UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL
MARYELLE DE CÁSSIA ALBINO
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CONSUMO EM LONGO PRAZO E DA RETIRADA DE ÁLCOOL SOBRE CÉLULAS SEROTONÉRGICAS NO NÚCLEO
DORSAL DA RAFE EM RATAS
NATAL, RN 2019
MARYELLE DE CÁSSIA ALBINO
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CONSUMO EM LONGO PRAZO E DA RETIRADA DE ÁLCOOL SOBRE CÉLULAS SEROTONÉRGICAS NO NÚCLEO
DORSAL DA RAFE EM RATAS
Dissertação de Mestrado apresentada como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Estrutural e Funcional, pelo Curso de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Orientadora: Profª. Drª. Vanessa de Paula Soares Rachetti
NATAL, RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Albino, Maryelle de Cássia.
Avaliação dos efeitos do consumo em longo prazo e da retirada de álcool sobre células serotonérgicas no núcleo dorsal da rafe em ratas / Maryelle de Cássia Albino. - 2019.
64f.: il.
Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Curso de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional, Natal, 2019.
Orientadora: Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti.
1. Álcool - Dissertação. 2. Sistema Nervoso Central -
Dissertação. 3. Serotonina - Dissertação. 4. Desordens Emocionais - Dissertação. I. Rachetti, Vanessa de Paula Soares. II. Título. RN/UF/BCZM CDU 576
TÍTULO: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CONSUMO EM LONGO PRAZO E DA
RETIRADA DE ÁLCOOL SOBRE CÉLULAS SEROTONÉRGICAS NO NÚCLEO DORSAL DA RAFE EM RATAS.
AUTOR: MARYELLE DE CÁSSIA ALBINO
DATA DE DEFESA: 08/04/2019
BANCA AVALIADORA
Prof. Dr. Janaína Menezes Zanoveli Departamento de Farmacologia - UFPR
Prof. Dr. Anna Karynna Alves de Alencar Rocha Departamento de Fisiologia e Comportamento - UFRN
Prof. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti – Orientadora Departamento de Biofísica e Farmacologia - UFRN
Agradeço primeiramente a Deus, por todas as oportunidades me dadas até aqui. Por estar do meu lado, por ter me dado saúde e força para prosseguir.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade oferecida de realizar o curso, pelo acolhimento e apoio ao aluno. Agradeço aos docentes, técnicos e todos os funcionários pelo suporte e por todo conhecimento compartilhado.
À minha Orientadora, Professora Vanessa de Paula Soares Rachetti. Pela receptividade, pela confiança depositada, pelo ensino, paciência, incentivo e amizade. Agradeço por todas as conversas e pelo aprendizado. Agradeço imensamente pelo o carinho transmitido e apoio em todos os momentos.
À Raliny, pelo esforço e dedicação na etapa inicial de tratamento dos animais e preparo do material. Atividades que foram fundamentais para realização do trabalho.
À Professora Mariana Araújo, ao seu aluno João Rodrigo e à todos os colaboradores do Instituto de Neurociências de Macaíba, pela disponibilidade de recursos e apoio técnico importantíssimos na coleta e análise dos dados. Agradeço especialmente à professora Mariana pela disposição em ajudar e sempre contribuir para melhora do trabalho.
Aos Professores Expedito Junior e Judney Cavalcante do departamento de Morfologia da UFRN, pelas valiosas contribuições realizadas na qualificação. Pela disponibilização e oferecimento de recursos do Laboratório de Neuroanatomia.
Aos meus familiares. Aos meus pais, Solimar e Paulo (em memória), agradeço por todos os ensinamentos e pelo amor incondicional. Agradeço com muito amor a minha mãe, pelo cuidado, pela dedicação, pelo apoio, por sempre acreditar e incentivar os meus sonhos. Agradeço especialmente a minha Dindinha, pelo apoio no dia a dia, pelos conselhos e pela proteção. Aos meus irmãos Isabelly e Lucas e à toda minha família, por me trazerem sorrisos, abraços, conversas e apoio. Ao meu namorado e amigo, Gabriel, pelo companheirismo, amor e paciência. Agradeço pelo incentivo e apoio do dia a dia. Agradeço por todo carinho.
Aos meus amigos do Laboratório de Farmacologia, Luana, Renato, Ana, Camila, Juliete e Nathalia. Especialmente, à Lu e ao Renato, pela amizade, pelos dramas e sorrisos compartilhados deixando a caminhada mais leve. Aos amigos da turma do curso pela união e apoio. Especialmente à Rebeca (Beca), pelo ombro amigo, pelas orações e pela
companhia durante esta jornada. Aos amigos da república, sr. David, Paulo, Rayanne e Regina, por serem os melhores vizinhos que já tive (risos), por todo apoio e amizade.
Gratidão a todas as pessoas que contribuíram diretamente ou indiretamente para realização deste trabalho. Gratidão por contribuírem para meu crescimento profissional e pessoal.
RESUMO
O uso contínuo do álcool pode provocar neuroadaptações prejudicando o funcionamento normal do sistema nervoso central. Dentre as vias de neurotransmissão alteradas, está o sistema serotonérgico, o qual possui um papel fundamental na mediação das emoções. É conhecido que este sistema se apresenta disfuncional durante o consumo em longo prazo e na retirada de álcool, com desregulação do nível de serotonina e de seus metabólitos e até do nível seus receptores. Tais mudanças, podem favorecer desordens afetivas e comportamentais observadas em indivíduos dependentes. Mulheres constituem um grupo de risco para transtornos emocionais; por isto, neste trabalho foi avaliado se o consumo crônico e a retirada do álcool promovem alterações na densidade celular serotonérgica em diferentes porções da subdivisão dorsal (DRD) e na subdivisão caudal (DRC) do núcleo dorsal da rafe de ratas Wistar. O núcleo dorsal da rafe contêm um grande número de neurônios serotonérgicos e as subdivisões DRD e DRC se projetam para áreas envolvidas com respostas emocionais, como amígdala, bed nucleus da estria terminal, hipotálamo paraventricular e hipocampo ventral. Os animais foram submetidos a concentrações crescentes de álcool (2%, 4% e 6%) como única fonte de dieta líquida por 21 dias ou água (grupo controle). Todos os grupos tiveram livre acesso à ração. Após este período de tratamento, o álcool foi substituído por água e os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca e remoção dos encéfalos 72 horas após a substituição (grupo retirada curto prazo) ou 21 dias após a substituição (grupo retirada longo prazo). Depois, foi realizada uma análise imunoistoquímica para detecção de células imunorreativas para serotonina (5-HT) no DRD e no DRC. Foi observado que a retirada a longo prazo produziu efeito de aumento da densidade de células imunomarcadas para 5-HT na região média do DRD e no DRC. Em conjunto, pode ser sugerido que este aumento na densidade celular esteja relacionado com desregulação de respostas emocionais e comportamentais observadas no período de abstinência alcoolica em longo prazo.
Palavras-chave: Álcool; Retirada; Sistema Nervoso Central; Serotonina; Núcleo Dorsal
Long-term alcohol abuse may cause neuroadaptations impairing the normal functioning of the central nervous system. Among the altered neurotransmission pathways, there is serotonergic system that plays a fundamental role in the mediation of emotions. It is known that this system is dysfunctional during long-term use e withdrawal of alcohol, with deregulation of the serotonin level and this metabolites and even the level of this receptors. Such changes may favour affective and behavioural disorders observed in dependent individuals. Women constitute a risk group for emotional disorders; so, this study evaluated whether long-term consumption and withdrawal of alcohol promoted changes in serotonergic cell density in the dorsal (DDR) and caudal (DCR) subdivisions of the dorsal raphe nucleus of female Wistar rats. The dorsal nucleus of the raphe contains a large number of serotonergic neurons and the DDR e DCR subdivisions project into areas involved with emotional responses, such as amygdala, bed nucleus of the terminal stria, paraventricular hypothalamus, and ventral hippocampus. The animals were submitted to increasing concentrations of alcohol (2%, 4% and 6%) as the unique source of liquid diet for 21 days or water (control group). Both groups had free access to the feed. After this treatment period, the alcohol was replaced with water and the animals were submitted to transcardiac perfusion and brain removal 72 hours after replacement by water (short term withdrawal group) or 21 days after replacement by water (long term withdrawal group). Immunohistochemical analysis was performed the detection of immunoreactive cells for serotonin (5-HT) in the DDR and DCR. It was observed that long-term withdrawal produced an increase in the density of 5-HT immunolabelled cells in the middle region of DDR and in DCR. Taken together, it may be suggested that this increased in density of 5-HT immunolabelled cells is related to the dysregulation of emotional and behavioural responses observed in the period of long-term alcohol withdrawal.
Key words: Alcohol; Withdrawal; Central Nervous System; Serotonin; Dorsal Raphe
5-HT 5-hidroxitriptamina, serotonina
5-HTP 5-hidroxitriptofano
5-HIAA Ácido 5-hidroxi-indolacético
5-HTT Transportador específico para serotonina
AMPc 3-5-monofosfato cíclico
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
CRF Fator liberador de corticotrofina
CRF-1 Receptores do tipo 1 para CRF
CFR-2 Receptores do tipo 2 para CRF
DRD Porção dorsal do núcleo dorsal da rafe
DRV Porção ventral do núcleo dorsal da rafe
DRVL Porção ventrolateral do núcleo dorsal da rafe
DRI Porção interfascicular do núcleo dorsal da rafe
DRC Porção caudal do núcleo dorsal da rafe
GABA Ácido gama-aminobutírico
GABAA Receptor do tipo A para GABA
HPA Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal
MAO Enzima monoaminoxidase
NDR Núcleo dorsal da rafe
NMDA Receptor N-metil-D-aspartato
SNC Sistema nervoso central
TF Tampão fosfato 0,1M, pH 7,4
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. Considerações Gerais ... 1
1.2. O álcool ... 4
1.2.1. Metabolismo ... 4
1.2.2. Interações com sistemas de neurotransmissão... 5
1.3. A serotonina ... 10
1.3.1. Neuroanatomia do sistema serotonérgico ... 10
1.3.2. Influência do sistema serotonérgico das porções dorsal e caudal do núcleo dorsal da rafe na modulação de comportamentos emocionais ... 17
2. OBJETIVOS ... 18
2.1. Objetivo Geral ... 18
2.2. Objetivos Específicos ... 18
3. METOLODOLOGIA ... 19
3.1. Animais ... 19
3.2. Protocolo de consumo e retirada de álcool ... 19
3.3. Perfusão transcardíaca ... 21
3.4. Microtomia ... 21
3.5. Imunoistoquímica para 5-HT ... 22
3.5.1. Análise das lâminas de imunoistoquímica para 5-HT ... 22
3.6. Análise Estatística ... 25
4. RESULTADOS ... 26
4.1. Densidade celular serotonérgica no DRD de fêmeas ... 26
4.2. Densidade celular serotonérgica no DRC de fêmeas ... 30
5. DISCUSSÃO ... 32
6. CONCLUSÃO ... 40
1. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações Gerais
O uso do álcool como bebida de consumo é antigo e demasiadamente influenciado por fatores culturais, religiosos e sociais. Devido a legalização e fácil acesso, a efeitos iniciais de desinibição comportamental, sensação de bem-estar, humor alegre e diminuição da ansiedade, o consumo do álcool é amplo na sociedade e difundido em todo mundo. Porém, o uso abusivo e repetido pode causar sérios danos à saúde física e mental do indivíduo, além de favorecer prejuízos no contexto familiar, econômico e social (DASGUPTA; LANGMAN, 2012; PETRAKIS et al., 2002).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, o consumo de álcool é um fator de risco para o desenvolvimento de um grande número de doenças, incluindo cirrose hepática, cânceres envolvendo o sistema gastrointestinal e doenças cardiovasculares. Além disso, é um fator incidente em lesões por confrontos violentos, acidentes de trânsito e suicídios. Em 2016, o uso nocivo do álcool provocou a morte de 3,3 milhões de pessoas (5,3% de todas as mortes) em todo mundo, possuindo índice de mortalidade maior do que doenças como tuberculose, síndrome da imunodeficiência adquirida e diabetes. Desta estimativa, 2,3 milhões de mortes foram de homens e 0,7 milhões de mulheres. Aproximadamente 28,7% do total dos óbitos foram atribuídos a lesões, 21,3% devido a doenças do trato digestivo, 12,9% a doenças infecciosas e 12,6% por cânceres (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018).
De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, DSM-V (AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION APA, 2013), o álcool é classificado como uma das substâncias capazes de induzir transtorno de dependência química. Este transtorno é considerado um distúrbio encefálico e pode ser identificado quando o indivíduo manifesta em um período de doze meses pelo menos dois dos seguintes critérios descritos na tabela a seguir:
Tabela 1. Critérios utilizados para identificação de transtornos relacionados ao uso do álcool – DSM V. 1. O álcool é frequentemente consumido grandes quantidades ou por um período mais longo do que o pretendido.
2. Há um desejo persistente ou esforços malsucedidos no sentido de reduzir ou controlar o uso do álcool.
3. É gasto muito tempo com atividades necessárias para a obtenção de álcool, na utilização de álcool ou recuperação dos seus efeitos.
4. Fissura, desejo intenso ou urgência de consumir álcool.
5. Uso recorrente de álcool resultando em fracasso em cumprir obrigações importantes no trabalho, na escola ou em casa.
6. Uso continuado de álcool, apesar de uns problemas sociais ou interpessoais persistentes ou recorrentes causados ou exacerbados pelos efeitos do álcool.
7. Importantes atividades sociais, profissionais ou recreativas são abandonadas ou reduzidas em virtude do uso do álcool.
8. Uso recorrente de álcool em situações nas quais isto representa perigo para a integridade física.
9. O uso do álcool é mantido apesar da consciência de ter um problema físico ou psicológico persistente ou recorrente que tende a ser causado ou exacerbado pelo álcool.
10. Tolerância, definida por qualquer um dos seguintes aspectos:
a) Necessidade de quantidades progressivamente maiores de álcool para alcançar a intoxicação ou o efeito desejado.
b) Acentuada redução do efeito com o uso continuado da mesma quantidade de álcool.
11. Abstinência, manifestada por qualquer um dos seguintes aspectos:
a) Síndrome de abstinência característica, quando o uso pesado e prolongado de álcool é reduzido ou cessado. O indivíduo pode apresentar dois ou mais dos seguintes sintomas no período de algumas horas a alguns dias após a interrupção: hiperatividade autonômica (por exemplo sudorese ou frequência cardíaca maior que 100 bpm), tremor aumentado nas mãos, insônia, náusea ou vômitos, alucinações ou ilusões visuais, táteis ou auditivas transitórias, agitação psicomotora, ansiedade, convulsões tônico-clônicas generalizadas. b) Álcool é consumido para aliviar ou evitar os sintomas de abstinência. Fonte: AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION APA, 2013.
A abstinência alcoolica, causa um grande sofrimento ao indivíduo. Para o entendimento das alterações no organismo devido à exposição prolongada e retirada de álcool, uma variedade de modelos animais tem sido desenvolvidos. Os pesquisadores submetem os animais (por exemplo, roedores) a exposição ao álcool utilizando técnicas
como administração forçada de álcool por infusão intragástrica; exposição ao vapor de álcool em caixa inalatória; administração de álcool na dieta líquida; consumo voluntário de álcool em contexto livre escolha entre beber álcool ou água, dentre outras. Depois o álcool é retirado, e a dependência química pode ser evidenciada com o surgimento de sintomas de abstinência como hiperatividade do sistema nervoso autônomo (batimentos cardíacos acelerados, constrição de vasos sanguíneos e aumento da pressão sanguínea), redução da ingestão de comida e água, diarreia, alteração no controle de temperatura, tremores e piloereção. Além disso, os animais podem apresentar comportamentos do tipo ansiosos e de agressividade em testes comportamentais. Grande parte destas medidas fisiológicas e comportamentais correspondem aos sinais e sintomas observados em humanos dependentes alcoolicos (BECKER, 2000).
É relatado na literatura que os sintomas de abstinência alcoolica tanto em humanos quanto em animais segue padrão temporal de apresentação. Na ausência de comorbidade e do uso de outras drogas, são descritas três fases de abstinência: aguda, precoce e prolongada (HEILIG et al., 2010).
A abstinência aguda ocorre aproximadamente em período de 48 a 72 horas nos humanos e de 24 a 48 horas nos animais. Esta fase é marcada pela hiperexcitabilidade generalizada do sistema nervoso central (SNC), tremores, hiperatividade do sistema nervoso autônomo, risco de delirium tremens, convulsões e sintomas psicológicos como, distúrbios de humor e de sono. Após a primeira semana de retirada, sintomas físicos agudos raramente são encontrados (HEILIG et al., 2010).
A abstinência precoce pode ocorrer no período de 3 a 6 semanas em humanos e 1 a 2 semanas em animais. É um período intermediário, no qual há continuação dos sintomas de ansiedade, baixo humor e sono perturbado (HEILIG et al., 2010).
Já a fase de abstinência prolongada, é considerada acima 3 meses em humanos e acima de 1 mês em animais. Nesta fase, além da ansiedade e da disforia, há alteração do processamento afetivo. Desafios pequenos, normalmente insignificantes, provocam afeto negativo, desejo e recaída ao álcool. Ainda pode haver atenuação ou ausência de respostas positivas esperadas para eventos normalmente agradáveis (HEILIG et al., 2010).
Os sintomas físicos da abstinência diminuem com os dias, mas os sintomas psicológicos como transtornos psicóticos, bipolares, depressivos, de ansiedade, entre outros, podem permanecer por um longo período e levar o indivíduo à recaída ao álcool a fim de alívio e, consequentemente, a continuar o ciclo prejudicial de dependência da
bebida alcoolica (AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION APA, 2013; KOOB, 2009).
1.2. O álcool 1.2.1. Metabolismo
Após administração oral, o álcool pode ser oxidado no estômago por isoformas da enzima álcool desidrogenase. Em estado de jejum, o álcool pode passar rapidamente para o duodeno, onde é absorvido. Na circulação sanguínea, é distribuído na água corporal e, em menor proporção, no tecido adiposo. Cerca de 90%-98% da metabolização do álcool ingerido ocorre no fígado pela enzima álcool desidrogenase. Por meio de ação oxidativa, esta enzima biotransforma o álcool, formando acetaldeído. O acetaldeído, uma molécula altamente reativa, é transformado em ácido acético rapidamente, pela enzima aldeído desidrogenase. Grande parte do ácido acético deixa o fígado, se direcionando para tecidos periféricos, nos quais é transformado em acetil-CoA e participa do metabolismo energético das células. O restante da metabolização do álcool pode ser realizado pela enzima catalase e por enzimas da família do citocromo P450 (CYP2E1). Pequena concentração do álcool na circulação pode permanecer inalterado e pode ser eliminado via urina, ar exalado e suor (BRUNTON et al., 2015; CEDERBAUM, 2012; KLAASSEN; WATKINS, 2012).
Os sintomas de intoxicação ocorrem quando a concentração de álcool no sangue é alta (5-10 mmol/L). Em humanos há uma sensação de euforia ou desinibição comportamental. A medida que a concentração aumenta, a função motora é prejudicada e a fala fica arrastada. Entre 200 mg/dL e 300 mg/dL (entre 43 mmol/L e 65 mmol/L) de álcool no sangue pode ocorrer vômito e estupor. E, em concentrações de 500 mg/dL (109 mmol/L) pode ocorrer insuficiência respiratória, coma e morte (DAVIES, 2003).
Grande parte destes efeitos são mediados pela ação do álcool sistema nervoso central (SNC). Devido a sua estrutura lipossolúvel o álcool consegue se difundir entre as membranas celulares, podendo interagir com proteínas e moléculas dos neurônios. Assim, pode comprometer a condução elétrica, impulsos nervosos e a atividade normal celular. Consequentemente, as circuitarias neurais e a liberação de neurotransmissores são modificadas (CEDERBAUM, 2012; GILPIN; KOOB, 2008). A seguir, serão descritas ações importantes do álcool sobre sistemas de neurotransmissão encefálicos.
1.2.2. Interações com sistemas de neurotransmissão Sistema GABAérgico
O sistema GABAérgico, é o principal sistema com funções inibitórias no SNC. Atuando como agonista, a molécula do álcool interage com receptores para ácido gama-aminobutírico (GABA) do tipo A (GABAA), presentes na membrana de neurônios de
diferentes áreas encefálicas. Os receptores GABAA são canais iônicos permeáveis cloreto,
íon carregado negativamente. O álcool promove uma potencialização GABA sobre estes receptores, aumentando o fluxo de íons para células, consequentemente há hiperpolarização, redução da atividade neuronal e um efeito depressor em várias áreas do SNC. Assim, o indivíduo pode apresentar sintomas de sedação e fala arrastada, alívio da ansiedade, falta de coordenação motora e movimentos lentos (MCINTOSH; CHICK, 2004; SAXENA; RAJ PAL; AMBEKAR, 2003; KORPI, 1994; MIHIC; HARRIS, 1997).
A literatura relata que o consumo contínuo de álcool gera uma resposta adaptativa no sistema GABAérgico. Por exemplo, em estudo com roedores expostos ao álcool concentrado em 6% durante 14 dias (quantidade de álcool ingerida por dia: 10-12 g/kg; concentração sanguínea de álcool 150-200 mg/100 ml), os pesquisadores observaram que os níveis da subunidade α1 e α4 do receptor GABAA estavam alterados no córtex
(DEVAUD et al., 2002). Estas alterações dificultam a montagem de receptores GABAA
funcionais, o que contribui para um mau funcionamento do sistema GABAérgico e de sua ação inibitória em outros sistemas (MIHIC; HARRIS, 1997).
Na retirada abrupta do álcool, há um aumento da excitabilidade no SNC, devido a baixa atividade regulatória GABAérgica, promovendo a manifestação de sintomas de ansiedade, convulsão e hiperatividade, entre outros (MIHIC; HARRIS, 1997; FAINGOLD; LI; EVANS, 2000; BROUSSE et al., 2012).
Sistema glutamatérgico
Já o sistema glutamatérgico, é o principal sistema com funções excitatórias no SNC. O álcool pode interagir com receptores para o glutamato, como por exemplo com o receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), bloqueando sua atividade e alterando a sinalização excitatória no SNC (WOODWARD, 1994). Receptores glutamatérgicos NMDA estão presentes em grande parte dos neurônios do SNC e são canais iônicos permeáveis a moléculas carregadas positivamente, como Na+ e Ca2+. Quando ativados,
permitem o influxo de íons para célula, contribuindo para despolarização celular e geração de impulsos nervosos. Desta maneira, influencia na liberação de neurotransmissores e no funcionamento celular (GONZALES; JAWORSKI, 1997).
Também é relatado na literatura, neuroadaptações do sistema glutamatérgico devido ao consumo a longo prazo do álcool. Por exemplo, os pesquisadores Hendricson e colaboradores (2007) observaram que o consumo de álcool (75mM) por 5-9 dias, provocou um aumento na expressão e no número de subunidades de receptores NMDA, e ainda, observaram aumentada atividade excitatória glutamatérgica após o álcool ser retirado (HENDRICSON et al., 2007).
Quando consumo de álcool é cessado os receptores NMDA são desinibidos. Devido ao aumento do número dos mesmos previamente durante o uso prolongado do álcool, há uma atividade glutamatérgica acentuada. Consequentemente, pode haver danos e morte celular, predispondo o indivíduo a doenças neurológicas e a transtornos mentais. O aumento da excitabilidade do SNC é acompanhado de sintomas, como tremores, hiperatividade e convulsões (GONZALES; JAWORSKI, 1997; TSAI; GASTFRIEND; COYLE, 1995).
Sistema dopaminérgico
O sistema dopaminérgico, tem como neurotransmissor a dopamina. É relacionado com diferentes funções como sensação de recompensa, prazer, modulação da atenção e da memória de curto prazo. O álcool estimula neurônios dopaminérgicos da área tegmentar ventral, favorecendo a liberação de dopamina em áreas encefálicas inervadas por estes neurônios, como no núcleo accumbens. Este núcleo é visto como importante para geração de respostas de recompensa e emoções gratificantes (ARIAS-CARRIÓN et al., 2010; BOILEAU et al., 2003; DI CHIARA, 1997; KAPICZINSK; QUEVEDO; IZQUIERDO, 2004).
Durante o uso prolongado de álcool, há uma diminuição dos níveis de dopamina e seus metabólitos em áreas associadas com a modulação do estado emocional, movimentos e processos cognitivos, incluindo porção ventral do estriado (onde se localiza o núcleo accumbens) e na sua porção dorsal (ROTHBLAT; RUBIN; SCHNEIDER, 2001). Em estudos com lesões núcleo accumbens e alteração do sistema dopaminérgico, os pesquisadores observaram um aumento significativo da ingestão de álcool (QUARFORDT; KALMUS; MYERS, 1991).
Na retirada alcoólica, é relatado que há depleção dos níveis de dopamina, principalmente no núcleo accumbens. Assim, a diminuição de dopamina e funcionamento anormal das vias dopaminérgicas favorece a procura do indivíduo por mais álcool, em busca de emoções gratificantes contribuindo para o desenvolvimento da dependência alcoolica (DI CHIARA, 1997; KAPICZINSK; QUEVEDO; IZQUIERDO, 2004; NOBLE, 1996).
Sistema de estresse encefálico
Os sistemas de estresse encefálico, são circuitarias neuronais ativadas durante a exposição a estímulos aversivos. São considerados existentes dois sistemas estresse: a) o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), b) um sistema extra-hipotalâmico que inclui regiões do neocórtex, amígdala estendida (composta pelo núcleo central da amígdala, bed nucleus da estria terminal, núcleo accumbens shell), tálamo e núcleos mesencefálicos. Em ambos, o fator liberador de corticotrofina (CRF) é um importante modulador que ativa as circuitarias, promovendo respostas comportamentais relacionadas ao estresse, típicas de cada espécie (HEIMER; ALHEID, 1991; KOOB et al., 2014; SWANSON et al., 1983).
Em estudos com modelos animais é possível observar respostas comportamentais, como congelamento (ou freezing), sobressalto, evitação de áreas abertas ou de altura, quando os mesmos são expostos a estímulos aversivos ou a um estressor. Comportamentos são semelhantes a respostas comportamentais de humanos e tem sido sugeridos como indicativos de ansiedade (KOOB et al., 2014).
Foi visto que os sistemas de estresse encefálico se encontram desregulados na retirada de álcool após consumo prolongado. É relatado um aumentado nível de CRF ativando as circuitarias destes sistemas e mediando respostas estressoras e ansiogênicas (MERLO PICH et al., 1995; RIVIER; BRUHN; VALE, 1984).
No eixo HPA, estímulos estressantes ativam células parvocelulares no núcleo paraventricular do hipotálamo que liberam o CRF. Este, por sua vez, estimula a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) da hipófise anterior. O ACTH induz a síntese e a liberação de glicorticoides pela glândula adrenal (BACKSTRÖM; WINBERG, 2013; RAADSHEER et al., 1993). Os glicocorticoides exercem um efeito de feedback negativo sobre o eixo, atuando em receptores presentes no núcleo paraventricular e hipocampo, principalmente (KOOB, 2009).
Acredita-se que os mecanismos envolvidos no reforço negativo do álcool envolve o sistema extra-hipotalâmico CRF da amígdala estendida (ZAHR; SULLIVAN, 2008). Esta região, quando ativada, libera CRF em áreas como núcleo paraventricular hipotalâmico e tronco encefálico, ativando estas regiões e promovendo respostas comportamentais e autonômicas (Figura 1) (PURVES, 2010). Além disso, as regiões envolvidas na modulação do estresse estão interligadas a estruturas límbicas importantes para respostas emocionais (PURVES, 2010; KOOB; KREEK, 2007).
Figura 1. Respostas comportamentais e autonômicas mediadas pelo CRF extra-hipotalâmico da amígdala estendida. Abreviações: BNST: bed nucleus da estria terminal; PVN: núcleo paraventricular hipotalâmico; AMYG: amígdala; CRF: fator liberador de corticotrofina e NE: noradrenalina (ZAHR; SULLIVAN, 2008).
Sistema serotoninérgico
O sistema serotonérgico possui um papel importante na modulação da emoção, assim como de outras funções encefálicas, como no ciclo do sono, apetite, locomoção, regulação hormonal e fator trófico, funções cognitivas como atenção, controle da impulsividade, comportamento social, aprendizado, memória, entre outras funções (BELMER et al., 2016; KETCHERSIDE; MATTHEWS; FRANCESCA, 2013).
Na ingestão aguda de álcool há evidências de que os níveis de serotonina (5-HT, 5-hidroxitriptamina) e de seus metabólitos, como ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA), aumentam (HELANDER; ERIKSSON, 2002; BADAWY, 1998; LOVINGER, 1997). O álcool agudo eleva níveis de 5-HT em várias regiões encefálicas, incluindo o hipocampo ventral (BARE; MCKINZIE; MCBRIDE, 1998), amígdala (MCBRIDE, 2002), córtex pré-frontal medial (LANGEN; DIETZE; FINK, 2002), núcleo accumbens (YOSHIMOTO et al., 1992), área tegmentar ventral (YAN et al., 1996), entre outras. Na área tegmentar ventral a 5-HT pode potencializar a ação do álcool sobre neurônios dopaminérgicos, favorecendo os efeitos recompensadores do álcool (BRODIE; TRIFUNOVIĆ; SHEFNER, 1995). Contudo, estudos eletrofisiológicos demonstraram que a administração intravenosa aguda de álcool em ratos diminuiu a atividade de neurônios serotonérgicos no núcleo dorsal da rafe (PISTIS et al., 1997; THIELEN; MORZORATI; MCBRIDE, 2001).
Estudos avaliando os efeitos do álcool crônico sobre o sistema serotonérgico encontraram uma redução de 5-HT e 5-HIAA em várias áreas encefálicas, como cortéx frontal, corpo estriado, área tegmentar ventral e pálido ventral (UZBAY; USANMAZ; AKARSU, 2000; VASCONCELOS et al., 2004; WOODS; DRUSE, 2002). Também foi visto uma redução de 5-HIAA no líquido cefalorraquidiano de pacientes com dependência alcoólica (BANKI, 1981), indicando uma diminuição da atividade serotonérgica no sistema nervoso central.
Na retirada do álcool, foi observado em estudo com indivíduos dependentes hospitalizados, níveis de 5-HIAA plasmático significativamente reduzidos no período de 28-63 dias após a última bebida alcoolica (BALLENGER et al., 1979). Ainda outro estudo mostrou diminuídos níveis plasmáticos de 5-HT em homens dependentes hospitalizados para desintoxificação já no primeiro dia abstinência à bebida (PATKAR A. et al., 2003). A disfunção do sistema serotonérgico provocada pelo álcool tem sido associada ao desenvolvimento de desordens emocionais, como ansiedade, desejo exagerado pela droga, favorecendo recaídas e o comportamento de beber (CICCOCIOPPO, 1999).
1.3. A serotonina
1.3.1. Neuroanatomia do sistema serotonérgico
A 5-HT, molécula neurotransmissora do sistema, é uma amina biogênica produzida a partir do aminoácido triptofano, adquirido na dieta (ATTENBURROW et al., 2003). No sistema nervoso, é sintetizada principalmente em neurônios localizados nos núcleos da rafe (MOHAMMAD-ZADEH; MOSES; GWALTNEY-BRANT, 2008). Estes núcleos serotonérgicos encontram-se distribuídos na linha média ao longo da extensão rostrocaudal do tronco encefálico (VERTES; CRANE, 1997). Os núcleos mais rostrais enviam projeções para o prosencéfalo, enquanto os caudais para tronco encefálico caudal e medula espinal (HORNUNG, 2003). Dahlstrom e Fuxe (1964), descreveram nove grupos celulares contendo serotonina no núcleo da rafe (B1-B9) (apud PIERUCCI et al., 2014). Os grupos caudais, situados na medula, são o núcleo magno da rafe (NMR, grupo B5), núcleo obscuro da rafe (NOR, grupos B1, B2 e B3) e núcleo pálido da rafe (NPR, grupo B4). O grupo rostral, localizados na ponte e mesencéfalo, são o núcleo dorsal da rafe (NDR, grupos B6 e B7), e o núcleo mediano da rafe (MRN, grupo B8). O B9 está localizado no tegmento ventrolateral da ponte e mesencéfalo (Figura 2) (PIERUCCI et al., 2014).
Figura 2. Visão sagital mediana do tronco encefálico de rato com grupos celulares serotonérgicos e algumas de suas projeções ascendentes e descendentes (modificado PIERUCCI et al., 2014; “Raphe Nuclei”, 2009).
Para a síntese de 5-HT, o triptofano é hidroxilado pela triptofano-5-hidroxilase do tipo 2 (TPH-2; presente em neurônios) em 5-hidroxitriptofano (5-HTP). O 5-HTP é descarboxilado pela enzima aminoácido descarboxilase formando 5-HT (CLARK; WEISSBACH; UDENFRIEND, 1954; PATEL; PONTRELLO; BURKE, 2004). Estas enzimas estão distribuídas por todo citoplasma dos neurônios serotonérgicos. Após a síntese, a 5-HT é transportada para vesículas por meio do transportador vesicular de monoaminas e armazenada no interior destas. As vesículas são encontradas em toda extensão do neurônio, ou seja, nos axônios, corpos celulares e dendritos (GOLAN et al., 2014). Quando ocorre o impulso nervoso e influxo de cálcio, as vesículas com 5-HT no terminal do axônio se fundem com a membrana celular, liberando as moléculas na sinapse.
Além da liberação sináptica nos terminais nervosos, há liberação de 5-HT fora da sinapse no corpo do neurônio (COLGAN; PUTZIER; LEVITAN, 2009), nos dendritos (COLGAN et al., 2012) e ao longo axônio, nas varicosidades axonais (BRUNS et al., 2000). Tem sido relatado que a 5-HT liberada fora da sinapses é independente de potencial de ação; como exemplo, nos dendritos é induzida por canais de cálcio do tipo-L, os quais podem ser ativados por receptores glutamatérgicos NMDA (BELMER; MAROTEAUX, 2018).
A 5-HT livre pode interagir com receptores específicos nas células pós-sináptica e pré-sináptica. Estes, são classificados em sete famílias com base em suas sequências de aminoácidos e propriedades estruturais: 5-HT1A/B/D/E/F, 5-HT2A/B/C, 5-HT3, 5-HT4,
5-HT5A/B, 5-HT6, 5-HT7 – treze são receptores transmembrana acoplados a proteína G e um
receptor é um canal iônico dependente de ligante (5-HT3) (Figura 3) (BARNES et al.,
2018). Conforme o tipo de sinalização, estes receptores podem ser divididos em quatro grupos:
I. Receptores 5-HT1A/B/D/E/F e 5-HT5A/B: acoplados a Gαi; a ativação induz
inibição da adenilciclase e diminuição do mensageiro adenosina 3,5-monofosfato cíclico (AMPc), podendo induzir hiperpolarização celular. II. Receptores 5-HT4, 5-HT6 e 5-HT7: acoplados a Gαs; a ativação estimula
adenilciclase e a produção de AMPc. AMPc tem numerosos alvos, como canais iônicos e proteína cinase A, podendo participar da regulação do fluxo de cálcio, excitabilidade celular, entre outros processos.
III. Receptores 5-HT2A/B/C: acoplados a proteína Gαq; induzem a hidrólise de
fosfoinositídeos da membrana, formando diacilglicerol e fosfato inositol, responsáveis por ativar a proteína cinase C e elevar o cálcio intracelular. IV. Receptores 5-HT3: canais iônicos dependentes de ligante, permeáveis a
Na+/K+, encontrados nas membranas pré- e pós-sináptica. Sua ativação contribui para despolarização celular (NICHOLS; NICHOLS, 2008).
O transportador para serotonina (5-HTT), localizado na membrana do neurônio pré-sináptico, remove 5-HT da sinapse (MOHAMMAD-ZADEH; MOSES; GWALTNEY-BRANT, 2008). Novamente dentro do neurônio, 5-HT pode ser reciclada em vesículas sinápticas ou metabolizada no citosol pela enzima monoaminoxidase (MAO), formando ácido 5-HIAA, metabólito excretado principalmente pela via urinária (Figura 3) (MCISAAC; PAGE, 1959).
Figura 3. Síntese de 5-HT em neurônios e suas interações com receptores específicos (NICHOLS; NICHOLS, 2008).
Dentre as áreas encefálicas envolvidas na produção de 5-HT, o núcleo dorsal da rafe (B6/B7), envia densa inervação serotonérgica para o prosencéfalo e para regiões importantes de regulação do humor (Quadro 1) (ISHIMURA et al., 1988).
Quadro 1. Apresentação das principais aferências e eferências do núcleo dorsal da rafe. Porção núcleo
dorsal da rafe
Aferências principais Eferências principais
Rostral
(Bregma -6,92 a -7,94)
Córtex cingulado rostral Córtex peduncular dorsal Áreas pré-ópticas medial
e lateral
Áreas hipotalâmicas posteriores
Habênula lateral (PEYRON et al., 1998; WANG; GUAN; SHIODA, 2001)
Caudado putâmen Amígdala
Substância negra
(IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986)
Medial
(Bregma -7,73 a -8,45)
Córtex cingulado rostral Córtex infralímbico Córtex peduncular dorsal Núcleo central da
amígdala
Bed nucleus da estria terminal
Pálido ventral
Áreas pré-ópticas medial e lateral
Núcleos hipotalâmicos Habênula lateral Núcleo paraventricular (PEYRON et al., 1998; WANG; GUAN; SHIODA, 2001) Caudado putâmen Hipocampo Núcleo central da amígdala Substância negra
Área hipotalâmica dorsal Bed nucleus da estria
terminal
Substância cinzenta periaqueductal
Córtex pré-frontal medial Núcleo basolateral da amígdala Núcleo accumbens (COMMONS; CONNOLLEY; VALENTINO, 2003; IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986; STEZHKA; LOVICK, 1997; HALE
et al., 2008; VAN BOCKSTAELE; BISWAS; PICKEL, 1993) Caudal (Bregma -8,52 a -9,24) Córtex pré-frontal medial Habênula lateral Núcleo interpeduncular Área pré-óptica lateral Área hipotalâmica perifornical, tegmental laterodorsal, núcleo arqueado Substância negra Núcleo prepósito Núcleo do hipoglosso Área postrema (LEE et al., 2003) Revestimento ependimal dos ventrículos Locus coeruleus Hipocampo ventral Amígdala Núcleos talâmicos (KROUT; BELZER; LOEWY, 2002; MIKKELSEN; HAY-SCHMIDT; LARSEN, 1997; SIMPSON et al., 1998; IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986)
Foi observado que o núcleo dorsal da rafe exibe uma organização topográfica conforme suas entradas e saídas de fibras axonais, suas funções e parâmetros citoarquitetônicos (REN et al., 2018; LOWRY et al., 2008a). Com base nestas características, Lowry e colaboradores (2008) propuseram a subdivisão do núcleo dorsal da rafe nas seguintes partes: dorsal (DRD), ventrolateral (DRVL), ventral (DRV), interfascicular (DRI) e caudal (DRC) (Figura 4 e 5), cujas funções na regulação de respostas comportamentais e emocionais seriam distintas (LOWRY et al., 2008a).
Figura 4. Ilustração de uma secção mediana sagital do tronco encefálico de rato, apresentando a distribuição de neurônios serotonérgicos no mesencéfalo, ponte e medula. Cada ponto representa um neurônio imunomarcado para triptofano-hidroxilase. Abreviações: Aq, aqueduto cerebral; DRC, parte caudal do núcleo dorsal da rafe; DRD, parte dorsal do núcleo da rafe; DRV, parte ventral do núcleo dorsal da rafe; IPA, núcleo interpeduncular; mlf, fascículo medial longitudinal; RMg, núcleo da rafe; ROb, núcleo obscuro da rafe; RPa, núcleo pálido da rafe; xscp, decussação do pendúnculo cerelebar superior. A escala ilustra a posição ântero-posterior tendo como referência o Bregma (mm). Barra de escala 1mm (LOWRY et al., 2008a).
Figura 5. Ilustração de secções coronais do tronco encefálico de rato, apresentando os principais grupos celulares da rafe, o DR com suas subdivisões e o MRN. Abreviações: Aq, aqueduto cerebral; DRC, parte caudal do núcleo dorsal da rafe; DRD, parte dorsal do núcleo da rafe; DRV, parte ventral do núcleo dorsal da rafe; DRVL, parte ventrolateral do núcleo dorsal da rafe; MRN, mediano da rafe. A imagem superior representa a secção localizada no bregma -8.04, e a imagem inferior, bregma -8.64 conforme o Atlas Paxinos e Watson (modificado PAXINOS; WATSON, 2007).
1.3.2. Influência do sistema serotonérgico das porções dorsal e caudal do núcleo dorsal da rafe na modulação de comportamentos emocionais
Estudos mostraram que as porções dorsal (DRD) e caudal (DRC) do núcleo dorsal da rafe, são seletivamente ativadas por um número de estímulos estressantes e relacionados a ansiedade, participando da modulação de comportamentos emocionais (LOWRY et al., 2008b; HALE; LOWRY, 2011). Por exemplo, estudos avaliando o DRD, observaram que drogas ansiogênicas, tais como cafeína, antagonista do receptor de adenosina; m-clorofenil piperazina, agonista do receptor 5-HT2A/2C; e o N-metil-beta-carbolina-3-carboxamida (FG-7142), agonista inverso parcial benzodiazepínico podem ativar os neurônios nesta região (ABRAMS et al., 2005). Além disso, o neurotransmissor urocortina 2 (neurotransmissor da família do CRF), o CRF e estímulos ansiogênicos e estressantes, podem ativar as duas regiões, DRD e DRC (EVANS; HEERKENS; LOWRY, 2009; GARDNER et al., 2005; HALE et al., 2010; HAMMACK et al., 2002; STAUB; SPIGA; LOWRY, 2005).
Pesquisadores viram que quando se ativava neurônios a partir do DRD com projeções para o núcleo central da amígdala, a liberação e aumento de 5-HT na região favorecia um comportamento do tipo ansioso nos animais. Quando se depletava a enzima triptofano hidroxilase 2 destes neurônios, reduzia-se o comportamento ansiogênico (REN et al., 2018).
Algumas características importantes destas regiões: O DRD no encéfalo de ratos se estende aproximadamente do bregma -7.32 a -8.40 no Atlas proposto por Paxinos e Watson (PAXINOS; WATSON, 2007). É limitado dorsalmente pelo aqueduto mesencefálico, ventralmente pelo DRV e lateralmente pelo DRVL. Possui células de tamanho médio fusiformes ou bipolares, orientadas em direção rostrocaudal. Na região mediana ao longo da extensão rostrocaudal do DRD, há um denso grupo central de células chamado DRD core (DRDc) e ao redor há neurônios dispersos, chamados de DRD shell (DRDSh) (LOWRY et al., 2008a; LOWRY et al., 2008b; ABRAMS et al., 2005).
O DRD recebe um grande número de aferências, das partes lateral, ventral e medial do núcleo intersticial da estria terminal. Junto com o DRVL, recebe aferências de fibras descendentes do córtex infralímbico (LOWRY et al., 2008a). Envia eferências para o núcleo central da amígdala, região envolvida em respostas fisiológicas e comportamentais ao medo. Origina também densa inervação na área dorsal hipotalâmica, envolvida em respostas autonômicas, neuroendócrinas e comportamentais induzidas pelo
estresse. Ainda, envia projeções para o núcleo intersticial da estria terminal, envolvido na regulação de comportamentos relacionados a ansiedade. Além disso, envia projeções colaterais para o núcleo accumbens, córtex pré-frontal medial e núcleo basolateral da amígdala (IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986; VAN BOCKSTAELE; BISWAS; PICKEL, 1993).
Já o DRC no encéfalo de rato se estende aproximadamente do bregma 8.40 a -9.24 no Atlas proposto por Paxinos e Watson (PAXINOS; WATSON, 2007). É delimitado dorsalmente pelo aqueduto mesencefálico, lateralmente pelo núcleo tegmentar dorsal e ventralmente pelo DRI. Contém pequenos neurônios serotonérgicos redondos na sua parte rostral e neurônios de tamanho médio (HALE; LOWRY, 2011a).
Aferências direcionadas ao DRC são originadas do córtex pré-frontal medial, habênula lateral, núcleo interpeduncular, área pré-óptica lateral, área hipotalâmica perifornical, núcleo tegmental laterodorsal, núcleo arqueado, substância negra, núcleo prepósito, núcleo do hipoglosso e área postrema (LEE et al., 2003).
Neurônios da parte dorsal do DRC, próximas ao aqueduto, se projetam para o revestimento ependimal dos ventrículos (MIKKELSEN; HAY-SCHMIDT; LARSEN, 1997; SIMPSON et al., 1998). Também, envia projeções para o locus coeruleus, o hipocampo ventral, amígdala (IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986) e para núcleos talâmicos (KROUT; BELZER; LOEWY, 2002).
Dados prévios da literatura, inclusive aqueles obtidos no Laboratório de Psicofarmacologia, do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, mostraram que a retirada do álcool após consumo a longo prazo favorece respostas defensivas relacionadas a ansiedade e a depressão em ratos e ratas (JUNQUEIRA-AYRES et al., 2017; SANTOS, 2014). As evidências mencionadas nos parágrafos anteriores apontam a transmissão serotonérgica do DRD e DRC como candidatas à modulação destas respostas comportamentais observadas na abstinência. Apesar da menor prevalência do abuso de álcool por mulheres, estas são mais diagnosticadas com desordens emocionais, quando comparadas aos homens (“WHO | Gender and women’s mental health”, 2013). Tendo em vista este fator, neste trabalho foram utilizadas lâminas de imunoistoquímica com marcação para serotonina de fêmeas – ratas Wistar –, que passaram por consumo em longo prazo de álcool (21 dias) e retirada alcoolica em curto (72h) e longo prazo (21 dias). As ratas que passaram pelo período de abstinência apresentaram comportamentos ansiogênicos, porém
não apresentaram alterações no número de celular serotonérgica no núcleo dorsal da rafe (dados não publicados SANTOS, 2014). No presente estudo, foi testada a hipótese de que a exposição a longo prazo e da retirada do álcool promove alterações de densidade celular serotonérgica no DRD e no DRC do núcleo dorsal da rafe.
2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral
Verificar se a retirada do álcool após consumo a longo prazo altera a densidade de células serotonérgicas do DRD e no DRC.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar a marcação de serotonina no DRD em ratas Wistar submetidas ao consumo de álcool por 21 dias, à retirada de álcool por 72h e à retirada de álcool por 21 dias.
Avaliar a marcação de serotonina nas porções rostral, média e caudal do DRD em ratas Wistar submetidas ao consumo de álcool por 21 dias, à retirada de álcool por 72h e à retirada de álcool por 21 dias.
Avaliar a marcação de serotonina no DRC em ratas Wistar submetidas ao consumo de álcool por 21 dias, à retirada de álcool por 72h e à retirada de álcool por 21 dias.
3. METOLODOLOGIA 3.1. Animais
Para a realização do estudo foram utilizadas ratas Wistar adultas (90 dias) provenientes do Biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (DBF-UFRN). As mesmas foram alojadas em gaiolas de polietileno, com livre acesso à ração e água ou às soluções de álcool de acordo com grupo experimental. Foram mantidas em ambiente controlado sob o ciclo de luz claro-escuro de 12 horas (06:00 às 18:00) e temperatura 22°C ± 1°C. Os procedimentos experimentais tiveram aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (protocolo n.°: 051/2012). As etapas: protocolo de consumo e retirada de álcool, perfusão transcardíaca, microtomia e imunoistoquímica foram realizadas pela Bióloga Raliny Oliveira Santos.
3.2. Protocolo de consumo e retirada de álcool
Os animais foram divididos em quatro grupos, da seguinte forma: Grupo controle (n=6): consumo de água ad libitum por 21 dias
Grupo consumo em longo prazo (n=6): consumo de álcool por 21 dias Grupo retirada em curto prazo (n=6): consumo de álcool por 21 dias e retirada
alcoolica de 72h
Grupo retirada em longo prazo (n=7): consumo de álcool por 21 dias e retirada alcoolica de 21 dias.
Os animais dos grupos tratados foram submetidos ao álcool como única fonte de dieta líquida em concentrações crescentes (adaptado de TIRAPELLI et al., 2008). O álcool possui um gosto aversivo para os animais, este modo de exposição permite os animais se adaptarem gradualmente a dieta alcoolica. O protocolo de tratamento utilizado será demonstrado no esquema a seguir:
O tratamento crônico com etanol foi iniciado com solução de álcool 2% (1° dia), sendo gradualmente aumentado a cada três dias para 4% (4° dia) e 6% (7° dia em diante, mantendo está concentração até o 21° dia). Após o consumo prolongado, foram realizados seguintes protocolos:
Consumo contínuo de álcool (grupo consumo longo prazo)
Após 21 dias de consumo prolongado, os animais foram em seguida submetidos a perfusão transcardíaca para remoção do encéfalo e posterior análise imunoistoquímica.
Retirada em curto prazo (grupo de retirada curto prazo)
Após 21 dias de consumo prolongado, o álcool foi substituído por água e, com 72 horas de abstinência, os animais foram submetidos a perfusão transcardíaca para remoção do encéfalo e posterior análise imunoistoquímica.
Retirada em longo prazo (grupo de retirada longo prazo)
Após 21 dias de consumo prolongado, o álcool foi substituído por água e, com 21 dias de abstinência, os animais foram
submetidos a perfusão transcardíaca para remoção do encéfalo e posterior análise imunoistoquímica.
O grupo controle recebeu água ad libitum durante todo o experimento.
3.3. Perfusão transcardíaca
Os animais foram anestesiados por meio da administração de Quetamina e Xilazina (80 mg/Kg/mL e 10 mg/Kg/mL i.p., respectivamente) e submetidos à técnica de perfusão transcardíaca. Durante o procedimento o animal foi posicionado em decúbito dorsal sobre uma tela de arame mantida na horizontal dentro de uma capela de exaustão com ponto de água corrente. Depois, com auxílio de materiais cirúrgicos, foi feito um corte na cavidade torácica para dar acesso ao coração. Foi inserida uma agulha (17mm x 1,5mm) no ventrículo esquerdo de modo que ficasse orientada em direção à aorta. A agulha era conectada à uma bomba peristáltica que impulsionou 400 ml de solução NaCl 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 (PB), seguido de 700 ml de paraformaldeído 4% em PB. Imediatamente após a inserção da agulha no ventrículo esquerdo, o átrio direito foi seccionado para que o sangue fosse escoado do corpo do animal. Posteriormente, os encéfalos foram retirados e permaneceram 4h em solução de paraformaldeído 4% e sacarose 30% em PB para a pós-fixação. Depois, os encéfalos foram armazenados em solução de sacarose 30% em PB até a realização do procedimento de microtomia. Para evitar o desenvolvimento de fungos, a solução de sacarose foi trocada diariamente.
3.4. Microtomia
Os encéfalos foram congelados em gelo seco e seccionados em micrótomo de deslizamento manual. Foram feitos cortes coronais com uma espessura de 30 µm, onde foram distribuídos serialmente e sequencialmente em seis compartimentos, de modo que os cortes em cada poço tiveram uma distância de 180 µm. As secções foram armazenadas em solução anticongelante e acondicionadas em um freezer com temperatura de -20 °C até a realização do processo imunoistoquímico.
3.5. Imunoistoquímica para 5-HT
Para a imunoistoquímica, os cortes foram retirados da solução anticongelante e submetidos a um tratamento prévio para inativação de peroxidases endógenas e prevenção da formação de artefatos. Inicialmente, os cortes foram lavados em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 (TF) por 5 minutos, quatro vezes. As lavagens foram realizadas em recipientes posicionados em agitador orbital. Depois, os cortes foram incubados com solução de peróxido de hidrogênio 0,03% em TF durante 20 minutos. Em seguida, foram lavados quatro vezes em TF, com duração de 5 minutos para cada lavagem. Após, os cortes foram incubados em solução contendo o anticorpo primário anti-5-HT obtido em coelho (1:5000) diluído em TF contendo Triton X-100 0,04% e soro normal de cabra (1:50) durante 18h e colocados em um rotor com rotação lenta e eixo de inclinação de 30°. Depois, os cortes foram lavados quatro vezes em TF com duração de 4 min cada lavagem. Em sequência, foram incubados com solução contendo anticorpo secundário diluído anti-coelho, obtido em cabra (1:1000) em tampão fosfato contendo Triton X-100 0,4% por 2h. Após, foram feitas mais quatro lavagens por 5 min cada, em solução tampão. Depois, as secções foram incubadas com complexo avidina-biotina-peroxidase Triton X-100 NaCl por 2h. Posteriormente, realizou-se mais quatro lavagens com TF. Para a visualização da reação, as secções foram submetidas a uma técnica de revelação que ocorria em meio líquido contendo TF e peróxido de hidrogênio 0,003%, tendo como cromógeno a diaminobenzidina. Os cortes foram imersos nesta solução por 10 min. Passado o período, os cortes foram lavados quatro vezes em TF, 5 min a cada lavagem. Finalmente, as soluções foram montadas em lâminas de vidro gelatinizadas. Depois da secagem em temperatura ambiente, a reação de imunoistoquímica foi intensificada em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% seguida de desidratação e diafinização em bateria de álcoois. Com auxílio do meio de montagem ERV-MOUNT as lamínulas foram coladas sobre as lâminas.
3.5.1. Análise das lâminas de imunoistoquímica para 5-HT
A marcação com o anticorpo anti-5-HT permite a visualização de corpos celulares e fibras nervosas que contenham moléculas de serotonina. Com auxílio dos diagramas do atlas estereotáxico de encéfalo de rato (PAXINOS; WATSON, 2007), foram selecionados cortes nas lâminas contendo o DRD (bregma 7,20 a 8,40) e o DRC (bregma 8,52 a
-9,24) para análise. E para mensurar as áreas do DRD e DRC nestes cortes com maior exatidão, foram realizados os seguintes passos:
1. Nos diagramas do atlas Paxinos que continham as áreas de interesse, foram mensuradas a largura e altura do mesencéfalo, a largura e altura das porções do DRD ou DRC (mm). Exemplo:
2. Depois, foram mensurados a largura e altura (mm) do mesencéfalo nos cortes selecionados das lâminas:
3. Para determinar a possível largura e altura do DRD ou DRC nos cortes foram feitos cálculos de proporcionalidade com as medidas obtidas nos passos anteriores da seguinte forma:
Para altura:
4. Após, as lâminas foram colocadas em microscópio óptico acoplado a câmera digital e visualizadas com auxílio do software Neurolucida® no computador. Em aumento de 2,5x e grade (50 μm
), observando o formato da porção de interesse
no Atlas Paxinos e com as medidas obtidas pelo cálculo de proporcionalidade, as áreas foram delimitadas com ferramentas de contorno do software.5. Utilizando aumento de 20x e visualizando a área delimitada, foi feita uma contagem de células imunomarcadas para 5-HT, considerando corpos celulares preenchidos e ajustando o foco fino quando necessário.
6. Com a área das partes de interesse e o número total de células contadas, foi realizado o cálculo da densidade celular: Densidade celular = n° células/área (mm2)
3.6. Análise Estatística
Foram selecionadas as seguintes porções para análise de dados densidade celular: DRD nas porções rostral (bregma -7,44 a -7,68), média (bregma -7,80 a -8,04)
e caudal (bregma -8,16 a -8,28);
DRD englobando todas as porções (bregma -7,44 a -8,28) DRC (bregma -8,64 a -9,00).
Utilizando o software SPSS, os dados foram submetidos ao teste não-paramétrico Kruskal Wallis para comparação da distribuição da densidade de células entre os tratamentos. Quando apropriado, foram realizadas comparações em pares como teste post-hoc. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todos os dados serão apresentados como mediana e intervalo interquartil.
4. RESULTADOS
4.1. Densidade celular serotonérgica no DRD de fêmeas
A figura 6, mostra fotomicrografias de cortes coronais do encéfalo de ratas imunomarcados para 5-HT na posição rostrocaudal do bregma -8,04, aproximadamente. Nos cortes podemos visualizar as porções dorsal, ventrolateral e ventral do núcleo dorsal da rafe das ratas; e corpos celulares serotonérgicos bem delimitados e preenchidos. Além disso, percebemos uma maior intensidade de células imunomarcadas na imagem D, referente aos animais que passaram pela retirada alcoolica em longo prazo.
Figura 6. Fotomicrografias de secções coronais encefálicas do DRD de ratas, na posição rostrocaudal do bregma -8,04, aproximadamente. A) Grupo controle; B) Grupo álcool crônico; C) Grupo retirada curta e D) Grupo retirada crônica. As setas preenchidas, nos quadrados inferiores, apontam os corpos celulares imunorreativos a 5-HT. As capturas das imagens foram realizadas em aumento de 20x e 40x. Barra de escala, 100 µm.
O teste de Kruskal Wallis não mostrou efeito dos tratamentos sobre a densidade celular da porção rostral DRD, intervalo de bregma -7,44 a -7,68 [x2(3)=6,594; p=0,086].
Já na porção média do DRD, no intervalo -7,80 a -8,04, o teste estatístico evidenciou um efeito dos tratamentos [x2(3)=8,113; p=0,044]. O teste post-hoc de comparações em pares demonstrou diferença significativa do grupo retirada em longo prazo ao ser comparado ao grupo controle (p=0,046). Na porção caudal do DRD, no intervalo -8,16 a -8,28, também houve um efeito significativo dos tratamentos sobre a densidade celular [x2(3)=8,501; p=0,037]. Sendo que o teste post-hoc evidenciou uma diferença significativa entre os grupos retirada em longo e em curto prazo ao serem comparados (p=0,044) (Figura 7).
Quando as densidades celulares do DRD de cada grupo tratado foram analisadas englobando todas as porções (-7,44 a -8,28), o teste de Kruskal Wallis não mostrou nenhum efeito significativo dos tratamentos sobre a densidade de células imunomarcadas [x2(3)=6,770; p=0,080] (Figura 8).
Figura 7. Densidade celular de neurônios serotonérgicos na porção rostral (7,44 a 7,68), média (7,80 a -8,04) e caudal (-8,16 a -8,28) do DRD. A) Porção rostral DRD; grupos controle (21 dias água ad libitum, n=5), álcool crônico (21 dias álcool, n=5), retirada curta (21 dias álcool e 72h água, n=5) e retirada longa (21 dias álcool e 21 dias água, n= 6). B) Porção média DRD; grupos controle (n=3), álcool crônico (n=6),
* A
B
retirada curta (n=4) e retirada longa (n=5). C) Porção caudal do DRD; grupos controle (n=3), álcool crônico (n=5), retirada curta (n=5) e retirada longa (n=6). “x” média; “*” p < 0,05 em relação ao grupo controle.
Figura 8. Densidade celular de neurônios serotonérgicos no DRD, intervalo de bregma -7,44 a -8,28. Grupos controle (21 dias água ad libitum, n=5); álcool crônico (21 dias álcool, n=6); retirada curta (21 dias álcool e 72h água, n=5) e retirada longa (21 dias álcool e 21 dias água, n=6).“x” média.
4.2. Densidade celular serotonérgica no DRC de fêmeas
A figura 9, mostra fotomicrografias de cortes coronais do encéfalo de ratas imunomarcados para 5-HT na posição rostrocaudal do bregma -8,64, aproximadamente. Nos cortes podemos visualizar a porção caudal do núcleo dorsal da rafe das ratas; e corpos celulares serotonérgicos bem delimitados e preenchidos. Nas imagens, fica evidente que a subdivisão DRC possui menor número de células serotonérgicas quando comparada a subdivisão DRD. Na fotomicrografia A, referente ao grupo controle, percebemos uma menor quantidade destas células, além de estarem com uma imunomarcação mais fraca, quando comparada visualmente aos outros grupos.
Figura 9. Fotomicrografias de secções coronais encefálicas do DRC de ratas, na posição rostrocaudal do Bregma -8.64, aproximadamente. A) Grupo controle; B) Grupo álcool crônico; C) Grupo retirada aguda e D) Grupo retirada longa. As setas preenchidas, nos quadrados inferiores, apontam corpos celulares imunorreativos a 5-HT. As capturas das imagens foram realizadas em aumento de 20x e 40x. Barra de escala, 100 µm.
No DRC, o teste de Kruskal Wallis mostrou um efeito significativo dos tratamentos sobre a densidade celular [x2(3)=8,557; p=0,036]. O teste post-hoc
evidenciou uma diferença significativa da densidade celular do grupo retirada a longo prazo ao ser comparado ao grupo controle (p=0,037) (Figura 10).
Figura 10. Densidade celular de neurônios serotonérgicos no DRC, intervalo de bregma -8,64 a -9,00. Grupos controle (21 dias água ad libitum, n=3); álcool crônico (21 dias álcool, n=5); retirada curta (21 dias álcool e 72h água, n=4) e retirada longa (21 dias álcool e 21 dias água, n=6).“x” média; “*” p < 0,05 em relação ao grupo controle.
5. DISCUSSÃO
No presente estudo, observou-se a densidade celular serotonérgica nas subdivisões dorsal e caudal do NDR após consumo e retirada de álcool, visto que estas regiões tem um papel importante na modulação das emoções. Transtornos de ansiedade e depressão são observados em pacientes dependentes de álcool, principalmente durante o período de abstinência. Tais emoções os predispõe ao comportamento de beber para o alívio dos sintomas negativos, continuando o ciclo prejudicial da dependência do álcool.
Em roedores, dentre as respostas comportamentais observadas no período de abstinência alcoolica, destacam-se as respostas defensivas relacionadas à ansiedade
(BONASSOLI; MILANI; DE OLIVEIRA, 2011; LOWERY-GIONTA;
MARCINKIEWCZ; KASH, 2015; OVERSTREET et al., 2006; SANTOS, 2014; FLEMING et al., 2019; SIDHU; KREIFELDT; CONTET, 2018; METTEN et al., 2018). Santos (2014) avaliou os efeitos da retirada de 72 horas e de 21 dias após consumo de álcool por 21 dias sobre comportamento de ratas Wistar submetidas ao teste do labirinto em cruz elevado e do campo aberto. A pesquisadora observou um aumento no comportamento do tipo ansioso das fêmeas dos grupos retirada em curto e em longo prazo do álcool submetidas ao labirinto em cruz elevado, pois as mesmas diminuíram o tempo de exploração dos braços abertos do aparato. Ainda, foi visto um efeito do tipo ansiogênico da retirada em longo prazo no teste do campo aberto; as ratas deste grupo diminuíram a exploração da área central do aparato, quando comparadas às fêmeas do grupo controle (SANTOS, 2014).
Junqueira-Ayres e colegas (2017) utilizando ratos Wistar e o mesmo protocolo de exposição e retirada do álcool empregado por Santos (2014) e do presente estudo, observaram um aumento do comportamento do tipo ansioso nos animais que passaram pela retirada alcoolica em curto prazo (72 h), mas não nos animais do grupo retirada em longo prazo (21 dias) (JUNQUEIRA-AYRES et al., 2017). Estes resultados indicam uma diferença dos comportamentos ansiogênicos atribuídas ao gênero. É relatado na literatura que mulheres sofrem mais de transtornos emocionais do tipo ansiosos (MCLEAN et al., 2011); desta forma, pode ser sugerido fêmeas tenham maior sensibilidade e se recuperem mais lentamente dos sintomas ansiosos provocados consumo a longo prazo e retirada do álcool.
Apesar da possibilidade de investigar os efeitos da exposição e da abstinência do álcool sobre o sistema serotonérgico em pacientes e em animais de laboratório, os dados
disponíveis na literatura são conflitantes. Por exemplo, o nível do metabólito da serotonina, o ácido 5-HIAA, no líquido cefalorraquidiano de pacientes dependentes de álcool de início precoce (antes dos 25 anos de idade) abstinentes encontra-se mais baixo do que em dependentes de início tardio (depois dos 25 anos de idade) (FILS-AIME et al., 1996). Estudos avaliando os níveis de 5-HIAA e de triptofano no líquido cefalorraquidiano de pacientes do sexo feminino com dependência de álcool encontraram que apenas o 5-HIAA estava diminuído nestas pacientes, quando comparados à indivíduos controles (BANKI, 1981), sugerindo que o baixo nível de 5-HT e seus metabólitos não seja devido a uma deficiência nutricional ou alteração do transporte destes no líquido cefalorraquidiano (BANKI, 1981).
Outros estudos conduzidos em humanos (post mortem), avaliando a região do NDR, observaram um aumento significativo da enzima triptofano hidroxilase no DRD de indivíduos suicidas deprimidos dependentes de álcool (BONKALE; TURECKI; AUSTIN, 2006). Ainda, em outro estudo post mortem, foi relatado um aumento dos processos neuronais serotonérgicos em toda porção do NDR de indivíduos dependentes de álcool, sugerindo que a síntese do neurotransmissor estaria aumentada (UNDERWOOD; MANN; ARANGO, 2007).
Esta discrepância de resultados é também observada em estudos com animais de laboratório avaliando o efeito do álcool sobre a transmissão serotonérgica: baixos níveis de 5-HT e 5-HIAA foram encontrados no encéfalo de roedores que possuem preferência pelo álcool, quando comparados à animais sem preferência pelo álcool. Nos animais com preferência pelo álcool, os níveis do neurotransmissor e seu metabólito estavam reduzidos no córtex, no hipocampo, no corpo estriado, no tálamo e no hipotálamo (MURPHY et al., 1982).
Outros trabalhos investigaram os efeitos da exposição e da retirada de álcool sobre a transmissão serotonérgica especificamente no NDR de roedores. Yamane e colaboradores (2003), testaram o efeito do tratamento com álcool por 14 dias (concentração de 50%, via subcutânea) sobre a síntese de 5-HT no encéfalo de ratos e sugeriram que não houve aumento da atividade serotonérgica no NDR após este tratamento. Eles observaram, por meio de análise autorradiográfica, um aumento da taxa de síntese de 5-HT em alguns grupos celulares descendentes da rafe, em estruturas nigroestriatais, no hipocampo e no córtex, mas não encontraram mudanças na atividade de síntese nos núcleos dorsal e mediano da rafe no corpo pineal (YAMANE;
