A associação entre proteínas ligantes de RNA e elementos regulatórios contidos em transcritos de mRNA é capaz de regular a expressão gênica através da estabilização ou desestabilização de um transcrito específico. A proteína Pub1 tem sido envolvida na estabilização de determinados grupos de mRNA através da ligação desse fator a sequências específicas presentes nas UTRs 3’ ou 5’ dos transcritos, inibindo dessa forma vias de decaimento (10,44). Neste trabalho, foi demonstrado que a proteína Nab2 pode se ligar diretamente a Pub1 e também modular a estabilidade de um grupo de transcritos regulados por Pub1. Como ambas as proteínas Pub1 e Nab2 se ligam a mRNA, foi necessário determinar se a interação observada entre esses dois fatores é mediada por RNA. Esta hipótese é particularmente importante uma vez que o domínio CCCH de Nab2, o qual é necessário para interação com Pub1, é também implicado na ligação de Nab2 a RNA (55,64). Foi determinado que Nab2 em fusão com TAP co-purifica Pub1 a partir de extratos celulares mesmo quando o extrato é previamente tratado com RNase A, sugerindo que esta interação não é mediada por RNA. Adicionalmente, o ensaio de interação in vitro utilizando proteínas recombinantes purificadas confirmou que Pub1 se liga diretamente a Nab2, e que o domínio de dedos de zinco de Nab2 é necessário e suficiente para interação com Pub1.
Proteínas contendo dedos de zinco frequentemente empregam vários desses domínios na interação com ácidos nucléicos (74). Tipicamente, os resíduos aromáticos dos dedos de zinco interagem com ácidos nucléicos conferindo especificidade na interação da proteína com determinadas sequências (74). Entretanto, além de interagir com ácidos nucléicos, tais domínios também podem ligar-se a proteínas (75). Além do mais, existem várias proteínas que contêm multiplos domínios dedos de zinco, os quais medeiam interações distintas entre si. Como exemplo, o fator de transcrição TFIIIA contém nove dedos de zinco, e dedos de zinco individuais são capazes de interagir tanto com sequências de RNA quanto de DNA (76,77,78,79). Ainda, o fator de transcrição GATA-1 possui duas repetições de dedos de zinco, as quais agem não somente como determinante primário da especificidade de ligação a sequências de DNA com também são capazes de mediar interações proteína-proteína (74). Similarmente, nossos resultados sugerem
que o domínio CCCH de Nab2, o qual contém sete dedos de zinco, é um domínio com várias funções, requerido para ambas interações proteína-RNA e proteína- proteína.
Transcritos de mRNA alvos de regulação por Pub1 previamente caracterizados possuem dois elementos distintos: o elemento STE na 5’UTR ou o elemento ARE na 3’UTR (10,44). Contudo, um recente rastreamento genômico identificou vários transcritos alvos de regulação por Pub1 contendo também sequências ARE-like ou sequências ricas em A (69). Neste trabalho foi mostrado que a linhagem contendo o alelo nab2-1 apresenta diminuição na estabilidade de transcritos alvos de Pub1 contendo sequências ARE-like, embora alvos de Pub1 contendo elementos STE não apresentaram diminuição na estabilidade neste mutante. Não é claro ainda se o efeito de Nab2 na estabilidade de transcritos contendo ARE-like é consequência de alguma função nuclear dessa proteína ou se essa alteração reflete alguma função citoplasmática distinta. Dado o fato de o mutante nab2-1 apresentar aumento do comprimento cauda poli(A) de mRNA (65), poderia ser lógico assumir que a meia-vida desses transcritos estaria aumentada em
nab2-1. Ao contrário, foi observado que transcritos contendo sequências ARE-like
mostram diminuição nas suas meias-vidas em nab2-1. Embora esse mutante seja capaz de interagir com Pub1, a deleção da região N-terminal de Nab2 pode causar algum impacto na função de Nab2 relacionada à estabilização de mRNA por afetar sua interação com outros componentes envolvidos no decaimento de mRNA ou mesmo ajudar na estabilização do complexo formado entre o mRNA, Pub1 e Nab2 (Figura 29). Consistente com a idéia do envolvimento de Nab2 na estabilização de um grupo específico de mRNAs, o mesmo defeito na estabilidade de mRNA mostrado pelo mutante nab2-1 foi observado também em células contendo o alelo recém caracterizado nab2-67. Esse alelo codifica uma variante de Nab2 a qual apresenta uma diminuição drástica na interação com Pub1.
Baseado nos resultados obtidos pelo mutante nab2-67, é possível sugerir que a função de Nab2 na estabilização de transcritos contendo elementos ARE-like está diretamente relacionada à interação desta proteína com Pub1, fator este envolvido na modulação da estabilidade deste grupo de transcritos (69). Consistente com a idéia da existência de uma função para Nab2 na modulação da estabilidade de mRNA através da interação com Pub1, foi verificado que células expressando o
alelo nab2-67, cuja proteína por ele codificada tem sua interação com Pub1 drasticamente reduzida, não apresenta deficiência de crescimento. No entanto, esta mesma linhagem apresenta diminuição da estabilidade de um grupo de transcritos regulados por Pub1. Estes fenótipos observados no mutante nab2-67 são idênticos aos fenótipos de ausência de deficiência de crescimento e estabilidade alterada de transcritos específicos mostrados por células nocautes para PUB1, fortalecendo o argumento da interação funcional entre Nab2 e Pub1.
Pub1 modula o decaimento de vários mRNAs através da interação direta com o elemento ARE-like localizado na 3’UTR do transcrito (69). Em mamíferos, a presença de sequências ARE na região 3’UTR confere instabilidade para a maioria dos transcritos, acelerando sua degradação (80). No entanto, dependendo do contexto celular e de estímulos precisos, essas sequências podem levar à estabilização do transcrito (80). Em S. cerevisiae, foi demonstrado que a sequência ARE do mRNA TNFD de humanos é um elemento desestabilizador em linhagens nocaute para PUB1, porém na presença de Pub1 esse transcrito volta a ser estável (10). Similarmente, os resultados obtidos neste estudo sugerem que a instabilidade de determinados mRNAs observada em mutantes de NAB2 se deve necessariamente à presença da sequência ARE-like nesses transcritos, uma vez que a retirada desse elemento leva à estabilização do transcrito nos mutantes nab2- 1 e nab2-67. Dessa forma, presença da sequência ARE-like em determinados transcritos é necessária para a estabilização mediada por Nab2, assim como por Pub1.
O efeito específico de Nab2 em transcritos contendo sequências ARE-like, mas não naqueles contendo sequências STE, pode ser devido à proximidade do elemento ARE-like, localizado na 3’UTR, à cauda poli(A), região do mRNA de ligação de Nab2 (65,81) (Figura 29). Em contraste, o elemento STE está localizado na 5’UTR do transcrito de GCN4, um sítio que é fisicamente distante da cauda poli(A) e, consequentemente, de Nab2. Consistente com esta hipótese, a interação entre as proteínas de humanos PABP e HuR, ortólogo aparente de Pub1 em humanos (10,29), foi recentemente descrita (82). Neste estudo foi observado o aumento da estabilidade do transcrito de E-caseína, o qual possui um elemento ARE, através da interação da cauda poli(A) com a sequência ARE (82), dando suporte à idéia de que essas duas estruturas do mRNA possam ter atividades
interligadas. Estudos futuros serão necessários para provar esse modelo.
Apesar de Nab2 apresentar localização nuclear no estado de equilíbrio, esta proteína é translocada entre o núcleo e o citoplasma (53). Similarmente, Pub1, primariamente localizado no citoplasma, pode também ser localizado no núcleo (26). Evidências mostram que várias proteínas ligantes de RNA podem desempenhar funções nucleares distintas de funções citoplasmáticas (77,83,84,85). A proteína Hrp1, por exemplo, é uma hnRNP localizada no núcleo no estado de equilíbrio (86), onde é requerida para a formação correta da extremidade 3’ de mRNAs (84,87). No entanto, esta proteína pode ser translocada para o citoplasma onde tem a função de modular a atividade de NMD (83). Outros exemplos incluem Gbp2 e Hrb1, que se ligam ao mRNA no núcleo mas também se associam a polissomos no citoplasma (85). Ainda, eIF4AIII, uma proteína nuclear que é adicionada ao mRNA durante seu processamento, também tem atividades relacionadas à degradação de mRNA por NMD e ao fator de início de tradução eIF4A (77,78,79,88).
Ainda não está totalmente claro como Pub1 estabiliza transcritos contendo elementos STE ou ARE. É sabido que a via NMD é requerida para a degradação de transcritos contendo uORFs, os quais contém o elemento STE (43). Em S.
cerevisiae, a principal via de degradação para NMD envolve a remoção do “cap” da
extremidade 5’ do transcrito, seguida da ação exonucleásica 5’-3’, não sendo necessária a etapa de desadenilação (89). Foi mostrado que o transcrito endógeno de GCN4, o qual contém uORFs, é protegido do decaimento mediado por NMD através da ligação de Pub1 ao elemento STE localizado na 5’UTR do transcrito (44). No entanto, não foi determinado ainda se transcritos endógenos contendo sequências ARE são degradados pelo mesmo mecanismo. Nossos resultados indicam que a estabilidade do transcrito RPS16B não é restaurada nos mutantes
'
pub, nab2-1 ou nab2-67, nas quais a via de NMD foi bloqueada pela deleção de UPF1. Este resultado mostra que tanto Pub1 quanto Nab2 estabilizam transcritos contendo elementos ARE-like pela modulação de uma via distinta de NMD.A associação funcional entre Pub1 e Nab2 no metabolismo de RNA poderia ajudar na coodenação de diferentes eventos envolvidos no controle da expressão gênica, acoplando as etapas de biogênese de mRNA de maturação e exportação nuclear, à maquinaria de decaimento de mRNA. Conjuntamente, nosso estudo sugere que Nab2, uma proteína com funções nucleares definidas, atue com Pub1 na
determinação da estabilidade de um grupo específico de mRNA, adicionando Nab2 à uma lista crescente de proteínas nucleares ligantes de RNA que modulam o destino de transcritos de mRNA no citoplasma.
Neste trabalho, foi realizada a tentativa de determinação e caracterização da estrutura terciária da proteína Pub1. No entanto, não foi possível determinar condições de cristalização da proteína purificada, compromentendo assim a obtenção de cristais para os estudos. A dificuldade de obtenção de cristais de Pub1 pode ser devido à grande mobilidade entre os domínos de interação com RNA (RRMs), o que impossibilita a organização coesa da proteína e o crescimento de cristais. O estudo estrutural de diversas proteínas ligantes de RNA se deram pela determinação da estrutura cristalográfica dos domínios RRM isolados, como por exemplo hnRNP A1 (90) e Nup35 (91). Entretanto, não foi possível também a obtenção de cristais dos domínios isolados de Pub1. Em estudos futuros poderão ser realizados testes de co-cristalização utilizando sequências de RNA às quais sabidamente Pub1 se liga, podendo fornecer um complexo proteína-RNA estável e rígido suficiente para o crescimento de cristais, como foi realizado para as proteínas PABP (92) e Slx (93), as quais possuem uma organização estrutural muito semelhante a Pub1.
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B
AAAAAAA m7G uORF STE GCN4Pub1
A m7G RPS16B AREPub1
Nab2
AAAA AA CT NTNab2
Figura 29. Esquema do modelo da interação entre Pub1 e Nab2. (A) No esquema, a
proteína Pub1 se liga à sequência ARE-like do transcrito de RSP16B e ao domínio de dedos de zinco na região C-terminal de Nab2 (CT). O domínio de dedos de zinco de Nab2 também é capaz de interagir com a cauda poli(A) do mRNA, e o seu domínio N-terminal (NT) poderia exercer alguma função relacionada à estabilização de mRNA por afetar sua interação com outros componentes de um complexo multifuncional. (B) No caso do transcrito de GCN4,
as proteínas Pub1 e Nab2 interagem com suas respectivas sequências do RNA, entretanto, devido ao fato de Nab2 estar distante fisicamente do sítio de ligação de Pub1, Nab2 não exerce ação na estabilidade deste transcrito.