As células cancerosas enfrentam dois grandes desafios: como atender as demandas bioenergéticas e biossintéticas do crescimento e proliferação celular aumentada e; como empreender estratégias de adaptação metabólica para sobreviver a flutuações ambientais de disponibilidade de nutrientes e O2 quando o crescimento tumoral ultrapassa a capacidade de abastecimento da vascularização existente. Para suprir essas demandas, as células cancerosas reorganizam todos os mecanismos de sinalização celular relacionados com as vias de controle de crescimento e todo o seu processo metabólico com o objetivo de aumentar as reações anabólicas necessárias para manter a viabilidade tumoral. Como todas as células neoplásicas são dependentes desta alteração metabólica, essas vias alteradas representam um alvo terapêutico extremamente atraente.
As células tumorais exibem um padrão metabólico muito diferente daquele encontrado nas células saudáveis diferenciadas (Kroemer & Pouyssegur, 2008; Dang, 2012). Por serem células em rápido processo proliferativo tanto a demanda por O2 quanto a síntese de macromoléculas necessitam ser readequadas para a progressão tumoral. Dessa maneira cria-se um campo de estudo promissor e atraente no âmbito da biologia molecular, visando o metabolismo energético celular como um possível alvo terapêutico para diversos tipos de neoplasias humanas (Jones & Thompson, 2009). Os tecidos tumorais caracterizam-se por apresentarem populações celulares que perderam o controle sobre a divisão celular. Dentre uma série de alterações intracelulares observadas nas células tumorais, tem-se a peculiaridade de as células tumorais produzirem energia preferencialmente por vias alternativas como a glicólise citoplasmática, em detrimento da fosforilação oxidativa mitocondrial (De Preter et al., 2016). Em condições intracelulares normais, a fosforilação oxidativa fornece energia preferencialmente para o citoplasma enquanto a glicólise o faz predominantemente para o núcleo. O núcleo parece ser o compartimento mais susceptível à deficiência de ATP, não somente nas células normais como nas células tumorais (Potter et al., 2016).
Vários tipos celulares neoplásicos metabolizam a glicose predominantemente pela via glicolítica (fenômeno conhecido como efeito Warburg). Esse processo se caracteriza por elevado consumo de glicose e produção de lactato citoplasmático, independentemente do aporte de O2. A glicólise é frequentemente acompanhada por um aumento na captação de glicose para o meio intracelular. O produto final do
metabolismo energético, ATP, é crucial para a manutenção dos processos celulares (Karan et al., 2003; Cairns et al., 2011).
As células tumorais são metabolicamente adaptadas para um rápido crescimento e proliferação em condições hostis, como pH ácido e baixas tensões de O2; condições nas quais as células normais dificilmente conseguiriam sobreviver (Walsh et al., 2014). As células tumorais parecem se adaptar ao microambiente criado, alterando seu padrão metabólico em direção ao uso de combustíveis celulares (glicose, lipídios e aminoácidos) mais rapidamente e eficientemente que as células normais. O consumo desses nutrientes tem basicamente dois destinos preferenciais: geração de ATP (via glicólise aeróbica e/ou fosforilação oxidativa) e biossíntese de macromoléculas (DNA, lipídios de membranas e proteínas) (Kroemer & Pouyssegur, 2008; Dang, 2012).
Uma série de alterações mitocondriais foi verificada ao logo dos anos em células tumorais, dentre as quais se destacam diminuição do número de mitocôndrias, diminuição da quantidade de DNA mitocondrial, diminuição da atividade da cadeia respiratória, alteração ultraestrutural da cadeia de transporte de elétrons e diminuição do efluxo de citratro do Ciclo de Krebs (Walsh et al., 2014; Formentini et al., 2010; Dang, 2012). Tais alterações vêm se somando cada vez mais com a análise de marcadores envolvidos na bioenergética celular, denominado na literatura de "assinatura bioenergética do câncer". Estes estudos mostram que a alteração da função bioenergética da mitocondria é uma pedra fundamental da carcinogênese (Cuezva et al., 2002; Ramaswamy et al., 2003).
O complexo H+-ATPsintase mitocondrial humano, ou complexo V, consiste de dois domínios funcionais, F1 e F0 (Devenish et al., 2008). O domínio F1 compreende 5 subunidades diferentes (três α, três β e uma γ, δ e ε) e situa-se na matriz mitocondrial. F0 é formado pelas subunidades a, b, c, d, F6, e OSCP; e as subunidades acessórias e, f, g e A6L (Jonckheere et al., 2012). O domínio F0 está localizado na membrana interna mitocondrial. Prótons passam pelo espaço intermembranoso da matriz através de F0, o qual transfere a energia criada pelo próton a F1, desencadeando a fosforilação de ADP em ATP (Boyer, 1997). Dessa forma o complexo H+-ATPsintase mitocondrial humano é responsável pelo suprimento energético das células eucariontes além de estar associado ao correto funcionamento do processo de apoptose celular (Henne, 2016). A apoptose é um evento celular dependente de energia e geneticamente programado para o desenvolvimento fisiológico do organismo (Pan et al., 2008), sendo que alterações neste processo estão associadas à progressão do processo de carcinogênese (Rühle & Leister,
2015). A subunidade β-catalítica do complexo H+
-ATPsintase mitocondrial, chamada de β-F1-ATPase, utilizada como um dos alvos de imunomarcação neste trabalho, é a única subunidade catalítica do complexo (Boyer, 1997) e age, portanto, como um componente limitante da síntese de ATP pela fosforilação oxidativa, sendo o aporte adequado de ATP por essa via e a integridade dos componentes moleculares desta enzima importantes na execução eficiente da morte celular por apoptose (Gustafsson et
al., 2016).
As proteínas de choque térmico (Hsp) constituem um grupo heterogêneo de moléculas com uma ampla variedade de funções, cuja mais importante é a resposta ao estresse celular (Cappello et al., 2008). Mais recentemente, tem-se também atribuído às Hsps a participação em translocação e degradação de proteínas, dissolução de agregados proteicos de origem patológica, regulação de expressão genética, diferenciação celular, replicação de DNA, transdução de sinal, morte celular programada e senescência celular (Macario et al., 2007). Especificamente, a Hsp60 é uma proteína encontrada tanto em procariontes quanto em organelas das células eucarióticas (mitocôndrias e cloroplastos). Seu papel e aplicação em câncer humano vêm sendo investigado ativamente e os resultados são encorajadores. Hsp60 parece ter potencial nas áreas de diagnóstico, prognóstico, prevenção e tratamento de vários tumores humanos (Macario et al., 2005; Cappello et al., 2008).
Otto Warburg, na década de 1920, propôs pela primeira vez que células tumorais teriam prejuízo da função mitocondrial associado a uma elevada taxa de glicólise. Estudos recentes apontam para duas vias pelas quais o câncer interfere na atividade mitocondrial (Cuezva et al., 2002). A primeira, envolveria uma supressão generalizada dos componentes mitocondriais, incluindo proteínas estruturais como a Hsp60, e também energética como a β-F1-ATPase. Esta condição foi verificada em trabalho com carcinoma hepático, em que se observou uma considerável diminuição do DNA mitocondrial nas células tumorais em relação às células normais. Neste estudo com tumores hepáticos, os níveis de Hsp-60 não revelaram correlação significativa com o prognóstico dos pacientes. Em contrapartida, o nível de expressão tumoral de β-F1- ATPase revelou uma correlação significativa tanto com a sobrevida dos pacientes (P<0,03) quanto com o tempo de recorrência da doença (P<0,02) (Cuezva et al., 2002). A segunda via, descrita em trabalhos com amostras humanas de diversos tipos de tumor, incluindo rim, cólon, mama e pulmão (Cuezva et al., 2002; Cuezva et al., 2004; Isidoro
et al., 2005) caracteriza-se pela supressão específica da expressão da β-F1-ATPase, ou
seja, há apenas prejuízo da função bioenérgica mitocondrial. Isidoro et al demonstrou que para os tumores de mama a expressão de β-F1-ATPase não só mostrou-se consideravelmente diminuída em relação ao controle, mas também permitiu a identificação de um subgrupo de pacientes com câncer significativamente de pior prognóstico. Por outro lado, a expressão da proteína Hsp60 mostrou aumento significativo nas células tumorais quando em comparação às células normais, e essa expressão foi significativamente maior em tumores pouco diferenciados quando comparados com bem e moderadamente diferenciados. Neste trabalho, análise de regressão Cox indicou que a expressão tumoral desta variável foi um marcador independente de prognóstico dos pacientes [HR=1.7 (1.0–2.9) (IC=95%), P=0,041]
(Isidoro et al., 2005). Cuezva et al em seu estudo com tumores pulmonares, mostrou que a relação β-F1-ATPase/Hsp60 foi significativamente maior em tumores bem diferenciados em relação aos moderados e pobremente diferenciados; e entre os tumores bronquioalveolares em relação aos tumores derivados dos brônquios (Cuezva et al., 2004). Nosso trabalho encontrou resultados que corroboram a segunda via, uma vez que foi observada redução da imunorreatividade da proteína β-F1-ATPase dos grupos com tumor, em especial do grupos CaP de alto e intermediário graus em relação ao grupo normal e também CaP de baixo grau, porém sem redução concomitante da proteína Hsp60, que se mostrou inclusive aumentada no grupo CaP de alto grau em comparação ao grupo sem lesão.
LDH é uma enzima que catalisa oxidação de lactato para piruvato no final da cadeia metabólica da glicólise anaeróbia, utilizando o dinucleótido de nicotinamida- adenina (NAD+) como receptor de hidrogênio (Manerba et al., 2016). LDH é um tetrâmero composto por duas subunidades diferentes que podem combinar-se de cinco maneiras diferentes (Di Stefano et al., 2016). Níveis elevados de LDH é uma característica de muitos tumores, marcador específico da via glicolítica citoplasmática e quando em concentrações aumentadas está associada com mau prognóstico em vários casos de tumores em humanos (Koukourakis et al., 2016). Isidoro et al em seu trabalho com câncer de mama demonstrou aumento significante dos níveis de todos marcadores glicolíticos avaliados, inclusive LDH, nos casos de tumores de mama quando comparados com o tecido mamário normal. Observou-se também que, em comparação com os carcinomas ductais, os carcinomas lobulares revelou um nível de expressão significativamente mais elevada de LDH. Ficaram demonstradas também correlações
lineares significativas entre os níveis de expressão de GAPDH e LDH (R=0,242; P<0,014), PK e LDH (R=0,639; P<0,001) e qualquer um dos marcadores da via glicolítica (GAPDH, PK, LDH), com a soma da expressão dos níveis dos três marcadores glicolíticos (R=0,679; R=0,741 e R=0,797, respectivamente; e em todos os casos P<0,001). Os autores concluem que esses dados indicam uma adequação energética da célula cancerosa a um fenótipo da via glicolítica alternativa à mitocondrial (Isidoro et al., 2005).
Para o melhor entendimento desta relação, foi elaborado o conceito de “índice bioenergético” (Cuezva et al., 2002), que visa correlacionar as expressões das proteínas marcadoras da função mitocondrial pela razão β-F1-ATPase/Hsp60, em relação às proteínas marcadoras da função glicolítica citoplasmática (LDH ou GAPDH, por exemplo). Dessa forma calcula-se o BEC pela relação β-F1-ATPase/Hsp60/LDH, obtendo-se assim um número adimensional. Com isso pode-se elucidar se há diminuição no BEC, e caso isso ocorra, se o é pela depleção do componente mitocondrial (diminuição da relação β-F1-ATPase/Hsp60), incremento do componente glicolítico (aumento de LDH), ou ambos. Sendo assim, é possível comparar as diferenças entre os grupos e estabelecer o que se denominou “assinatura bioenergética” do câncer em estudo.
Cuezva et al estudando tumores pulmonares, observaram que o BEC dos tumores T2 foi significativamente menor que dos tumores T1. Da mesma forma, tumores com estadio IB tiveram BEC significativamente menor que os tumores estádio IA. Neste estudo, a avaliação da curva de sobrevida de Kaplan-Meier utilizando o BEC como preditor de sobrevida, revelou que dentre os tumores de mesmo tamanho, ou de fase I, ou com ausência de metástase linfonodal (N0); os pacientes cujos tumores tinham menor BEC apresentaram um prognóstico significativamente pior (Cuezva et al., 2000). Cuezva et al avaliando carcinomas hepáticos, renais e colônicos, observou que o BEC desses tumores era significativamente menor que seus correspondentes tecidos normais. Também notou-se que o BEC desses tumores revelou uma correlação significativivamente pior à medida que diminuia, tanto em relação à sobrevida dos pacientes (P<0,03) quanto ao tempo de recorrência da doença (P<0,01). Os autores sugeriram que o potencial de metástases dos tumores e a recorrência está ligada à infra- regulação da fosforilação oxidativa e incremento simultânea da via glicolítica, de acordo
com a observação recente de que a concentração de lactato do tumor, prevê um aumento do risco de metástase do câncer de cabeça e pescoço (Cuezva et al., 2002).
Isidoro et al, trabalhando com vários tipos de tumores, observou que a expressão dos marcadores mitocondriais e da via glicolítica variou significativamente nestes carcinomas quando comparados com os correspondentes tecidos normais. Em geral, a expressão relativa da β-F1-ATPase foi significativamente reduzida nos tumores de mama e adenocarcinomas gástricos, bem como em esofágico e carcinoma do pulmão, sugerindo fortemente que a alteração da função bioenergética da mitocôndria é um marca destes tipos de neoplasia. O BEC foi significativamente reduzido nesses tumores (Isidoro et al., 2004).
Em estudo com câncer de mama, a utilização da análise do discriminante linear de Fisher foi aplicado usando como variáveis de previsão da análise a competência bioenergética mitocondrial (relação ATPase/Hsp 60) e bioenergética celular (BEC). Os autores evidenciaram neste trabalho que a alteração da bioenergética mitocondrial e indução concomitante dos marcadores da via glicolítica são características metabólicas adaptativas e definitivas dos tumores mamários, os quais afetaram 97% desses tumores analisados (Isidoro et al., 2005).
Estudando-se a assinatura bioenergética do câncer de ovário, observou-se que BEC baixo (HR=0,47; IC95%=0,23-0,95) foi independentemente associada com menor intervalo de tempo de quimioterapia baseada em platina. Da mesma forma, a mediana do intervalo de tempo de quimioterapia baseada em platina para pacientes com baixo BEC foi de 5,3 meses, em comparação com 9,8 meses para os casos com BEC elevado (p=0,028). Os autores concluiram que o BEC (e também o marcador glicolítico GAPDH) conseguiu identificar grupos de carcinomas de ovário serosos de alto grau avançado, com prognóstico diferenciado dos demais subgrupos. Aventaram, portanto, a possibilidade desses marcadores metabólicos serem usados no futuro como forma de estratégia para melhorar a sobrevivência neste grupo de pacientes com pior prognóstico (Hjerpe et al., 2013).
Em nosso trabalho observou-se uma progressiva diminuição do BEC nos gupos de tumores em relação ao tecido normal, estando mais drasticamente reduzido no grupo CaP de alto grau. Estes resultados mostram nitidamente que essa redução se deu pela diminuição da relação β-F1-ATPase/Hps60, e mais acentuadamente pela queda do numerador β-F1-ATPase nesta relação; concomitante ao aumento do marcador glicolítico LDH. Esse evento foi mais nitidamente observado em tumores prostáticos de
maior grau histológico. Pela relevância do componente β-F1-ATPase/Hps60 na fosforilação oxidativa mitocondrial e por correlacionar-se com o correto funcionamento do processo apoptótico, é compreensível que nos grupos em que ela se apresenta suprimida haja os piores fatores prognósticos da doença. Desta forma, o grupo de menor BEC além de ter sido o de maior grau histológico foi o que apresentou progressão bioquímica mais prematuramente (<2 anos) e com maiores índices de mortalidade em 120 meses. Por outro lado, o grupo de paciente cujo BEC mais se aproximou do grupo controle foi o CaP de baixo grau, no qual não se observou progressão bioquímica em 5 anos e nem mortalidade durante 120 meses de seguimento. Além disso, verifica-se uma nítida diferença em relação aos três grupos de pacientes com tumor ao se observarem as curvas de Kaplan-Meier, tanto em relação à mortalidade quanto em relação à sobrevida livre de recorrência bioquímica. Com isso, aponta-se para a assinatura bioenergética do CaP, em que ocorre prejuízo na obtenção de ATP pelas células mediante fosforilação oxidativa (repressão da proliferação mitocondrial) associado a um processo de adaptação celular na qual a obtenção de energia passa a ser predominantemente pela via glicolítica (incremento do marcador LDH). Fica assim provado que a hipótese de Warburg é válida também para o CaP.
As moléculas transportadores de glicose (GLUTs) permitem o transporte de energia através da membrana celular hidrofóbica independente do gradiente de concentração. Treze membros desta família já foram identificados entre os mamíferos. Recentemente, três classes foram classificadas dentro da família, sendo GLUT-1 a GLUT-4 enquadradas na Classe I (Yamamoto et al., 1990; Macheda et al., 2005). A captação tumoral aumentada de glicose facilitada pela expressão aumentada de GLUT-1 vem sendo observada amplamente em tecidos tumorais. Concentrações expressivamente aumentadas de GLUT-1 foram encontradas em muitos cânceres, incluindo hepático, pancreático, esófagico, cérebral, renal, pulmonar, cutânea, colorectal, endométrial, ovário, e colo do útero (Yamamoto et al., 1990; Noguchi et al., 2000).
Um estudo com 118 pacientes portadores de câncer de mama demonstrou expressão de GLUT-1 elevada em 42% dos tumores, com uma expressão mais acentuada em tumores de maior grau, maior atividade proliferativa determinada pela imunomarcação Ki-67 e com a pontuação histológica total; e uma correlação negativa com Bcl-2. Também não se observou correlação entre GLUT-1 e receptor de estrogênio, tamanho tumoral ou linfonodos acometidos (Younes et al., 1995).
Em neoplasia de pulmão e ovário, o aumento da expressão de GLUT-1 também tem sido associado com um menor grau de diferenciação tumoral (Higashi et al., 2000; Cantuaria et al., 2001). A expressão aumentada de GLUT-1 em tumores malignos também se correlaciona com a sobrevida dos pacientes. Nas neoplasias malignas de pulmão, colorectal, ovário, laringe e mama, altos níveis de GLUT-1 foram significativamente marcadores e indicadores de diminuição da sobrevida (Younes et al., 1995; Baer et al., 1997; Ogawa et al., 1997; Cantuaria et al., 2001).
Cantuaria et al, estudando tumores de ovário, verificaram superexpressão de GLUT-1 em 89 de 104 (85,6%) neoplasias. Tumores pouco diferenciados mostraram uma tendência para superexpressão da proteína GLUT-1 em comparação aos mais diferenciados (27,6% vs 8,7%; P=0,08). Neste trabalho, os pacientes que apresentaram maior expressão de GLUT-1 evoluiram mais satisfatoriamente em relação à resposta clínica completa à quimioterapia que os pacientes com menor expressão de GLUT-1 (80% vs 51,5%; P=0,036). Em análise multivariada da doença em estágio avançado, tumor residual (P=0,0001) e níveis de expressão elevados de GLUT-1 (P=0,028) foram as únicas variáveis independentes que mantiveram associação significativa com a resposta à quimioterapia (P=0,0001). Observou-se também que o tempo médio de progressão foi de 30 meses em casos fortemente positivos para GLUT-1 (>50% das células cancerosas positivas) versus 60 meses em casos fracamente positivos (<50% das células cancerosas positivas), P=0,024. Os autores concluiram que o marcador GLUT-1 é um fator prognóstico independente da resposta à quimioterapia em carcinoma de ovário em estágio avançado da doença. Além disso, os pacientes que sobrexpressam esse marcador mostraram uma sobrevida livre de doença significativamente mais curta. Estes resultados sugerem que a avaliação do estado GLUT-1 pode fornecer informações de prognóstico clinicamente útil em pacientes com carcinoma de ovário (Cantuaria et
al., 2001).
Em nosso trabalho não encontramos diferença da imunorreatividade
citoplasmática do transportador de glicose GLUT-1 entre os grupos de CaP e também em comparação com o tecido prostático benigno, sugerindo que o caminho encontrado para a obtenção de energia por essas células não se dá a partir do aumento da captação de glicose. Tal achado é corroborada pela informação prévia de que o tecido prostático é caracterizado por baixas taxas de captação de glicose quando se analisa os dados de pacientes submetidos ao PET-CT (Positron Emission Tomography) (Effert et al., 1996). No entanto, vale ressaltar que nosso estudo mostrou marcação nuclear para a proteína
GLUT-1 em todos os grupos, demonstrando inclusive aumento da imunorreatividade no grupo CaP de alto grau em comparação com os demais. Diante disso nos surgem duas explicações principais, sendo a primeira a hipótese de ter havido a marcação de algum antígeno nuclear que não o transportador GLUT-1 pela técnica de imunoistoquímica utilizada, resultando em um falso-positivo, ou pela possibilidade também aceitável de um real aumento da expressão de GLUT-1 no grupo de alto grau, que por um motivo não claro no momento ou mesmo por interferências inerentes ao procedimento de imunoistoquímica, mostrou-se expresso na região nuclear, refletindo uma maior demanda por glicose das células tumorais para a geração de ATP, provavelmente pela via glicolítica, uma vez que o marcador deste caminho, o LDH, também se mostrou aumentando nos tumores mais agressivos em comparação aos graus histológicos mais baixos e ao grupo normal. De qualquer maneira, investigações mais aprofundadas se fazem necessárias para esclarecer este ponto específico.
A β-oxidação mitocondrial de ácido graxos é uma das principais fontes de energia para síntese de ATP, sobretudo em períodos de estresse metabólico, depleção de glicogênio decorrente de jejum prolongado, e mais recentemente aceito, processo carcinogênico. Este processo gera acetil-coenzima A e energia na forma de ATP. A rota de oxidação dos ácidos graxos é complexa e inclui muitos passos: captação celular de ácidos graxos, ativação desses mesmos ácidos graxos em ésteres actil-CoA, transesterificação a acilcarnitinas, translocação através da membrana mitocondrial, reesterificação à acil-CoA, e a espiral da β-oxidação intramitocondrial, a qual fornece elétrons para flavoproteínas transferidora da elétrons e acetil-CoA. Cada etapa da espiral de β-oxidação é catalizada por uma enzima específica. Dentro da mitocondria cada ciclo da β-oxidação de ácidos graxos de cadeia linear consiste de quatro reações enzimáticas que são específicas para determinado comprimento de cadeia. Para as cadeias longas, o