UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
Rogério Cardoso da Silva
Assinatura bioenergética como marcador de
progressão e prognóstico do câncer de próstata
Campinas
2018
Rogério Cardoso da Silva
Assinatura bioenergética como marcador de progressão e
prognóstico do câncer de próstata
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências
ORIENTADOR: Prof. Dr. Wagner José Fávaro
COORIENTADOR: Prof. Dr. Wagner Eduardo Matheus
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO ROGÉRIO CARDOSO DA SILVA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. WAGNER JOSÉ FÁVARO.
Campinas 2018
ROGÉRIO CARDOSO DA SILVA
ORIENTADOR: PROF. DR. WAGNER JOSÉ FAVARO
COORIENTADOR: PROF. DR. WAGNER EDUARDO MATHEUS
MEMBROS:
1. PROF. DR. WAGNER JOSÉ FÁVARO
2. PROF. DR. ATHANASE BILLIS
3. PROF. DR. UBIRAJARA FERREIRA
4. PROF. DR. JOSÉ CARLOS SOUZA TRINDADE FILHO
5. PROF. DR. LÍSIAS CASTILHO NOGUEIRA
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao professor Dr. Wagner José Fávaro, orientador desta tese de doutorado, o qual foi imprescindível para realização do mesmo.
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), uma das melhores instituições de ensino superior do país e do mundo, pelo grau de qualidade que impõe às suas atribuições assistenciais, de ensino e de pesquisa.
Ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Cirurgia o qual mantém um Programa de formação de mestres e doutores com alta qualificação científica e intelectual. À Disciplina de Urologia, representada pelo professor Dr. Ubirajara Ferreira, a qual me proporcionou crescimento e amadurecimento profissional por meio de sua Pós Graduação, com a excelência que oferece a seus alunos em todos os âmbitos.
À Disciplina de Urologia também pelo fato de ter disponibilizado os dados referentes aos pacientes elencados para este trabalho, dando ampla disponibilidade e acessibilidade ao arquivo estruturado dela Disciplina.
Ao meu orientador professor Dr. Wagner José Fávaro, pelos ensinamentos, paciência e acolhimento ao meu trabalho; meu muito obrigado.
Ao professor Dr. Athanase Billis pela sua disponibilidade e dedicação em rever toda parte de anatomopatologia do trabalho, disponibilizando seu amplo conhecimento em favorecimento deste estudo.
Ao estudante de graduação em medicina Alexandre Forato, bolsista de iniciação científica da FAPESP, pelo auxílio da parte laboratorial in locu ao trabalho.
Ao Departamento de Bioestatística da FCM-UNICAMP pelo empenho na realização dos testes estatísticos do trabalho.
À FAPESP (processos: 2014/12047-4; 2014/06128-1; 2014/11866-1), CNPq e CAPES pelo suporte financeiro; inquestionavelmente viabilizadores desta tese.
Maluf, os quais entenderam meus momentos de ausência nas atividades de trabalho diárias. Muito obrigado pela compreensão.
A todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
"É melhor lançar-se à luta em busca do triunfo, mesmo expondo-se ao insucesso, do que ficar na fila dos pobres de espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito, por
viverem nessa penumbra cinzenta de não conhecer vitória e nem derrota."
Franklin D. Roosevelt
Introdução e Objetivos: Ao contrário das células normais, a glicólise é aumentada e a capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial é reduzida em vários tipos de cânceres. Acredita-se que o fenótipo glicolítico no câncer se deve a uma incapacidade permanente da fosforilação oxidativa mitocondrial. Embora a glicólise seja frequentemente encontrada em tumores malignos, a fosforilação oxidativa mitocondrial desempenha um papel importante na produção de energia em alguns tipos de cânceres. Assim, os objetivos desse estudo foram investigar e caracterizar a assinatura bioenergética mitocondrial do câncer de próstata como marcador da classificação de Gleason e o tempo de recidiva bioquímica após a prostatectomia radical (PRR). Também desenvolvemos um índice bioenergético celular (BEC), que pode refletir o prognóstico. Materiais e Métodos: Estudamos amostras de próstata de 4 grupos (10 pacientes em cada grupo): Grupo 1 (Controle): ausência de malignidade; Grupo 2: Escala de Gleason ≤ 6, sem progressão bioquímica ≥ 5 anos pós-prostatectomia radical; Grupo 3: Escala de Gleason= 7, com progressão bioquímica pós-prostatectomia radical > 2 anos e < 5 anos) e Grupo 4: Escala de Gleason> 7, com progressão bioquímica pós-prostatectomia radical ≤ 2 anos. Todas as amostras foram submetidas a análises imunohistoquímicas para as enzimas metabólicas: β-F1-ATPase, Hsp60, LDH, GLUT-1 e OHADH. Para avaliar a imunorreatividade, obteve-se uma pontuação com base no número e intensidade de células positivas. O IBC foi avaliado pela relação de pontuação das imunorreatividades de β-F1-ATPase:Hsp60:LDH. Resultados: Os resultados demonstraram dois caminhos alternativos pelos quais as células neoplásicas da próstata regulam negativamente a atividade mitocondrial. No Grupo 2 (Escala de Gleason ≤ 6, sem progressão bioquímica ≥ 5 anos pós-prostatectomia radical) não houve diminuição na imunomarcação para β-F1-ATPase, o que é consistente com a repressão do programa de proliferação mitocondrial. Em contraste, nos Grupos 3 e 4 (tumores intermediários e de alto grau com RB pós-prostatectomia radical) houve uma diminuição na regulação específica para a β-F1-ATPase, o que é consistente com a repressão seletiva da expressão dos componentes envolvidos na função bioenergética mitocondrial, levando à limitação da fosforilação oxidativa mitocondrial. Além disso, os tumores intermediários e de alto grau apresentaram aumento na regulação da via glicolítica (LDH), bem como aumento das imunorreatividades para a via de oxidação de ácidos graxos (HADHSC). Conclusões: O IBC foi significativamente reduzido nos tumores intermediários/alto graus vs. baixo grau, fornecendo uma assinatura bioenergética para esses tumores. A infraregulação da β-F1-ATPase e a avaliação do índice celular bioenergético relacionado ao grau de Gleason e ao tempo de recorrência bioquímica pós-prostatectomia radical podem ter valor prognóstico no câncer de próstata.
Palavras-chave: Oncologia, Câncer de próstata, Metabolismo energético, Imunoistoquímica.
Background and objectives: Unlike normal cells, glycolysis is enhanced and mitochondrial oxidative phosphorylation capacity is reduced in various cancers. It has long been believed that glycolytic phenotype in cancer is due to a permanent impairment of mitochondrial oxidative phosphorylation. Although aerobic glycolysis is often found in malignant tumors, mitochondrial oxidative phosphorylation plays a major role in energy production in some cancers. The aim of the study was to investigate the mitochondrial bioenergetic signature of prostate cancer as a marker of Gleason grading and time to biochemical recurrence after radical prostatectomy (RPR). We also developed a bioenergetic cellular index (BEC), which may reflect prognosis. Materials and methods: We studied prostate samples from 4 groups (10 patients in each group): Group 1 (control): absence of malignancy; Group 2: Gleason score < 6 in RPR and no recurrence > 5 years after surgery; Group 3: Gleason score 7 and biochemical recurrence 2-5 years after RPR; Group 4: Gleason score 8-10 and biochemical recurrence < 2 years after RPR. All samples were submitted to immunohistochemical analyses for metabolic enzymes: β-F1-ATPase, Hsp60, LDH, GLUT-1 and OHADH. To evaluate immunoreactivity, a score was obtained based in number and intensity of positive cells. BCI was assessed by the β-F1-ATPase:Hsp60:LDH immunoreactivities score ratio. Results: The results revealed two alternative pathways by which prostatic neoplastic cells negatively regulate mitochondrial activity. In Group 2 (low-grade tumors and no biochemical recurrence > 5 years after RP), there was no decrease in the labeling for β-F1-ATPase, which is consistent with repression of the mitochondrial proliferation program. In contrast, in Groups 3 and 4 (intermediary and high-grade tumors with biochemical recurrence after RPR) there was a decrease in the specific regulation for β-F1-ATPase, which is consistent with selective repression of the expression of the components involved in mitochondrial bioenergetics function, leading to limitation of mitochondrial oxidative phosphorylation. In addition, intermediary and high-grade tumors, showed increase in the regulation of glycolytic pathway (LDH), as well as increased immunoreactivity for fatty acid oxidation pathway (HADHSC). Conclusions: The BCI was significantly reduced in intermediary/high-grade vs low-grade tumors, providing a bioenergetic signature for these tumors. Down-regulated β-F1-ATPase and assessment of the bioenergetic cellular index related to Gleason grade and time to biochemical recurrence after RPR may have prognostic value in prostate cancer.
ADP - adenosina difosfato
AIP - atrofia inflamatória proliferativa AMP - adenosina monofosfato
ATP - adenosina trifosfato
β-F1-ATPase - subunidade β-catalítica do complexo H+
-ATP sintetase BSA - solução bloqueadora com albumina de soro bovino
BEC index - índice bioenergético celular CaP - câncer de próstata
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CO2 - dióxido de carbono
Col - fibras colágenas Cml - fibras musculares lisas
CNPq - Conselho Nacional de Pesquisa CZ - zona central
DNA - ácido desoxirribonucleíco EEP - extensão extraprostática
Ep - epitélio Es - estroma
FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAS - ácido graxo sintetase
Fb - fibroblastos
FCM – Faculdade de Ciências Médicas
GAPDH - gliceraldeido-fosfato-dehidrogenase GLUT-1 - transportador de glicose 1
H2O – água H2O2 - peróxido de hidrogênio HADHSC – 3 -hidroxiacil-CoA-desidrogenase HR – Hazard Ratio Hsp 60 - proteína de choque 60 IC – intervalo de confiança IL-8 - interleucina 8
IVV - invasão de vesículas seminais LDH - lactato desidrogenase
MIT - proteína trifuncional mitocondrial MMP-2 - metaloproteinase de matriz 2 NIP - neoplasia intraepitelial da próstata O2 - oxigênio
O2- - ânion superóxido OH - radical hdroxila OR – Odds Ratio
P – significância estatística
PCM - Percentil de Células Marcadas PK - pirofosfato- quinase
PRR – prostatectomia radical PSA – antígeno prostático específico PZ - zona periférica
R – coeficiente de correlação linear RNA - ácido ribonucleico
SD – desvio padrão SG – sobrevida geral
SLRB – sobrevida livre de recorrência bioquímica UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas VEGF - fator de crescimento do endotélio vascular VLCAD - desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa
Tabela 1. Historia familiar e risco de CaP (adaptado de Bratt, 2002)...23
Tabela 2. Genes implicados no CaP familiar (adaptado de Hughes et al., 2005)...24
Tabela 3. Características dos anticorpos primários para imunomarcação...42
Tabela 4. Classificação Gleason dos adenocarcinomas prostáticos...52
Tabela 5. Dados clinicopatológicos e epidemiológicos...53
Tabela 6. Dados dos marcadores bioenergéticos tumorais por grupo de pacientes...54
Tabela 7. Regressão logística simples para comparação entre os grupos em relação aos marcadores...59
Figura 1. Esquema mostrando evolução do tecido normal prostático até carcinoma invasivo
(adapatado de De Marzo et al., 2007)...25
Figura 2. Diferentes estádios do adenocarcinoma prostático corados por técnica
imunohistoquímica (adapatado de Karan et al., 2002)...26
Figura 3. Os sete hallmarks do câncer e suas interações com o metabolismo tumoral (adaptado
de Kroemer e Pouyssegur, 2008)...28
Figura 4. Microscopia eletrônica mostando uma mitocondria à esquerda, e à direita outra
mitocondria em processo de divisão (adaptado de Fujioka et al., 2012)...30
Figura 5. Esquema mostrando os compartimentos internos de uma mitocondria (adaptado de
Palade, 1952)...31
Figura 6. Esquema mostrando as etapas da reação aeróbica (adaptado de Formentini et al., 2010)...33
Figura 7. Parte superior: representação esquemática da atribuição de nota para o compartimento
citoplasmático de marcação de imunoistoquímica. Parte inferior: representação esquemática da atribuição de nota para o compartimento intranuclear de marcação de imunoistoquímica...46
Figura 8. Fotomicrografias da próstata humana representativas do padrão histológico de tecido
com ausência de malignidade. (a), (b) Ácinos prostáticos com epitélio (Ep) simples compostos por células colunares secretoras, além de células basais entremeadas a essas; estroma (Es) glandular composto por fibras colágenas (Col), dispostas por toda a sua extensão, fibroblastos
(Fb), além de fibras musculares lisas (Cml). Coloração: Hematoxilina-eosina...48
Figura 9. Fotomicrografias da próstata humana representativas do padrão histológico de
Gleason 3. (c), (d) Gleason 3 caracterizado por ácinos neoplásicos (asteriscos) de caráter
infiltrativo pontiagudos e dispostos em cunha, com núcleos das células epiteliais secretoras volumosos e nucléolos proeminentes; ausência de células basais; estroma glandular composto por fibras colágenas, células musculares lisas e fibroblastos. Cml – célula muscular lisa, Col – fibras colágenas, Es – estroma, Fb – fibroblasto. Coloração: Hematoxilina-eosina...49
Gleason 4. (e), (f) Gleason 4 caracterizado por ácinos neoplásicos (asteriscos) com arranjo
cribriforme de contornos irregulares e fusão entre os mesmos (setas); estroma subjacente constituído por fibras colágenas, células musculares lisas e fibroblastos. Cml – célula muscular lisa, Col – fibras colágenas, Es – estroma, Fb – fibroblasto. Coloração: Hematoxilina-eosina...50
Figura 11. Fotomicrografias da próstata humana representativas do padrão histológico de
Gleason 5. (g), (h) Gleason 5 caracterizado por arranjo cordonal ou em pequenos ninhos das
células neoplásicas (setas) dispersas no estroma. Cml – célula muscular lisa, Col – fibras colágenas, Es – estroma, Fb – fibroblasto. Coloração: Hematoxilina-eosina...51
Figura 12. Imunolocalização dos antígenos ATPsintase (β-F1-ATPase), Hsp60 e LDH nos
grupos: tecido benigno (a, e, i), Gleason 6 (baixo grau – sem progressão bioquímica ≥ 5 anos pós-prostatectomia radical; b, f, j), Gleason 7 (grau intermediário; c, g, k) e Gleason 8 - 10 (alto grau – com progressão bioquímica ≤ 2 anos pós-prostatectomia radical; d, h, l). (a) Imunolocalização citolplasmática 32 de ATPsintase (β-F1-ATPase). (b) Imunolocalização citolplasmática 33 de ATPsintase (β-F1-ATPase). (c), (d) Imunolocalização citolplasmática 31 de ATPsintase (β-F1-ATPase). (e) Imunolocalização citolplasmática 32
de hsp60. (f), (g) Imunolocalização citolplasmática 31 de hsp60. (h) Imunolocalização citolplasmática 33 de hsp60. (i), (j) Imunolocalização citolplasmática 31 e nuclear 21 de LDH. (k) Imunolocalização
citolplasmática 31 e nuclear 22 de LDH. (l) Imunolocalização citolplasmática 32 e nuclear 23 de
LDH...55
Figura 13. Imunolocalização dos antígenos GLUT-1 e HADHSC nos grupos: tecido benigno
(m, q), Gleason 6 (baixo grau – sem progressão bioquímica ≥ 5 anos pós-prostatectomia radical; n, r), Gleason 7 (grau intermediário; o, s) e Gleason 8 - 10 (alto grau – com progressão bioquímica ≤ 2 anos pós-prostatectomia radical; p, t). (m), (n), (o) Imunolocalização citolplasmática 31 e nuclear 22 de GLUT 1. (p) Imunolocalização citolplasmática 31 e nuclear 33
de GLUT 1 (q) Imunolocalização citolplasmática 31 de HADHSC. (r), (s), (t) Imunolocalização citolplasmática 32 de HADHSC...56
Figura 14. Curvas de Kaplan-Meier para a recidiva global (IC=95%) (gráfico superior) e por
Gráfico 1. Taxa de incidência (azul) e mortalidade (vermelho) para CaP por 100.000 homens
em vários países do mundo em 2012 (adaptado de Tourinho-Barbosa et al., 2016)...22
Gráfico 2. Índice bioenergético para cada um dos três grupos de pacientes com adenocarcinoma
prostático (estratificados de acordo o grau) e para o grupo controle (ausência de malignidade), obtido por meio da relação ATPase/Hsp60/LDH (P<0,05)...57
1.1. Morfofisiologia da próstata...20 1.2. Neoplasia de próstata...21 1.2.1. Aspectos epidemiológicos...21 1.2.2. Etiologia...23 1.2.3. Progressão...24 1.2.4. Histopatologia...26 1.2.5. Prognóstico...27
1.3. Biologia molecular e oncologia...28
1.4. Metabolismo mitocondrial e oncologia...29
1.4.1. Aspectos gerais das mitocôndrias...29
1.4.2. Função das mitocôndrias...32
1.4.3. Respiração aeróbica...32
a. Glicólise...32
b. Ciclo de Krebs...33
c. Cadeia respiratória...34
1.4.4. Metabolismo mitocondrial no câncer...34
1.4.5."Assinatura bioenergética do câncer"...36
2. OBJETIVOS...40
3. MATERIAS E MÉTODOS...41
3.1. Coleta do material...41
3.2. Análise histopatológica...41
3.3.Análise imunohistoquímica...42
3.3.1. Técnica da análise imunohistoquímica...42
3.3.2. Método de análise imunohistoquímica...43
3.3.3. Localização celular da marcação e atribuição da nota...43
3.4. Determinação do Índice Bioenergético...44
3.5. Análise estatística...44
3.6. Ética em pesquisa...45
4.1.1. Análises Histopatológicas...47
4.1.2. Avaliação clínica e epidemiológica...47
4.2. Marcadores bioenergéticos...54
4.2.1. Análises Imunohistoquímicas...54
4.2.2. Comparação entre os grupos em relação aos marcadores...58
4.2.3. Análise de sobrevida livre de recidiva bioquímica e sobrevida geral..59
5. DISCUSSÃO...63
6. CONCLUSÕES...73
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...74
1. INTRODUÇÃO
1.1. Morfofisiologia da próstata
A próstata é uma glândula sexual masculina acessória que secreta diversos nutrientes que compõem o líquido seminal, fluido essencial para a nutrição e motilidade dos espermatozóides (Wilson, 2014; Aaron et al., 2016). O desenvolvimento normal da próstata inicia-se no período fetal, por ação indutiva da testosterona sobre elementos epiteliais do seio urogenital. Após um período de queiscência, a glândula apresente outro período de crescimento logo depois da puberdade, até atingir seu tamanho normal ao redor dos 20 anos de idade (Cunha et al., 1980).
No homem adulto normal a próstata é composta por 30 a 50 unidades alvéolo-tubulares imersas em um estroma fibromuscular, as quais se abrem no assoalho da uretra, lateralmente ao verumontanum, por meio de 15-30 ductos excretores. Tais unidades, constituídas por ácinos e um sistema ramificado de túbulos, agrupam-se em lóbulos ou zonas, os quais apresentam características morfofuncionais e clínicas distintas (Lee et al., 2011).
A glândula prostática é composta por diferentes tipos celulares, distribuídos nos compartimentos epitelial secretor (luminal), epitelial basal e estromal. O epitélio secretor é constituído por duas camadas morfologicamente definidas, as camadas luminal e basal, e três tipos celulares, incluindo as células secretoras (luminais), basais e neuroendócrinas (Strand et al., 2015).
O compartimento estromal é formado por um complexo arranjo de células, incluindo células musculares lisas, fibroblastos e miofibroblastos, e pela matriz extracelular, os quais provêm sinais biológicos gerais e exercem influências mecânicas sobre as células epiteliais (Kwon &Xin, 2014).
A morfogênese, a manutenção da funcionalidade e da morfologia, a proliferação e a diferenciação das células da próstata são reguladas por andrógenos. Os andrógenos são hormônios esteróides envolvidos no desenvolvimento do fenótipo masculino durante a embriogênese, no estabelecimento da maturidade sexual na puberdade e na manutenção da função reprodutiva masculina principalmente em relação à espermatogênese e ao comportamento sexual durante a vida adulta (Huang et al., 2014, Murashima et al., 2015).
1.2. Neoplasia de próstata
1.2.1. Aspectos epidemiológicos
O câncer de próstata (CaP) é a sexta neoplasia maligna mais comum no mundo em número de casos novos e o primeiro câncer mais comum em homens, excetuando-se os tumores de pele. Nos Estados Unidos observou-se um aumento progressivo no diagnóstico desta patologia desde 1984, sendo que atualmente corresponde a cerca de um terço do diagnóstico de todos os cânceres neste país (Ferlay et al., 2015).
Observa-se que negros americanos são o grupo racial com a maior incidência e também as formas mais agressivas do CaP. Projeções estatísticas estimam que o risco de um americano branco desenvolver CaP ao longo da vida é de 17,4%, enquanto que entre americanos negros é de 20,6%. Já o risco de morte pela doença é de 2,8% e 4,7%, respectivamente. Observa-se também que a prevalência e a mortalidade entre os japoneses e chineses que residem nos Estados Unidos é superior aos índices de seus parentes residentes nos países de origem. Esses dados mostram a diferença que existe no comportamento da doença entre as raças, as quais podem ser consideradas em função de diferentes exposições ambientais, dietéticas, de estilos de vida e em relação ao comportamento genético de cada uma delas (Ferlay et al., 2015; Siegel et al., 2015; Alberts et al., 2015).
CaP é raramente diagnosticado em homens com idade inferior a 50 anos, tal fato ocorrendo em menos de 1% de todos os casos. O pico de incidência ocorre em idades entre 70 e 74 anos, sendo que 85% são diagnosticados após 65 anos (Tourinho-Barbosa
et al., 2016). Estudos de autópsias mostram que a forma histológica está presente em
30% dos homens acima de 50 anos, e ocorre aumento progressivo deste percentual de acordo com a idade, alcançando virtualmente 100% aos 90 anos (Schröder et al., 2014). Embora a frequência deste tumor detectado por autópsia seja similar em diferentes partes do mundo (diferentes grupos raciais), tal achado contrasta com a incidência de CaP clínico, cuja incidência difere significativamente, dependendo da área geográfica considerada, sendo mais alta nos Estados Unidos e países nórdicos da Europa, e baixa no sudeste da Ásia; por exemplo (Romero et al., 2012). Esses achados indicam que fatores exógenos provavelmente afetam o risco de progressão do câncer latente para a sua forma clínica. A identidade desses fatores é desconhecida (Romero et al., 2012; Schröder et al., 2014).
Observa-se também diferença entre os índices de mortalidade considerando-se diversos países e regiões do mundo, como observado claramente no Gráfico 1.
Gráfico 1. Taxa de incidência (azul) e mortalidade (vermelho) para CaP por 100.000 homens
em vários países do mundo em 2012 (adaptado de Tourinho-Barbosa et al., 2016).
Desde que houve a disseminação dos métodos para o diagnóstico precoce do CaP por meio do antígeno prostático específico (PSA) e exame de toque retal, houve um aumento significativo no diagnóstico da doença órgão confinada e diminuição no diagnóstico da forma metastática, atualmente perfazendo menos de 10% ao diagnóstico (Alberts et al., 2015, Cabarkapa et al., 2016). Também houve um aumento no
diagnóstico dos CaP não palpáveis ao toque retal, chegando a 75% segundo alguns autores (Busato et al., 2016).
1.2.2. Etiologia
Não obstante a etiologia do CaP seja desconhecida, alguns fatores de risco foram inferidos na etiologia da doença (fatores genéticos, raciais, dietéticos). Dietas ricas em gorduras e/ou hipercalóricas estão associadas ao aumento de risco desta neoplasia. A ingestão de vegetais, particularmente a soja, rica em isoflavanóides; tomate, rico em licopeno; chá verde, rico em polifenóis; e morango, rico em ácido elágeno, tem aparente efeito protetor para esta neoplasia (Perdana et al., 2016).
Evidências epidemiológicas sugerem que o CaP apresenta um componente genético e familiar relevante. Nesse contexto e do ponto de vista fenotípico, esta neoplasia é classificada em: esporádica, familiar e hereditário (Carter et al., 1992; Gronberg et al., 1997, Ostrander & Johannesson, 2008).
Cânceres esporádicos (85%) ocorrem em indivíduos com história familiar negativa. A forma familiar é definida como a ocorrência dessa condição em um homem com 1 ou 2 familiares afetados pela doença. Uma pequena população de indivíduos (cerca de 9%) tem CaP hereditário verdadeiro, definido por três ou mais familiares afetados, a ocorrência desta condição em 3 gerações sucessivas ou, no mínimo, dois familiares com doença diagnosticada antes dos 55 anos de idade (Carter et al., 1992). Caso haja um parente de primeiro grau com a doença, o risco relativo é, no mínimo, duas vezes maior do paciente também desenvolver a doença. Esse risco tende a aumentar na proporção que aumenta o número de pessoas acometidas com idade mais precoce (Tabela 1) (Carter et al., 1992; Gronberg et al., 1997; Bratt, 2002).
Tabela 1. Historia familiar e risco de CaP (adaptado de Bratt, 2002).
História familiar Risco relativo de CaP Risco Absoluto de CaP (%)
Negativa 1 8
Pai ou irmão > 60 anos 2 15
Pai ou irmão < 60 anos 3 20
Pai e irmão 4 30
Trabalhos recentes vêm dando cada vez mais relevância para os fatores genéticos na gênese do CaP, sobretudo em pacientes que tenham história familiar da doença. Alguns genes já foram identificados e relacionados com o CaP não esporádico, como o HPC1, HPCX, CAPB e HPC2, com suas respectivas localizações cromossômicas identificadas (Tabela 2) (Hughes et al., 2005; Febbo, 2009; Wallis & Nam, 2015).
Tabela 2. Genes implicados no CaP familiar (adaptado de Hughes et al., 2005).
Gene Localização
HPC1 1q24-25
HPCX Xq27-28
CAPB 1p36
HPC2 1q42
Nos últimos anos têm merecido especial atenção mutações nos genes BCRA1 e BCRA2. Tais genes são supressores tumorais e ambos são herdados de forma autossômica dominante com penetrância incompleta. Ambos genes codificam proteínas de alto peso molecular as quais atuam em múltiplas células do organismo. BRCA1 atua no controle celular, tendo sido associado a uma variedade de processos celulares, como danos ao reparo do DNA, regulação transcricional e modelagem de cromatina. Por outro lado, a função do BRCA2 parece estar limitada aos processos de recombinação e reparação do DNA, sendo particularmente importante na regulação da atividade da RAD51. A perda de função de BCRA1 ou BRCA2 está associada à deficiência na reparação de rupturas da dupla cadeia de DNA pelo mecanismo conservador de recombinação homóloga. Apesar de estar presente em apenas 1-2% de casos esporádicos de CaP, as mutações no gene BRCA2 conferem maior risco de CaP (8 vezes) em pacientes com mais de 65 anos. BRCA1 também foi associado a um aumento do risco de CaP esporádica (3,5 vezes), mesmo que tais mutações tenham sido observadas em somente 0,44% de todos os casos de CaP (Castro & Eeles; 2012).
1.2.3. Progressão
Embora não estejam completamente elucidados os eventos relacionados ao desenvolvimento do CaP, alguns autores aceitam modernamente que ele se desenvolve a
partir de alterações genéticas associadas a um microambiente inflamatório (Sfanos et
al., 2013).
Tal microambiente caracteriza-se por atrofia inflamatória proliferativa (AIP), em que se encontra aumento da proliferação das células epiteliais com a presença de grandes infiltrados inflamatórios (Sfanos & De Marzo, 2012). Billis afirma que a AIP esta intrinsecamente relacionada com atrofia prostática (Billis, 2010).
Histologicamente, as células epiteliais proliferativas da AIP começam a perder a estrutura colunar característica se transformando em células cubóides e os ácinos perdem as suas invaginações características (De Marzo et al., 2007; Sfanos & De Marzo, 2012).
Evidências sugerem que lesões da AIP podem ser precursoras da neoplasia intraepitelial da próstata (NIP), embora tal posicionamento não se mostre unanime entre os pesquisadores. A NIP é caracterizada por ter células de formas variadas e aumento no tamanho do núcleo das células dos ductos e ácinos. O CaP localizado, caracterizado sobretudo pela perda da camada de células basais e da arquitetura normal da glândula, pode ser oriundo da progressão da NIP (Gonzalo & Isaacs, 2003; De Marzo et al., 2007; Sfanos & De Marzo, 2012) (Figura 1).
Figura 1. Esquema mostrando evolução do tecido normal prostático até carcinoma invasivo
(adaptado de De Marzo et al., 2007).
Na doença metastática, o CaP caracteriza-se pela ausência de membrana basal, grande invasão do estroma e formação glandular ausente. Tais alterações histopatológicas são acompanhadas por mudanças na expressão de vários genes e por perdas genéticas, as quais contribuem para a progressão e agressividade do tumor (Gonzalo & Isaacs, 2003; De Marzo et al., 2007).
1.2.4. Histopatologia
Cerca de 95% dos cânceres prostáticos constituem-se de adenocarcinoma, sendo o restante constituído por sarcomas, carcinoma epidermóide e tumor de células transicionais. O CaP é originário dos ácinos prostáticos e localiza-se em 70 a 90% das vezes na zona periférica (ZP) da glândula, o que permite que muitas vezes as lesões sejam diagnosticadas por meio do toque retal (Humphrey, 2004; Gordetsky & Epstein, 2016).
Em aproximadamente 85% dos casos os CaP são multicêntricos, e caracterizam-se por caracterizam-serem heterogêneos com áreas de maior ou menor indiferenciação celular, o que dificulta a graduação histológica (Humphrey, 2004).
O sistema de graduação histológica mais empregado é o de Gleason, que valoriza o padrão glandular e a relação entre a glândula e o estroma prostático. Classifica-se em cinco graus histológicos, sendo o grau 1 a lesão mais diferenciada e o 5, a mais indiferenciada (Gordetsky & Epstein, 2016). Como o padrão histológico do CaP é bem heterogêneo, o diagnóstico final é dado pelo escore de Gleason, que é a soma dos graus das duas subpopulações predominantes de células no tecido (Figura 2). Esse escore está relacionado com o prognóstico, sendo que quanto menor, melhor o prognóstico do paciente (Karan et al., 2002; Humphrey, 2004, Gordetsky & Epstein, 2016, Epstein et
al., 2016).
Figura 2. Diferentes graduações histológicas do CaP corados por técnica imunoistoquímica
Ressalta-se que em cerca de 40% dos casos há uma discordância entre o Gleason da biópsia prostática guiada por ultrassonografia e o escore de Gleason do espécime de prostatectomia radical (PRR) (Humphrey, 2004).
Uma outra limitação da classificação de Gleason é a ampla variação que apresenta enter e interobservador, amplamente discutida na literatura médica (Karan et al., 2002; Humphrey, 2004). Que pese todas essas ponderações, nenhum outro sistema de classificação tem suplantado sua aceitação ao longo dos anos (Gordetsky & Epstein, 2016).
1.2.5. Prognóstico
Cada vez mais um número maior de variáveis vem sendo atribuídas como
influenciadoras no prognóstico do CaP. Dentre essa variáveis destacam-se a extensão da doença, o grau histológico de Gleason, o valor do PSA e o volume tumoral. Observa-se ainda com especial importância a presença de extensão extraprostática e invasão de vesículas seminais ao exame histopatológico dos espécimes de PRR, dois fatores marcadamente de mal prognóstico (Magi-Galluzzi et al. 2011; Berney et al., 2011) O tempo de duplicação tumoral é lento comparativamente com outros tumores, variando entre 2 e 5 anos. As metástases do CaP são preferencialmente para linfonodos da cadeia obturatória e em pacientes de baixo grau não ultrapassa 5% dos casos. Posteriormente o sítio metastático mais comum são os ossos e mais tardiamente outros órgãos sólidos, como fígado, pulmão e cérebro. A probabilidade de metástases é função crescente do grau de indiferenciação das células tumorais (Karan et al., 2002; Humphrey, 2004).
O CaP é potencialmente letal nos pacientes jovens e/ou com tumores indiferenciados. Apresenta menor agressividade biológica nos idosos ou em tumores bem diferenciados. Portadores de tumores de grande volume, avançados e/ou com alto grau de anaplasia têm evolução significativamente mais rápida e desfavorável do que os demais. Tumores prostáticos com Gleason maior que 7 tem diferenças estatísticas relevantes em relação à recorrência bioquímica, sobrevida geral e matásteses à distância, sendo desta forma, inequivocadamente, marcadores de mau prognóstico (Karan et al., 2002; Humphrey, 2004; Gordetsky & Epstein, 2016; Epstein et al., 2016).
1.3. Biologia molecular e oncologia
O câncer pode ser considerado uma doença genética heterogênea e complexa baseada na transformação de células normais em malignas por mutação em oncogenes e genes supressores tumorais. Para que tal evento ocorra e seja viabilizado, é necessário um microambiente celular favorável somado a outros eventos que favoreçam a transformação (Hanahan & Weinberg, 2000).
É bem aceito na literatura médica que são necessários seis eventos para proporcionar a transformação de células benignas em malignas: capacidade ilimitada de replicação, angiogênese sustentada, evasão de apoptose, auto-suficiência na transmissão de sinais de crescimento, insensibilidade ao bloqueio de sinais de crescimento e invasão/metástase tecidual (Schulz et al., 2006). Hanahan e Weinberg acrescentam, numa revisão, o sétimo evento como sendo a inibição das funções imunológicas anti-tumorais, tais com linfócitos T citotóxicos e células natural killer (Figura 3) (Hanahan & Weinberg, 2000).
Figura 3. Os sete hallmarks do câncer e suas interações com o metabolismo tumoral (adaptado
Recentemente tem-se procurado adicionar à lista de hallmarks a importância do metabolismo energético das células tumorais, ressaltando o desbalanço entre a atividade mitocondrial e a glicogênese anaeróbia. Trabalhos recentes têm mostrado a relevância e a implicação deste tópico em algumas neoplasias humanas, no que se refere a diagnóstico, seguimento, prognóstico e tratamento de tais neoplasias. Contudo, o estudo deste assunto em neoplasias urológicas ainda é escasso (Hanahan & Weinberg, 2000; Kroemer & Pouyssegur, 2008; Hanahan & Weinberg, 2011). Este trabalho procura estudar o metabolismo energético das células tumorais como um possível hallmark para o CaP.
1.4. Metabolismo mitocondrial e oncologia
1.4.1. Aspectos gerais das mitocôndrias
As mitocôndrias são organelas celulares intracitoplasmáticas com tamanho variando de 0,5 a 10 micrômetros. As mitocôndrias estão presentes em quantidade variável nas células dependendo das necessidades energéticas. Apresentam-se em alta concentração no sistema nervoso (extremidade dos axônios), coração e músculos, uma vez que esses órgãos apresentam uma necessidade maior de energia. A principal peculiaridade das mitocondrias em relação às demais organelas citoplasmática é que, a exemplo dos cloroplastos e centríolos, apresentam material genético próprio independente do núcleo celular e possuem a capacidade de autoduplicação (Figura 4) (Ernster & Schatz, 1981; Picard et al., 2016).
Foram descritas por Altmann, em 1894 que as denominou "bioblastos", sugerindo a sua relação com o fenômeno da oxidação celular. Está presente na maioria dos seres eucariontes, exceto num grupo específico de seres do reino Protista (Ernster & Schatz, 1981).
As mitocôndrias formam uma extensa rede, denominada rede mitocondrial. Essa rede é constituída por subunidades mitocondriais que podem se fundir ou se dividir de acordo com as necessidades fisiológicas (Ernster & Schatz, 1981).
Figura 4. Microscopia eletrônica mostando uma mitocondria à esquerda e à direita outra
mitocondria em processo de autoduplicação (adaptado de Fujioka et al., 2012).
As mitocôndrias apresentam algumas características em comum com seres procariontes. Como resultado, tem ganhado espaço a teoria de que elas originalmente derivem de procariotas endossimbióticas (teoria da endossimbiose). Tal teoria tem sustentação no seguinte tripé: o ácido DNA mitocondrial assemelha-se com o DNA das bactérias atuais, apresentando-se de forma circular e não em fitas; as mitocôndrias não apresentam núcleo organizado; e o fato de terem uma camada dupla de lipídeos, resultante da eventual fagocitose (Kutschera & Niklas, 2005; Picard et al., 2016).
As mitocôndrias apresentam duas membranas: uma externa e outra interna. Ambas são compostas de bicamadas de fosfolípidos e proteínas. Apresentam uma distribução tal que permite uma divisão dentro de cada mitocôndria em cinco compartimentos distintos (Figura 5) (Ernster & Schatz, 1981). São eles:
1. Membrana mitocondrial externa,
2. Espaço intermembranoso (espaço entre a membrana externa e interna), 3. Membrana mitocondrial interna,
4. Cristas mitocondriais (formado por invaginações da membrana interna), 5. Matriz mitocondrial (espaço interior à membrana interna).
Figura 5. Esquema mostrando os compartimentos internos de uma mitocondria (adaptado de
Palade, 1952).
A membrana mitocondrial externa tem uma proporção de proteína e de fosfolípidos semelhante ao da membrana plasmática eucariótica (cerca de 1:1 em peso). Contém um grande número de proteínas integrais chamadas porinas as quais formam canais que permitem que as moléculas de até 5000 Daltons de peso molecular difundem-se livremente de um lado para o outro da membrana. A ruptura da membrana externa permite que as proteínas no espaço intermembranar extravazem para o citosol, conduzindo à morte celular inevitável (Ernster & Schatz, 1981).
O espaço intermembranoso é o espaço compreendido entre a membrana externa e a interna da mitocôndria. O fato da membrana externa ser livremente permeável a moléculas pequenas, faz com que as concentrações de tais moléculas como íons e açúcares no espaço intermembranar, sejam as mesmas do citosol. No entanto, as proteínas grandes devem ter uma sequência específica de sinalização para serem transportadas através da membrana externa, de modo que a composição de proteínas deste espaço é diferente da composição de proteínas do citosol. Uma proteína que está
localizada no espaço intermembranar desta maneira é o citocromo c (Ernster & Schatz, 1981).
A membrana interna mitocondrial interna apresenta duas membranas fosfolipídicas, uma externa lisa e outra interna que se dobra formando vilosidades, chamadas cristas mitocondriais. A região limitada pela membrana interna é conhecida como matriz mitocondrial, onde existem proteínas, ribossomas e o DNA mitocondrial (Ernster & Schatz, 1981).
1.4.2. Função mitocondrial
As mitocôndrias vêm apresentando um papel cada vez mais relevante na medicina, e alterações relacionadas a elas têm sido imputadas, em não raras vezes, como causa primária de uma série de enfermidades. Essas organelas apresentam três funções principais (Cuezva et al., 2009; Picard et al., 2016):
1. produção de energia para a célula desempenhar suas funções vitais (função bioenergética),
2. geração de espécies reativas tóxicas,
3. regulação da morte celular programada (apoptose).
Dentre essas funções daremos ênfase à bioenergética, foco deste trabalho.
1.4.3. Respiração aeróbica
A respiração aeróbica nos seres vivos é caracterizada fundamentalmente pela utilização do oxigênio (O2) para a quebra da molécula de glicose. Para fins didáticos ela normalmente é dividida em três fases:
a. Glicólise
Esta fase acontece no citoplasma da célula, fora da mitocôndria. Por ação enzimática, uma molécula de glicose (6 carbonos) é quebrada em duas moléculas menores de ácido pirúvico (cada uma com 3 carbonos). A partir delas, por ação também de enzimas ocorre a liberação de dióxido de carbono (CO2), transformando-as em ácido
trifosfato (ATP), molécula responsável pelo armazenamento de energia. O ácido acético resultante combina-se com a co-enzima A formando a acetil-CoA, o qual é transportado para o interior da mitocôndria para dar sequência ao processo (Figura 6) (Ernster & Schatz, 1981; Lopez-Rios et al., 2007)
Figura 6: Esquema mostrando as etapas da reação aeróbica (adaptado de Formentini et al.,
2010).
b. Ciclo de Krebs
Esta fase ocorre na matriz mitocôndrial. A molécula de acetil CoA faz com que o ácido pirúvico se una com uma molécula de ácido oxaloacético (composta de 4 carbonos). Ao unirem-se, forma-se uma molécula composta de seis carbonos, 12
hidrogênios e seis oxigênios (mesma da glicose, porém com os hidrogênios em posição diferente), agora chamada de ácido cítrico. A molécula de acetil CoA sai da reação para voltar a carregar mais moléculas de ácido acético para completar o ciclo. Nesta fase há formação de 2 moléculas de ATP (Figura 6) (Ernster & Schatz, 1981; Cuezva et al., 2009; Formentini et al., 2010).
c. Cadeia respiratória
Sendo a fase mais energética da respiração aeróbica, ela acontece na crista da mitocôndria. É a única fase em que há utilização de oxigênio para a quebra de moléculas, caracterizando a respiração como aeróbica propriamente dita. A molécula de ácido cítrico é quebrada por moléculas de oxigênio, fazendo com que, ao invés de separar em moléculas menores, como o ocorrido na primeira fase, as moléculas são quebradas perdendo um oxigênio por vez. Assim, o ácido cítrico de seis carbonos é quebrado por uma molécula de O2 em uma molécula de cinco carbonos, liberando CO2,
água (H2O) e energia para a formação de ATP (Figura 6) (Ernster & Schatz, 1981; Formentini et al., 2010; Dang, 2012)
É a partir desta quebra, que se forma o ácido oxaloacético, utilizado para juntar-se com o ácido pirúvico na juntar-segunda fajuntar-se. Na maioria das células, o número de moléculas totais de ATP produzidas é 36. Entretanto há células como as do coracão, rins e fígado cujo total é de 38 moléculas de ATP (Ernster & Schatz, 1981; Formentini et al., 2010; Dang, 2012). Os produtos finais da respiração celular é o CO2, H2O e ATP.
1.4.4. Metabolismo mitocondrial no câncer
As células cancerosas exibem um padrão metabólico muito diferente daquele encontrado nas células saudáveis diferenciadas (Kroemer & Pouyssegur, 2008; Dang, 2012). Por serem células em rápido processo proliferativo tanto a demanda por O2 quanto a síntese de macromoléculas necessitam ser readequadas para a progressão tumoral. Dessa maneira cria-se um campo de estudo promissor e atraente, visando o metabolismo energético celular como um possível alvo terapêutico para diversos tipos de neoplasias (Zong et al., 2016).
Os tecidos tumorais caracterizam-se por apresentar populações celulares que perderam o controle sobre a divisão celular. Dentre uma série de alterações intracelulares observadas nas células tumorais, tem-se a peculiaridade de as células cancerosas produzem energia preferencialmente pela glicólise em detrimento da fosforilação oxidativa mitocondrial (Rossignol et al., 2004; Zong et al., 2016).
Em condições de normalidade e estabilidade celular, a fosforilação oxidativa fornece energia preferencialmente para o citoplasma enquanto a glicólise o faz para o núcleo. O núcleo parece ser o compartimento mais susceptível à deficiência de ATP, não somente nas células normais como também nas células malignas (Gajewski et al., 2004; Potter et al., 2016).
Vários tipos celulares neoplásicos metabolizam glicose pela via glicolítica (fenômeno conhecido como efeito Warburg). Esse processo se caracteriza por elevado consumo de glicose e produção de lactato, independentemente do aporte de O2 (DeBerardinis & Chandel, 2016; Tran et al., 2016). A glicólise é frequentemente acompanhada por um aumento na captação de glicose. O produto final do metabolismo energético ATP é crucial para a manutenção dos processos celulares (Potter et al., 2016).
As células tumorais são metabolicamente adaptadas para um rápido crescimento e proliferação em condições hostis, como pH ácido e baixas tensões de O2; condições nas quais as células normais dificilmente conseguiriam sobreviver. As células cancerosas parecem se adaptar ao microambiente criado, alterando seu padrão metabólico em direção ao uso de combustíveis celulares (glicose, lipídios e aminoácidos) mais rapidamente e eficientemente que as células normais. O consumo desses nutrientes tem basicamente dois destinos preferenciais: geração de ATP via glicolítica e fosforilação oxidativa; e biossíntese de macromoléculas (DNA, lipídios de membranas e proteínas) (Kroemer & Pouyssegur, 2008; Dang, 2012; Potter et al., 2016; DeBerardinis & Chandel, 2016; Tran et al., 2016).
As células neoplásicas apresentam uma grande variedade de estados de diferenciação, indo desde células altamente diferenciadas aparentando células originais normais, com a glicólise normal e uma baixa taxa de crescimento; até células altamente indiferenciadas com alta taxa glicolítica e rápida velocidade de crescimento (Baggetto, 1992; Dang, 2012; Liberti & Locasale, 2016).
Uma série de alterações mitocondriais foi verificada ao logo dos anos em células tumorais, dentre as quais citamos diminuição do número de mitocôndrias, diminuição
da quantidade de DNA mitocondrial, diminuição da atividade da cadeia respiratória, alteração ultraestrutural da cadeia de transporte de elétrons e diminuição do efluxo de citratro do Ciclo de Krebs (Hanahan & Weinberg, 2000; Griffiths, 2001; Formentini et al., 2010; Dang, 2012).
Às alterações mitocondriais supramencionadas vêm se somando cada vez mais à análise de marcadores envolvidos na bioenergética celular, denominado na literatura atual de "assinatura bioenergética do câncer". Estes estudos mostram que a alteração da função bioenergética da mitocondria é uma pedra fundamental da carcinogênese, como já de suspeitava desde 1926 (Cuezva et al., 2002; Ramaswamy et al., 2003).
O foco deste item do trabalho está em se procurar caracterizar a “assinatura bioenergética do CaP” estratificado por seus graus tradicionalmente mencionados na literatura médica.
1.4.5."Assinatura bioenergética do câncer"
As recentes técnicas de biologia molecular permitiram a análise do padrão de expressão de genes e proteínas associados com o fenótipo de alguns tipos de tumores, proporcionando conhecimento da assim denominada "assinatura bioenergética do câncer" (Ramaswamy et al., 2003).
A maioria dos trabalhos que estudaram o metabolismo bioenergético de células neoplásicas o fez avaliando a concentração da subunidade β-catalítica do complexo H+ -ATP sintetase (β-F1--ATPase), proteína de choque 60 (Hsp 60) e a série de marcadores presentes na via glicolítica (Cuezva et al., 2002; Cuezva et al., 2004; Isidoro et al., 2004).
A partir das respectivas concentrações supramencionadas se calcula o índice bioenergético celular (BEC index) obtido a partir da relação β-F1-ATPase:Hsp 60: um dos marcadores da via glicolítica (Cuezva et al., 2002; Cuezva et al., 2004; Isidoro et
al., 2004).
Observou-se a partir de então, que para determinados tipos histológicos tumorais, quando de comparava tecido neoplásico ao tecido normal, havia diferença estatística em relação à concentração dos marcadores bioenergéticos referidos (Isidoro et al., 2004). De um modo geral a expressão da β-F1-ATPase e da Hsp 60 apresentou-se significantemente reduzida no adenocarcinoma de mama e gástrico, no carcinoma de pulmão e no carcinoma epidermóide de esôfago, sugerindo fortemente que a alteração
da função bioenergética das mitocôndrias participa da gênese desses tumores (Cuezva et
al., 2002; Cuezva et al., 2004; Isidoro et al., 2004).
A consequência metabólica do impedimento à fosforilação oxidativa mitocondrial é o desvio da produção de ATP celular para vias alternativas a esta via principal. Diante do microambiente alterado e inóspito causado pela condição tumoral, as células neoplásicas são apresentadas à necessidade de garantir a manutenção de energia intracelular por formas menos convencionais à que normalmente está habituada. Outras formas alternativas para obtenção de ATP intracelular são: glicólise anaeróbia, alterações no aporte intracelular de glicose, alterações no metabolismo de lipídios (síntese e β oxidação) e catabolismo da glutamina. Todas essas formas de obtenção de energia isoladamente produzem menos ATP quando comparadas à fosforilação oxidativa mitocontrial. A esta alteração na reprogramação do metabolismo energético em células tumorais, observada desde a década de 1920, damos atualmente o nome de
efeito Warburg, devido ao fato de ter sido primeiramente observada por este autor
germânico (Hanahan & Weinberg, 2000; Griffiths, 2001; Formentini et al., 2010; Dang, 2012).
Ao se estudar a glicólise, autores observaram que os marcadores desta via estavam elevados em relação ao tecido normal; o GAPDH (gliceraldeido-fosfato-dehidrogenase) no câncer de mama, pulmão, colo-retal, gástrico e rins e o PK (pirofosfato- quinase) nos tumores de mama (Cuezva et al., 2002; Cuezva et al., 2004; Isidoro et al., 2004). Desta forma, muitas destas enzimas intracelulares são consideradas “enzimas-reguladoras”, pois controlam pontos metabólicos irreversíveis e que, portanto, são bons indicadores da velocidade e relevância da via glicolítica para obtenção de ATP. O controle da glicólise anaeróbia está associado à ativação ou inibição de algumas “enzimas-chave”, dentre as quais a lactato desidrogenase (LDH). A LDH é a enzima responsável pela interconversão piruvato-lactato, sendo esta parte imprescindível do processo que assegura à célula suprimento de ATP, mesmo em condições de baixo débito de O2 (hipóxia) (Kroemer & Pouyssegur, 2008; Dang, 2012). Dessa maneira essa enzima é fundamental para a glicólise e para manutenção do efeito Warburg.
Para que ocorra a captação de glicose para o interior celular, tanto células normais quanto células cancerosas utilizam transportadores de membrana específicos. O grupo mais importante de transportadores de glicose para o meio intracelular denomina-se GLUT. Dentro deste grupo composto de vários subtipos, o GLUT-1 é o que apresenta maior distribuição tecidual no organismo, sendo o principal responsável pela
captação basal de glicose na maioria das células normais e também cancerosas. Diversos tipos de neoplasias humanas mostraram aumento na expressão desses receptores, o que é coerente com o maior aporte energético requisitado pelas células tumorais para manter sua capacidade metabólica elevada (Yamamoto et al., 1990; Macheda et al., 2005).
Além da glicose, outro combustível bastante consumido pelas células tanto normais quanto neoplásicas são os lipídios. Similarmente às alterações marcantes que ocorrem no metabolismo da glicose, estudos em pacientes com câncer sugerem que muitas vezes também há aumento no turnover, oxidação e depuração de ácidos graxos livres. A síntese de ácidos graxos nos tecidos tumorais ocorre em taxas muito mais elevadas que em condições normais de estabilidade celular (Barger & Plas; 2010). Demonstrou-se que em células tumorais, quase todos os ácidos graxos derivam da síntese de novo, mesmo que haja fornecimento nutricional adequado. Além disso, os tumores que sobreexpressam a ácido graxo sintetase (FAS), a enzima responsável pela síntese de novos ácidos graxos, apresentam comportamento biológico mais agressivo em comparação com os tumores com níveis normais de FAS, sugerindo que a sobreexpressão FAS confere uma vantagem de crescimento seletivo (Barger & Plas; 2010). A oxidação de uma molécula de ácido graxo garante um suprimento maior de ATP comparado ao catabolismo da glicose. Além disso, o metabolismo celular de carboidratos e de lipídios estão intimamente interrelacionados (Biswas et al; 2012; Carracedo et al., 2013). Uma destas enzimas marcadora da via de oxidação dos ácidos graxos é 3-hidroxiacil-CoA-desidrogenase (HADHSC).
As células neoplásicas enfrentam dois grandes desafios: como atender as demandas bioenergéticas e biossintéticas do crescimento e proliferação celular aumentados e, como empreender estratégias de adaptação metabólica para sobreviver a flutuações ambientais de disponibilidade de nutrientes e O2 quando o crescimento tumoral ultrapassa a capacidade de abastecimento da vascularização existente. Para suprir essas demandas, as células neoplásicas reorganizam todos os mecanismos de sinalização celular relacionados com as vias de controle de crescimento e todo o seu processo metabólico com o objetivo de aumentar as reações anabólicas necessárias para manter a viabilidade tumoral. Como todas as células neoplásicas são dependentes desta alteração metabólica, essas vias alteradas representam um importante alvo terapêutico. O entendimento de como as células neoplásicas é capaz de assegurar um balanço energético positivo e associá-lo a processos anabólicos é vital para o desenvolvimento
de terapias eficazes no combate ao câncer. O estudo do metabolismo energético visa compreender e indicar, por exemplo, qual combustível está sendo utilizado preferencialmente, de qual via está participando esse combustível, quais são os fatores que regulam ou modulam a velocidade dessas vias, entre outros.
Assim sendo, os objetivos do presente estudo foram caracterizar e correlacionar o metabolismo energético celular como potenciais marcadores de relevância clínico-patológica e prognósticos para a classificação dos CaP de baixo, intermediário e alto graus.
2. OBJETIVOS
Os objetivos do presente estudo foram caracterizar e correlacionar o metabolismo energético celular como potencial marcador de relevância clínico-patológica e prognósticos para a classificação dos CaP de baixo, intermediário e alto graus, em comparação com o grupo controle com ausência de malignidade. Tais objetivos gerais foram alcançados através dos seguintes objetivos específicos:
a) Revisar as lâminas para a caracterização da histopatologia das amostras prostáticas com ausência de malignidade e com CaP de baixo, intermediário e alto grau.
b) Caracterização e comparação por meio imunomarcação do metabolismo energético -ATPsintase, Hsp60 (ambos marcadores mitocondriais), LDH (marcador
glicolítico), GLUT-1 (marcador da membrana celular), HADHSC (marcador da via lipídica) – em células prostática com ausência de malignidade; e com CaP de
baixo, intermediário e alto grau.
c) Avaliar se há diferença entre os grupos propostos em relação às características clínicas e anatomopatológicas, por meio de testes estatísticos adequados para cada situação.
d) Correlacionar cada um dos grupos de CaP de baixo, intermediário e alto grau com possíveis imunomarcadores do metabolismo energético, e por meio de testes estatísticos adequados inferir possibilidades de relevância clínico-patológica e prognóstico.
e) Estabelecer o BEC para cada um dos quatro grupos referidos e procurar correlacioná-lo como possível marcador de relevância clínico-patológica e prognóstico no CaP.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta do material
No presente trabalho foram utilizadas amostras prostáticas provenientes de 40 de pacientes na faixa etária de 50 a 75 anos com e sem diagnóstico de CaP, obtidas no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Amostras prostáticas de 10 pacientes foram provenientes de necropsia sem diagnóstico de lesão prostática maligna. Por outro lado, as amostras prostáticas dos outros 30 pacientes com diagnóstico de CaP foram provenientes de espécimes de PRR.
Os pacientes foram divididos em 4 grupos (10 pacientes cada): Grupo Controle (tecido prostático benigno), Grupo Adenocarcinoma de baixo grau (Escala de Gleason≤6, sem progressão bioquímica ≥ 5 anos pós-PRR); Grupo Adenocarcinoma de grau intermediário (Escala de Gleason=7, com progressão bioquímica pós-PRR >2 anos e <5 anos) e Grupo Adenocarcinoma de alto grau (Escala de Gleason>7, com progressão bioquímica pós-PRR ≤ 2 anos).
Posteriormente, as amostras prostáticas foram submetidas às análises histopatológicas e imunoistoquímicas.
3.2. Análise histopatológica
Amostras prostáticas de todos os pacientes (n=40) foram fixadas por imersão em formaldeído tamponado 10% por doze horas. Após a fixação, os tecidos foram lavados em álcool etílico a 70%, com posterior desidratação em uma série crescente de álcoois. Posteriormente, os fragmentos foram diafanizados (clareados) com xilol por 2 horas e inclusos em polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, EUA). Em seguida, os materiais foram seccionados no micrótomo Leica RM 2165 (Leica, Munique,
Alemanha) com espessura de 5 micrômetros, corados com Hematoxilina-Eosina e
fotografados no fotomicroscópio Axiophot (Zeiss, Munique, Alemanha). O diagnóstico de CaP foi baseado em critérios morfológicos consagrados no literatura médica e analisado por um patologista sênior com ampla experiência no assunto.
3.3. Análise imunohistoquímica
3.3.1. Técnica da análise imunoistoquímica
Amostras prostáticas de todos os pacientes (n=40), as mesmas utilizadas para as análises histopatológicas, foram utilizadas para as imunomarcações. A seguir foram obtidos cortes com 5 µm de espessura no micrótomo rotativo Biocut 1130
(Reichert-Jung, Munique, Alemanha), coletados em lâminas silanizadas. A recuperação antigênica
foi realizada por incubação dos cortes em tampão citrato (pH 6.0) a 100ºC em microondas ou tratamento com proteinase K, dependendo das características de cada anticorpo. O bloqueio das peroxidases endógenas foi obtido com H2O2 (0,3% em metanol) com posterior incubação em solução bloqueadora com albumina de soro bovino (BSA) 3%, em tampão TBS-T por 1 hora em temperatura ambiente. Posteriormente, os antígenos ATPsintase, Hsp60 (ambos marcadores mitocondriais), LDH (marcador glicolítico), GLUT-1 (marcador da membrana celular), HADHSC (marcador da via lipídica) foram localizados através dos anticorpos primários específicos (Tabela 3), diluídos em BSA 1% e armazenados overnight a 4 ºC. O kit MACH 4 Universal HRP-Polymer (Biocare Medical, EUA) foi usado para detecção dos antígenos, de acordo com as instruções do fabricante. Após lavagem com tampão TBS-T, os cortes foram incubados com anticorpo secundário HRP conjugado proveniente do kit MACH 4 por 40 minutos e, posteriormente revelados com diaminobenzidina (DAB), contra-corados com Hematoxilina de Harris e avaliados no fotomicroscópio Nikon Eclipse Ni-U (Nikon, Tóquio, Japão) equipado com câmera Nikon DS-RI-1 (Nikon, Tóquio, Japão).
Tabela 3. Características dos anticorpos primários para imunomarcação
Anticorpos Primários Espécie hospedeira Código Fonte
ATPsintase (β-F1-ATPase) Camundongo (monoclonal) MBS190588 MyBioSource, EUA
Hsp60 Coelho (policlonal) ab46798 abcam, EUA
LDH Coelho (policlonal) ab47010 abcam, EUA
GLUT-1 Coelho (policlonal) ab652 abcam, EUA
3.3.2. Método de análise imunoistoquímica
O método utilizado neste trabalho busca atribuir uma nota de marcação de imunoistoquímica a cada imagem capturada em aumento de 400x. Assim, procurou-se a área de tumor previamente delimitada por um patologista sênior e procedeu-se com a fotomicrografia. No caso do grupo normal, as áreas estudadas foram analisadas previamente por um patologista sênior a fim de certificar-se da inexistência de lesão. Por fim, buscou-se criar um espectro de notas para estimar a intensidade de cada marcação do compartimento epitelial, bem como classificar tal marcação como sendo “intranuclear” ou “citoplasmática” para que dessa forma pudessemos inferir numericamente as variações de intensidade das proteínas avaliadas neste trabalho. Dessa forma, a análise do epitélio neoplásico teve como premissa avaliar: “Localização Celular da Marcação” e “Atribuição da Nota”.
3.3.3. Localização celular da marcação e atribuição da nota
Em cada lâmina analisada, a marcação foi analisada em duas possíveis localizações celulares: localização A (intranuclear) e localização B (todo o citoplasma) (Figura 9). Sendo que para cada compartimento atribuída uma nota (Fávaro et al., 2011)
Para cada localização celular, a nota, de 0 a 3, foi determinada baseada em dois parâmetros: Percentil de Células Marcadas e Intensidade de Marcação.
a. Percentil de Células Marcadas (PCM): seguindo o seguinte padrão na imagem coletada no campo de aumento de 400x:
- Nota 0: nenhuma célula marcada;
- Nota 1: no de células marcadas entre 0 e ≤ 50%; - Nota 2: no de células marcadas entre 50% e < 100%. - Nota 3: 100% de células marcadas.
b. Intensidade de Marcação (int): baseada no acúmulo de grânulos citoplasmáticos ou no material nuclear marcados na localização celular. Para isto, tomou-se como referência a quantidade de citoplasma/material nuclear visível entre os grânulos, sendo a nota atribuída da seguinte forma:
- Nota 1 – leve: é possível ver citoplasma/material nuclear claramente entre os grânulos;
- Nota 2 – moderada: é possível ver citoplasma/material nuclear, porém com predomínio de acúmulo de grânulos;
- Nota 3 - intensa: a marcação cobre todo o citoplasma/ material nuclear.
A nota final para cada marcação em cada possível localização celular segue a fórmula abaixo:
Nota = (PCM)int, sendo PCM > 0 e int > 0
Com a ressalva de que, quando não houver marcação (PCM = 0 e int = 0), não houve sentido na atribuição da nota.
Ao final da análise das fotomicrografias das marcações imunoistoquímicas de cada um dos pacientes de cada grupo (grupo CaP de baixo grau, grupo CaP de alto grau, grupo CaP de grau intermediário e grupo normal), a marcação de cada uma das proteínas englobadas neste trabalho recebeu um valor numérico representando a moda encontrada no grupo, ou seja, da marcação predominante entre as amostras, e um valor representando a média das notas encontrados em cada amostra do grupo. As marcações levaram em conta o padrão dominante de PCM e int nos grupos estudados (Figura 7).
3.4. Determinação do Índice Bioenergético
O Índice Bioenergético foi determinado a partir da relação β-F1-ATPase/ Hsp60/LDH (Cuezva et al., 2004) para cada um dos três grupos de pacientes com CaP e também para o grupo controle.
3.5. Análise estatística
As variáveis clínicas epidemiológicas numéricas contínuas dos 30 pacientes com CaP foram avaliadas pelas medidas de posição e dispersão: média aritmética, desvio padrão, mínimo, máximo e mediana. Para as variáveis clínicas epidemiológicas categóricas foram calculadas as medidas de frequência e porcentagem.
