em outros eucariotos: a via constitutiva, dependente de desadenilação e que opera com cinética reduzida na degradação de mRNAs estáveis e, possivelmente, de uma subpopulação de instáveis; e a via regulada, que é rápida e parece ser independente de desadenilação, com atuação do exossomo e endonucleases, envolvida no controle de qualidade do RNA (HAILE e PAPADOPOULOU, 2007). Uma outra forma de controle da expressão gênica em nível pós-transcricional é a compartimentalização dos mRNAs que não são traduzidos ou são destinados à degradação em.

(33) Lima, R. P.. 31. grânulos de processamento (P-bodies) e de estresse (CLAYTON e SHAPIRA, 2007). Os Pbodies estão envolvidos na degradação desses mRNAs e contem enzimas da via de degradação 5’-3’ (Dcp1/Dcp2 e Xnr). Já os grânulos de estresse são compostos por complexos de iniciação da tradução que tiveram sua atividade interrompida (fatores de iniciação da tradução eIF4E, eIF4A, eIF4G, eIF3, eIF2, subunidade ribossomal 40S e PABP) (BALAGOPAL e PARKER, 2009). Em tripanossomas, foi observada a presença de grânulos semelhantes aos de estresse e P-bodies, entretanto os grânulos de mRNA são formados naturalmente quando o parasita habita no trato intestinal do inseto vetor (CASSOLA, DE GAUDENZI e FRASCH, 2007) e alguns grânulos induzidos por estresse de choque térmico apresentaram uma composição de enzimas diferente do esperado (KRAMER et al., 2008).. 5. 5. Síntese protéica em eucariotos A tradução do mRNA representa um dos últimos pontos da via da expressão gênica, imprescindível para a viabilidade celular, e possui também um importante papel na regulação dessa expressão, visto que esse controle é empregado em uma ampla gama de situações biológicas, servindo inclusive como um ajuste mais preciso do nível de proteínas (GEBAUER e HENTZE, 2004). Dois modos gerais de regulação da tradução podem ser destacados: o global, dirigido à maioria dos mRNAs da célula (ocorre por modificação dos fatores de iniciação da tradução), e o mRNA-específico, dirigido a um grupo definido de mRNAs que são modulados sem afetar a biossíntese geral de proteínas (moderado por complexos protéicos que reconhecem elementos 5’ ou 3’-UTR característicos) (GEBAUER e HENTZE, 2004). A tradução pode ser dividida em três etapas: 1-iniciação, 2-elongação e 3-término e reciclagem. A iniciação da tradução é a etapa mais complexa, mais controlada e mais divergente entre os organismos e tem por funções: evitar a reassociação das subunidades ribossomais livres e regular sua associação ao mRNA; selecionar o aa-tRNA iniciador;.

(34) Lima, R. P.. 32. localizar o códon iniciador (AUG) correto e unir as subunidades ribossomais nesse códon (MARINTCHEV e WAGNER, 2004). Assim, em eucariotos, de forma geral, a etapa de iniciação é caracterizada pela formação do complexo 43S (subunidade menor ribossomal 40S, Met-tRNAiMet e alguns fatores de iniciação da tradução), sua ligação ao mRNA e avanço até o códon iniciador (AUG), quando a subunidade ribossomal maior (60S) se une à menor, formando o ribossomo completo (80S) (figura 11) (MARINTCHEV e WAGNER, 2004; PESTOVA et al., 2001).. (1). (2). Formação do complexo 43S (6). Formação do ribossomo (80S). (5). (3). Formação do complexo 48S (4). Localização do códon iniciador. Figura 11: Esquema simplificado da iniciação da tradução. A etapa da iniciação começa com a formação do complexo 43S (na ilustração, passo 2), prossegue com a ligação desse complexo ao mRNA (3), localização do códon iniciador (4) e finaliza com o desligamento dos fatores associados no complexo (5) e associação da subunidade menor à maior (60S) no códon (6). Modificado de ALGIRE e LORSCH, 2006.. Esse processo de iniciação é resultado da atuação de pelo menos 12 fatores denominados eIFs (do inglês: eukaryotic Initiation Factor), dos quais dois são universalmente conservados e apresentam a mesma função em arqueobactérias, eubactérias e eucariotos. São esses fatores que garantem a correta localização do tRNA iniciador, o metionil-tRNA iniciador (Met-tRNAiMet), no sítio P do ribossomo e seu pareamento com o códon iniciador (ACKER e LORSCH, 2008)..

(35) Lima, R. P.. 33. Resumidamente, a iniciação pode ser descrita e divida em quatro fases (simplificação da iniciação descrita na figura 11): 1. A primeira abrange a formação do complexo ternário eIF2-GTP-Met-tRNAiMet, composto pela união do fator eIF2 ao GTP e ao tRNAi (ilustração da figura 11, passo 1), responsáveis pelo reconhecimento do AUG, e subseqüente ligação aos eIF3, eIF1 e eIF1A e à subunidade menor ribossomal, que resulta na formação do complexo 43S. 2. A segunda fase compreende o recrutamento do 43S para a região 5’-UTR do mRNA, indicada pelo cap, o qual é mediado pelos fatores eIF3, eIF4F e PABP. A união do 43S ao mRNA compõe o complexo 48S. 3. A terceira fase é caracterizada pela varredura da região 5’-UTR do mRNA pelo 48S, que ocorre na presença do eIF4 (eIF4F e eIF4B), até localização do códon iniciador e seu pareamento com o Met-tRNAiMet. 4. E a fase final resulta na desestabilização do 48S com liberação de seus constituintes, exceto a subunidade menor ribossomal (40S) e o tRNAi, que permanecem ligados ao mRNA. Esse evento é sucedido pela ligação da subunidade menor ribossomal à maior (60S) resultando na formação do ribossomo completo (80S), onde se inicia a etapa de elongação (ACKER e LORSCH, 2008; HERSHEY e MERRICK, 2000).. 5. 5. 1. Complexo eIF4F e PABP Os fatores do grupo eIF4 (o eIF4F e o eIF4B) e a PABP (figura 12), que atuam na segunda e terceira fases da iniciação da tradução citadas anteriormente, são responsáveis pelo reconhecimento do mRNA e recrutamento do ribossomo. O complexo eIF4F é composto por três polipeptídeos (ver figura 12), o eIF4E, o eIF4A e o eIF4G, e exerce função primordial na.

(36) Lima, R. P.. 34. atração do ribossomo ao mRNA. Já a PABP (Poly(A) Binding Protein, proteína de ligação à cauda poli(A)) reconhece a cauda poli(A) presente na região 3’-UTR desse (GINGRAS, RAUGHT e SONEMBERG, 1999), enquanto o fator eIF4B atua na estimulação da atividade do eIF4A, apesar de não ser indispensável para a viabilidade celular (OBERER, MARINTCHEV e WAGNER, 2005).. Figura 12: Esquema da atuação do fator eIF4F, eIF4B e PABP na iniciação da tradução. Os nomes dos fatores estão abreviados pela suas finais (4E – eIF4E, 4A – eIF4A, 4G – eIF4G e 4B – eIF4B). O complexo eIF4F é composto dos três fatores eIF4E, eIF4A e eIF4G, que têm papel fundamental no recrutamento do ribossomo para o mRNA. Fonte: SONEMBERG e HINNESBUSCH, 2009.. O fator eIF4E é a subunidade do eIF4F responsável pelo reconhecimento da estrutura cap da região 5’ do mRNA sendo, portanto, indispensável para a tradução cap-dependente. Não obstante, existe também a tradução cap-independente, notadamente em alguns RNAs virais e poucos celulares, na qual o eIF4E não se faz necessário (SONEMBERG e HINNESBUSCH, 2009). Nesse tipo de tradução, a região 5’-UTR do mRNA mimetiza o próprio cap e alguns eIFs, apresentando sítios internos de entrada ribossomal (IRES, do inglês Internal Ribossome Entry Site) que recrutam a subunidade ribossomal 40S diretamente para a região de iniciação (KIEFT, 2008; SONEMBERG e HINNESBUSCH, 2009). O eIF4E apresenta a forma de uma mão em concha com o reconhecimento do cap ocorrendo na parte côncava e a interação com o eIF4G e as 4E-BP (proteínas de ligação ao eIF4E, do inglês eIF4E Binding Protein) na convexa (região dorsal). Ambas proteínas são.

(37) Lima, R. P.. 35. importantes parceiros de ligação e modulação da iniciação da tradução. A tradução é inibida pela ligação do eIF4E às com as 4E-BP, que quando hipofosforiladas inibem sua associação ao eIF4G (RHOADS, 2009), e estimulada pela sua interação com o eIF4G (HAGHIGHAT e SONEMBERG, 1997). Além disso, a afinidade do eIF4E pelo cap também pode ser modulada por fosforilação decorrente da ação das Mnk1 e 2 (MAP-kinase signal-integrating kinases, ou proteínas MAP quinases, que se aproximam do fator via eIF4G) aumentando essa afinidade (GOODFELLOW e ROBERTS, 2008). O fator eIF4A é uma RNA helicase bidirecional ATP-dependente pertencente à superfamília DEAD box de proteínas, responsável pela remoção das estruturas secundárias na região 5’-UTR próximo ao cap (GINGRAS, RAUGHT e SONEMBERG, 1999). Assim, o fator facilita a ligação da subunidade menor ribossomal 40S na região proximal ao cap e promove uma varredura até o códon iniciador, sendo indispensável mesmo se a região contiver pequenos elementos de estruturas secundárias (MARINTCHEV e WAGNER, 2004). A PABP é a proteína responsável pela ligação e reconhecimento da cauda poli(A) presente na extremidade 3’ do mRNA. A cauda poli(A) é adicionada pós-transcricionalmente, por uma poli(A) polimerase que reconhece um sinal de poliadenilação próximo à extremidade 3’ do mRNA. Essa poliadenilação é importante pois atua na exportação do RNA do núcleo, estimula a iniciação da tradução, aumenta a estabilidade do RNA à degradação nucleolítica e, por ser o sítio de ligação da PABP que interage com outros fatores da tradução, modula a síntese protéica (MARINTCHEV e WAGNER, 2004). Além disso, a PABP, ao interagir com o eIF4G e este com o eIF4E, promove a circularização do mRNA, pela aproximação da cauda poli(A) ao cap (figura 13). A circularização aumenta a tradução devido ao reenvio dos ribossomos já dissociados, liberados da região 3’ do mRNA, para a região 5’ a fim de reiniciar a síntese e a ligação da PABP ao eIF4F aumenta a afinidade do complexo ao cap (SACHS e VARANI, 2000; SONEMBERG e HINNESBUSCH, 2009)..

(38) Lima, R. P.. 36. Figura 13: Circularização do mRNA pela interação dos eIF4E e PABP via eIF4G. A circularização é realizada pela ligação do eIF4E ao cap e da PABP à cauda poli(A) via ligação de ambos ao eIF4G. Pode também ser observada a inibição da ligação do eIF4E ao cap pela sua associação às 4E-BP. O círculo vermelho circunscreve os fatores que compõem o complexo eIF4F (eIF4A, eIF4E e eIF4G) (polyApoli(A)). Fonte: Adaptado de SACHS e VARANI, 2000.. 5. 5. 2. Fator eIF4G O fator eIF4G é a proteína-chave de ligação do complexo eIF4F atuando como ancoradouro de diversos fatores. Dessa forma, o eIF4G promove associações entre proteínas e facilita o alcance de uma conformação tridimensional adequada para iniciação da tradução, visto que possui sítios de ligação para os eIF4E, eIF4A, Dcp1, PABP, Mnk, e o mRNA. É também esse fator que promove o recrutamento do complexo 43S para a região 5’ do mRNA, pela interação com o eIF3 (ligado à subunidade menor ribossomal) (PREVOT, DARLIX e OHLMANN, 2003). Em mamíferos, são encontradas duas isoformas para o eIF4G: o eIF4GI e o eIF4GII, que apresentam 46% de identidade dos resíduos de aminoácidos. Duas isoformas são também.

(39) Lima, R. P.. 37. encontradas em outros organismos, como Saccharomyces cerevisae e plantas. Apesar de ambos, eIF4GI e eIF4GII, terem papéis similares na iniciação da tradução (GINGRAS, RAUGHT e SONEMBERG, 1999) e se complementarem funcionalmente, um na ausência do outro, evidências sugerem que há algumas diferenças em sua atuação visto que o eIF4GII, por exemplo, é seletivamente recrutado no início da diferenciação de megacariócitos (CARON et al., 2004). O eIF4GI pode ser subdividido em três regiões resultantes de clivagem enzimática por proteases picornavirais: porção N-terminal, porção medial e porção C-terminal. A região Nterminal possui sítios de ligação ao eIF4E e PABP. A C-terminal, sítios para eIF4A e Mnk. E a porção central, apresenta sítios para eIF4A, eIF3 e para o RNA (SONEMBERG e DEVER, 2003), nos quais está localizado um domínio típico de ligação HEAT, composto de cinco repetições HEAT (MARCOTRIGIANO et al., 2001). Essas repetições HEAT são compostas por pares de α-hélices antiparalelas, ligadas por alças curtas e seu nome deriva das primeiras letras das proteínas nas quais foram primeiramente identificadas essas repetições: Huntingtina, fator de elongação 3 (EF3), subunidade A (A subunit) da proteína fosfatase 2A e proteína alvo da rapamicina 1 (TOR1, Target of rapamicin 1). São encontradas em proteínas envolvidas na associação de grandes complexos protéicos (PREVOT, DARLIX e OHLMANN, 2003). Além do domínio HEAT típico encontrado na região medial, nomeado HEAT1/MIF4G, são também encontrados mais dois domínios HEAT na porção C-terminal que, entretanto, não são característicos. Estes se apresentam mais compactos e os ângulos das alças entre as repetições são diferentes do padrão, apesar de apresentar as repetições como esperado. Os domínios são denominados HEAT-2/MA3, com capacidade de interação com o eIF4A e HEAT/W2 com interação com a Mnk (figura 14) (BELLSOLELL et al., 2006)..

(40) Lima, R. P.. 38. Figura 14: Esquema do fator eIF4GI. O fator eIF4GI, um dos homólogos encontrados em humanos, pode ser dividido em três regiões por clivagem com protease picornaviral. As setas vermelhas indicam os sítios de clivagem que o dividem em regiões N-terminal, medial e C-terminal. Nos eIF4Gs humanos são encontrados três domínios HEAT: HEAT-1/MIF4G, HEAT-2/MA3 e HEAT-3/W2. Fonte: MARINTCHEV et al., 2009.. O eIF4G desempenha também, além do papel já previamente citado na tradução capdependente, função essencial para alguns tipos de tradução cap-independente, como em que são empregadas IRES. Em alguns mRNAs, o eIF4G recruta o eIF4F sem a necessidade do eIF4E e promove a ligação das subunidades ribossomais no mRNA. Esse tipo de tradução cap-independente é utilizado por vírus e células humanas apoptóticas, quando são utilizadas proteases que clivam o eIF4G abolindo o sítio de interação eIF4G-eIF4E e direcionando, dessa forma, a tradução para os mRNAs que não possuem cap (PESTOVA et al., 2001; PREVOT, DARLIX e OHLMANN, 2003).. 5. 6. Iniciação da tradução em tripanossomatídeos Atualmente, a síntese protéica nos tripanosomatídeos ainda não está bem caracterizada, e a literatura concernente a esse processo nos parasitas ainda é incipiente, apesar do avanço rápido que tem apresentado, devido inclusive à publicação do genoma dos mesmos..