No presente estudo, observou-se a densidade celular serotonérgica nas subdivisões dorsal e caudal do NDR após consumo e retirada de álcool, visto que estas regiões tem um papel importante na modulação das emoções. Transtornos de ansiedade e depressão são observados em pacientes dependentes de álcool, principalmente durante o período de abstinência. Tais emoções os predispõe ao comportamento de beber para o alívio dos sintomas negativos, continuando o ciclo prejudicial da dependência do álcool.
Em roedores, dentre as respostas comportamentais observadas no período de abstinência alcoolica, destacam-se as respostas defensivas relacionadas à ansiedade
(BONASSOLI; MILANI; DE OLIVEIRA, 2011; LOWERY-GIONTA;
MARCINKIEWCZ; KASH, 2015; OVERSTREET et al., 2006; SANTOS, 2014; FLEMING et al., 2019; SIDHU; KREIFELDT; CONTET, 2018; METTEN et al., 2018). Santos (2014) avaliou os efeitos da retirada de 72 horas e de 21 dias após consumo de álcool por 21 dias sobre comportamento de ratas Wistar submetidas ao teste do labirinto em cruz elevado e do campo aberto. A pesquisadora observou um aumento no comportamento do tipo ansioso das fêmeas dos grupos retirada em curto e em longo prazo do álcool submetidas ao labirinto em cruz elevado, pois as mesmas diminuíram o tempo de exploração dos braços abertos do aparato. Ainda, foi visto um efeito do tipo ansiogênico da retirada em longo prazo no teste do campo aberto; as ratas deste grupo diminuíram a exploração da área central do aparato, quando comparadas às fêmeas do grupo controle (SANTOS, 2014).
Junqueira-Ayres e colegas (2017) utilizando ratos Wistar e o mesmo protocolo de exposição e retirada do álcool empregado por Santos (2014) e do presente estudo, observaram um aumento do comportamento do tipo ansioso nos animais que passaram pela retirada alcoolica em curto prazo (72 h), mas não nos animais do grupo retirada em longo prazo (21 dias) (JUNQUEIRA-AYRES et al., 2017). Estes resultados indicam uma diferença dos comportamentos ansiogênicos atribuídas ao gênero. É relatado na literatura que mulheres sofrem mais de transtornos emocionais do tipo ansiosos (MCLEAN et al., 2011); desta forma, pode ser sugerido fêmeas tenham maior sensibilidade e se recuperem mais lentamente dos sintomas ansiosos provocados consumo a longo prazo e retirada do álcool.
Apesar da possibilidade de investigar os efeitos da exposição e da abstinência do álcool sobre o sistema serotonérgico em pacientes e em animais de laboratório, os dados
disponíveis na literatura são conflitantes. Por exemplo, o nível do metabólito da serotonina, o ácido 5-HIAA, no líquido cefalorraquidiano de pacientes dependentes de álcool de início precoce (antes dos 25 anos de idade) abstinentes encontra-se mais baixo do que em dependentes de início tardio (depois dos 25 anos de idade) (FILS-AIME et al., 1996). Estudos avaliando os níveis de 5-HIAA e de triptofano no líquido cefalorraquidiano de pacientes do sexo feminino com dependência de álcool encontraram que apenas o 5-HIAA estava diminuído nestas pacientes, quando comparados à indivíduos controles (BANKI, 1981), sugerindo que o baixo nível de 5-HT e seus metabólitos não seja devido a uma deficiência nutricional ou alteração do transporte destes no líquido cefalorraquidiano (BANKI, 1981).
Outros estudos conduzidos em humanos (post mortem), avaliando a região do NDR, observaram um aumento significativo da enzima triptofano hidroxilase no DRD de indivíduos suicidas deprimidos dependentes de álcool (BONKALE; TURECKI; AUSTIN, 2006). Ainda, em outro estudo post mortem, foi relatado um aumento dos processos neuronais serotonérgicos em toda porção do NDR de indivíduos dependentes de álcool, sugerindo que a síntese do neurotransmissor estaria aumentada (UNDERWOOD; MANN; ARANGO, 2007).
Esta discrepância de resultados é também observada em estudos com animais de laboratório avaliando o efeito do álcool sobre a transmissão serotonérgica: baixos níveis de 5-HT e 5-HIAA foram encontrados no encéfalo de roedores que possuem preferência pelo álcool, quando comparados à animais sem preferência pelo álcool. Nos animais com preferência pelo álcool, os níveis do neurotransmissor e seu metabólito estavam reduzidos no córtex, no hipocampo, no corpo estriado, no tálamo e no hipotálamo (MURPHY et al., 1982).
Outros trabalhos investigaram os efeitos da exposição e da retirada de álcool sobre a transmissão serotonérgica especificamente no NDR de roedores. Yamane e colaboradores (2003), testaram o efeito do tratamento com álcool por 14 dias (concentração de 50%, via subcutânea) sobre a síntese de 5-HT no encéfalo de ratos e sugeriram que não houve aumento da atividade serotonérgica no NDR após este tratamento. Eles observaram, por meio de análise autorradiográfica, um aumento da taxa de síntese de 5-HT em alguns grupos celulares descendentes da rafe, em estruturas nigroestriatais, no hipocampo e no córtex, mas não encontraram mudanças na atividade de síntese nos núcleos dorsal e mediano da rafe no corpo pineal (YAMANE;
TOHYAMA; DIKSIC, 2003). Estes dados corroboram com o achado do presente estudo, no qual a exposição ao álcool por 21 dias não alterou a densidade celular serotonérgica nas subdivisões dorsal e caudal do NDR.
Porém, no estudo conduzido por Shibasaki e colaboradores (2010), foi observado um aumento no RNA mensageiro para o transportador de 5-HT (5-HTT) na região mesencefálica superior contendo o NDR (grupos celulares B6 e B7) de camundongos machos após o tratamento com vapor de álcool por 9 dias (SHIBASAKI et al., 2010). Os autores sugeriram que este aumento, acompanhado de uma elevada expressão do 5-HTT em áreas de projeção, como córtex, hipocampo e núcleo accumbens, representaria uma resposta adaptativa a um aumento de 5-HT liberada durante a exposição prologada ao álcool. Confirmando a hipótese de que a exposição ao álcool em longo prazo aumenta a transmissão serotonérgica no NDR, Yoshimoto e colaboradores (2012) encontraram um aumento no metabolismo de 5-HT (proporção aumentada de 5-HIAA:5-HT) no NDR de camundongos machos C57BL ⁄6J tratados com vapor de álcool intermitente por 20 dias (YOSHIMOTO et al., 2012). Curiosamente, no estudo de Shibasaki e colaboradores (2010), em outra área de projeção do NDR envolvida na modulação das emoções, a amígdala, houve uma redução na expressão da proteína 5-HTT, o que ilustra quão complexo é avaliar os efeitos do álcool sobre a transmissão serotonérgica. Além disso, diferenças metodológicas, tais como protocolo de exposição ao álcool, diferenças interespécies, bem como acuidade em relação às áreas do NDR consideradas para análise podem contribuir para as divergências entre os achados de trabalhos aumentando o nível de complexidade de compreensão dos efeitos do álcool sobre o sistema serotonérgico.
É importante considerar também, a diversidade de receptores serotonérgicos presentes no NDR. Neste sentido, Kelai e colaboradores (2008) mostraram que camundongos expostos ao consumo voluntário de álcool durante 21 dias exibiram uma aumentada sensibilidade do autorreceptor 5-HT1A, que é inibitório, nesta área. Encontraram este resultado quando administraram um agonista do receptor 5-HT1A e a potência deste agonista foi aumentada no NDR dos animais que consumiram álcool, aos serem comparados com o grupo controle (KELAÏ et al., 2008). Já o trabalho de Yoshimoto e colaboradores (2012) demonstrou um aumento de receptores excitatórios dos subtipos 5-HT2A e 5-HT2C no NDR de camundongos após exposição prolongada ao vapor de álcool por 20 dias (YOSHIMOTO et al., 2012).
A mesma complexidade pode ser observada quando os efeitos da retirada do álcool são investigados. Um estudo utilizando a técnica de eletrofisiologia, no qual foi avaliada a atividade de neurônios no NDR de camundongos DBA2/J após exposição ao vapor de álcool por 5 dias, registrou um aumento da excitabilidade e uma redução da transmissão inibitória no NDR durante a retirada alcoolica de 24 horas (LOWERY- GIONTA; MARCINKIEWCZ; KASH, 2015). Analisando o efeito da retirada por um período maior, de 7 dias, os pesquisadores observaram o aumento da transmissão excitatória no NDR ainda presente. Os autores sugeriram que o aumento da excitabilidade no NDR seria devido ao aumento de receptores glutamatérgicos e do próprio neurotransmissor glutamato (LOWERY-GIONTA; MARCINKIEWCZ; KASH, 2015). Corroborando estes achados, Bonassoli e colegas (2011) observaram uma maior marcação para proteína Fos (marcadora de atividade neuronal) indicando maior ativação de neurônios do NDR em um período de 24 horas de abstinência alcoolica após 21 dias de consumo de solução de álcool concentrada em 6 a 8% (BONASSOLI; MILANI; DE OLIVEIRA, 2011).
No presente trabalho, a retirada em longo prazo aumentou significativamente a densidade de células imunomarcadas para serotonina na porção média do DRD e no DRC. Porém na porção rostral e caudal do DRD dos animais, nenhum dos tratamentos provocaram alteração da densidade celular serotonérgica. Na porção caudal DRD foi possível observar uma tendência de aumento da densidade no grupo retirada alcoolica em longo prazo, porém o teste estatístico não evidenciou diferenças significativas. Os neurônios do NDR recebem diferentes aferências ao longo do eixo rostrocaudal (veja o Quadro 1). Aqueles localizados na porção média NDR recebem pesadas aferências de regiões moduladoras de respostas e comportamentos emocionais como a amígdala e bed nucleus da estria terminal, já os neurônios mais rostrais NDR não recebem estas mesmas aferências (PEYRON et al., 1998; REN et al., 2018). Assim o padrão de distribuição de aferências no NDR poderia explicar a diferença da densidade celular observada nas diferentes porções do DRD vista neste estudo.
Durante a retirada do álcool, há uma maior excitabilidade em neurônios do NDR, provavelmente mediada pelo aumento na transmissão glutamatérgica (LOWERY- GIONTA; MARCINKIEWCZ; KASH, 2015). Como o glutamato consegue gerar potenciais de ação em neurônios serotonérgicos por sua ação em receptores específicos, tais como receptores NMDA (BELMER; MAROTEAUX, 2018; DE KOCK et al., 2006),
seria plausível sugerir que a atividade de neurônios serotonérgicos esteja aumentada no NDR na retirada do álcool por 21 dias. Ainda, pode ser sugerido aumento da síntese do neurotransmissor 5-HT, por isso pode ser observado aumento da densidade celular.
Neste trabalho, a retirada do álcool por 72 horas não alterou a densidade de células marcadas para serotonina nas porções do DRD e no DRC. Curiosamente, Pistis e colaboradores (1997) observaram que na retirada de 12 horas após 6 dias de tratamento com álcool (concentração 20%, via intragástrica), houve uma diminuição da taxa média de disparo de neurônios serotonérgicos do NDR de ratos, no intervalo de bregma -7,7 a - 7,9 mm.
Corroborando com a ausência de efeito encontrado no presente estudo, com 72 horas de retirada alcoolica, os autores observaram uma normalização dos disparos de neurônios serotonérgicos no NDR (PISTIS et al., 1997). Considerando que estes autores não consideraram as diferentes subáreas do NDR em sua análise eletrofisiológica, permanece por ser investigado se outras porções do NDR, como a ventrolateral e a ventral, estariam envolvidas na modulação da retirada a curto prazo do álcool e quais sistemas de neurotransmissão participam nesta modulação.
Como descrito anteriormente, as porções DRD/DRC podem ser ativadas por substâncias e estímulos ansiogênicos (ABRAMS et al., 2005; GARDNER et al., 2005; EVANS; HEERKENS; LOWRY, 2009; HAMMACK et al., 2002; STAUB; SPIGA; LOWRY, 2005). Tanto o DRD, como o DRC possuem projeções para áreas associadas com a modulação das emoções, tais como amígdala e suas extensões (como o bed nucleus da estria terminal), hipotálamo paraventricular e hipocampo ventral (COMMONS; CONNOLLEY; VALENTINO, 2003; IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986; CALHOON; TYE, 2015; REN et al., 2018). Então, se o aumento na marcação para 5-HT observado no presente trabalho representar um aumento da atividade de neurônios serotonérgicos e aumento da síntese e liberação de 5-HT nestas áreas encefálicas terminais, tal aumento poderia favorecer alterações comportamentais observadas durante a abstinência alcoolica.
De acordo com Deakin e Graeff (1991), projeções serotonérgicas do NDR são ativadas por estímulos aversivos condicionados (estímulos neutros que adquirem propriedades aversivas), e estão envolvidas no estado de ansiedade antecipatória a estes potenciais estímulos ou ambientes nocivos. Os autores propuseram que a 5-HT facilita comportamentos de evitação, congelamento e vigilância, quando liberada na amígdala e em outras áreas prosencefálicas, podendo funcionar como um sistema modulador da
ansiedade antecipatória ou um sistema favorecedor do medo. Eles também propuseram que a 5-HT pode interromper respostas de luta/fuga mediadas por áreas envolvidas no sistema de defesa ativado por ameaças próximas, dentre elas a substância cinzenta periaqueductal (DEAKIN; GRAEFF, 1991). Quando as ameaças são detectadas à distância pela amígdala, respostas autonômicas e respiratórias da substância cinzenta periaqueductal são ativadas, mas a resposta de luta/fuga é interrompida pela ação da 5- HT liberada na região, vinda de projeções do NDR. Assim, Deakin (2013) sugeriu que a ansiedade antecipatória pode guiar o organismo discretamente para longe da ameaça (DEAKIN, 2013).
Com base nos dados comportamentais previamente observados no laboratório e nos de imunoistoquímica aqui apresentados, poderia ser proposta a hipótese de que o aumento na marcação de 5-HT aqui observado seja importante para a expressão do comportamento do tipo ansiogênico causado pela retirada em longo prazo, mas não em curto prazo, do álcool. Sendo assim, um aumento de 5-HT no NDR estaria relacionado a um aumento na liberação de 5-HT em áreas de projeções deste núcleo, dentre elas, a amígdala e o bed nucleus da estria terminal.
De fato, na amígdala o aumento de 5-HT contribuiu para respostas de ansiedade (CHRISTIANSON et al., 2010; REN et al., 2018). Pesquisadores observaram que ao ativar neurônios do núcleo dorsal da rafe que se projetavam para o núcleo central da amígdala, a liberação e aumento de serotonina na região favorecia um comportamento do tipo ansioso nos animais (REN et al., 2018). Ainda, quando ratos eram expostos a um estímulo estressante incontrolável (choque nas patas), havia um aumento de 5-HT na amígdala basolateral capaz de ativar receptores 5-HT2C e favorecer respostas de ansiedade (CHRISTIANSON et al., 2010). De maneira interessante, quando os receptores 5-HT2C na amígdala eram previamente antagonizados, impedindo parte da ação serotonérgica, ocorria uma atenuação do comportamento do tipo ansioso exibido na retirada de 5 horas após 15 dias de exposição ao álcool (OVERSTREET et al., 2006). Permanece por ser investigado se o efeito do tipo ansiogênico observado por Santos (2014) utilizando o mesmo protocolo de retirada (72 horas e, principalmente, 21 dias) empregado no presente estudo envolve a ativação de receptores 5-HT2C ou de outros subtipos de receptores em áreas de projeção do DRD e do DRC, como a amígdala e o bed nucleus da estria terminal.
No bed nucleus da estria terminal, a 5-HT liberada pode interagir com um subconjunto de neurônios CRF despolarizando-os, via ativação de receptores 5-HT2C (MARCINKIEWCZ et al., 2016). E o CRF liberado pode interagir com receptores CRF- 1, favorecendo comportamentos do tipo ansiosos (HUANG et al., 2010). Estudos mostraram que animais que foram expostos cronicamente ao álcool e depois passaram pelo processo de retirada de 4,5 a 9 horas apresentaram altos níveis de CRF no bed nucleus da estria terminal (OLIVE et al., 2002). Desta forma, ainda que o período de abstinência seja maior, o aumento de 5-HT nesta região, favorecendo o aumento na transmissão mediada por CRF poderia, também, contribuir para respostas ansiogênicas vistas na retirada em longo prazo do álcool.
Outra hipótese que poderia ser levantada seria a possibilidade da liberação da serotonina vesicular do NDR ocorrer localmente via soma, dendritos e axônios (COLGAN; PUTZIER; LEVITAN, 2009; COLGAN et al., 2012; BRUNS et al., 2000), estar modulando localmente a atividade de neurônios do NDR (ADELL et al., 2002; ANDRADE et al., 2015). Esta hipótese é corroborada por estudos de microinjeção de drogas, os quais demonstram que a administração do agonista parcial de receptores 5- HT1A buspirona no NDR reduziu os efeitos comportamentais da retirada de 5 horas de álcool (OVERSTREET et al., 2003). E, quando se administrou um agonista inverso (efeitos semelhantes à antagonistas) de receptores 5-HT2, não houve redução do comportamento do tipo ansioso no teste de interação social. Isto porque estes receptores estão presentes em interneurônios GABAérgicos no NDR, e a inibição destes poderia ter retirado o controle inibitório sobre o neurônios serotonérgicos (OVERSTREET et al., 2006). Ainda, quando se administrou ondansteron, um antagonista seletivo do receptor 5- HT3, no NDR houve uma redução dos efeitos comportamentais da retirada de álcool por 48 horas (COSTALL et al., 1990). Considerando que os receptores 5-HT3 estão presentes em interneurônios glutamatérgicos no núcleo dorsal da rafe (MONTI; JANTOS, 2008), permanece por ser investigado se a liberação extrasináptica de serotonina contribui para o aumento na transmissão serotonérgica observada na retirada do álcool em longo prazo.
Limitações técnicas do trabalho. No presente estudo, o DRD foi dividido inicialmente em três intervalos, devido sua longa extensão e mudança de formato ao longo do eixo rostrocaudal. Já para avaliação do DRC, a porção não foi dividida, devido a mesma ser mais curta. Para avaliação do efeito dos tratamentos na densidade de células
imunomarcadas, foram analisadas todas as lâminas disponíveis previamente preparadas dos animais de cada grupo. O número de animais era reduzido (6 animais por grupo), e em alguns deles não foram encontrados cortes representativos dos intervalos ou estavam com algum dano devido ao processamento das amostras durante a microtomia ou histologia. Este fato contribuiu para redução do conjunto de dados principalmente durante a análise do DRC. Pela proximidade desta porção com o aqueduto, durante a microtomia possivelmente os cortes se rasgaram e quando foram observados no microscópio foram excluídos da análise. Desta forma, estas limitações dificultaram a avaliação do efeito dos tratamentos sobre a densidade de células marcadas nas porções do NDR. Ainda, não foi possível repetir os experimentos, para aumentar o conjunto de dados, pois o biotério estava passando por reforma e assim havia um número baixo de animais disponíveis.