O objetivo deste estudo foi determinar a expressão da TOPIIA em amostras de TMC, estudo este que no conhecimento da autora, nunca foi efetuado.
A recolha de tecido mamário normal permitiu determinar o nível da expressão da TOPIIA, usado posteriormente para comparar a expressão da mesma proteína em tecido mamário tumoral. Dada a ausência de padronização de critérios para análise da expressão de TOPIIA, foi estabelecido um sistema de classificação adaptado de Heestand et al. (2017), que tem em conta o número de células negativas e positivas e o grau de intensidade. Das quatro intensidades utilizadas (negativa, fraca, moderada e forte), foram consideradas positivas as intensidades positivas a moderada e forte. Após a análise de 1000 células, os carcinomas mamários foram considerados positivos, quando a soma do número de células com estas duas intensidades fosse maior que 45% (mediana da soma do número de células positivas).
Dado que no tecido mamário normal predominou a intensidade fraca e a análise estatística mostrou que havia uma diferença significativa na comparação entre as intensidades ditas negativas e positivas, tal suporta a classificação escolhida para determinar a sobreexpressão da TOPIIA. Apesar de no tecido mamário normal, o número de células positivas não ser maior que 30%, optou-se por utilizar a mediana do número de células positivas, como valor de cut-off, critério também usado em vários estudos efectuados na mulher. O facto de não existirem estudos para avaliar a expressão da TOPIIA em TMC, levantou alguma dificuldade na interpretação e na comparação dos resultados obtidos. O tecido mamário normal obtido foi recolhido a partir de glândulas mamárias onde não se encontravam tumores mamários. Contudo fica a dúvida, de até que ponto este tecido mamário estava realmente normal e se a expressão da TOPIIA não poderia estar alterada. Outros fatores são também conhecidos por influenciarem o desenvolvimento da glândula mamária, como o animal ser esterilizado ou não, a fase do ciclo éstrico em que se encontra, ou se o tumor apresenta expressão hormonal ou não.
Considerando um cut-off de 45% para a expressão da TOPIIA, 53,57% dos carcinomas mamários avaliados foram classificados como TOPIIA-positivos. Num estudo clínico de Nikolényi et al. (2011), a mediana obtida do número de células marcadas positivamente para a TOPIIA foi cerca de 50%, o que é um valor próximo do valor obtido neste estudo (mediana=45%). Também Mukherjee et al. (2010) considerou como valor de cut-off de positividade para a expressão de TOPIIA, a mediana do número de células marcadas positivamente (45%), valor este igual ao do presente estudo e que suporta a escolha da mediana como indicador de sobreexpressão. O aumento da expressão da TOPIIA em tecido
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tumoral quando comparado ao tecido mamário normal, está de acordo com o esperado inicialmente, pois a TOPIIA está mais expressa em células replicantes, especialmente nas fases S, G2 e M. Sandri et al. (1996) refere que a expressão da TOPIIA é dependente do estado de proliferação celular, pelo que algumas das amostras apresentaram níveis de expressão de TOPIIA, 20 vezes superior à mediana. Tal como Sandri et al. (1996), verificou- se que a expressão de TOPIIA varia muito entre amostras de TMC.
Idealmente a amostra de TMC deveria ser maior, para obter resultados estatisticamente mais fiáveis, contudo a obtenção de amostras é limitada pelo número de animais sujeitos à cirurgia e à distribuição dos tipos histológicos dos tumores extirpados.
Uma das dificuldades enfrentadas neste trabalho, foi a optimização da técnica IHQ. Concluiu- se que a diluição ideal seria 1:7000, que é extremamente menor que a diluição inicial. Com esta diluição foi possível obter uma marcação de várias intensidades, contudo sem eliminar toda a coloração de fundo. Dado o anticorpo em questão, o Ki-S1, ser utilizado para a deteção da TOPIIA humana, pode-se colocar a questão de poder estar a identificar outra proteína existente nas células tumorais de TMC. É ainda essencial otimizar e padronizar a técnica de IHQ, não só quanto à diluição, como também o tempo de incubação, método de recuperação antigénica e solução utilizada para tal.
Na mulher sabe-se que os genes HER-2 e TOPIIA localizam-se no mesmo replicão do cromossoma 17 (q12-q21), o que para alguns autores, pode justificar a amplificação simultânea destes genes, levando à correlação entre a sobreexpressão do HER-2 e a sobreexpressão da TOPIIA (Jarvinen et al., 2000). Na mulher, foi demonstrado que tumores HER-2 positivos apresentavam níveis mais elevados de TOPIIA que os tumores HER-2 negativos, sugerindo que a sobreexpressão de HER-2 possa também ser um marcador indireto da sensibilidade às antraciclinas (Jarvinen et al. 1996; Harris, Yang, Tang & Lupu, 1998). Também Biesaga et al. (2011) mostrou que a sobreexpressão de TOPIIA estava relacionada com tumores HER-2 positivos. Wang et al. (2012) concluiu que tumores que apresentavam sobreexpressão de HER-2 tinham uma diferença estatística na eficácia do tratamento quimioterapêutico com antraciclinas, e que essa eficácia era ainda maior se apresentassem também amplificação do gene TOPIIA. Por outro lado, Fritz et al. (2005), indica que pacientes com tumores HER-2 positivos não beneficiam do uso de antraciclinas, pois este tratamento não seria capaz de reverter o mau prognóstico de tumores HER-2 positivos, sendo portanto os pacientes com pior prognóstico, enquanto que pacientes com tumores negativos tanto para HER-2 como para TOPIIA eram os que apresentavam melhor prognóstico.
Na cadela os genes HER-2 e TOPIIA já não se encontram no mesmo cromossoma. O gene HER-2 encontra-se no cromossoma 1 (Escobar et al., 2001; Ferreira et al., 2014) enquanto
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que o gene TOPIIA está presente no cromossoma 9 (NCBI Gene). Dado não existirem estudos sobre a expressão da TOPIIA em cadelas, não é possível comparar os resultados obtidos nesta espécie, mas apenas com os estudos existentes na mulher e na gata. Segundo o NCBI Gene, os genes HER-2 e TOPIIA na gata encontram-se no cromossoma E1, ou seja, tal como na mulher, estão localizados no mesmo cromossoma. Soares, Correia, Peleteiro e Ferreira (2016) num estudo em carcinomas mamários felinos, concluíram que animais com tumores HER-2 positivos, assim como os do sub-tipo triplo-negativo apresentaram menor TS, o que é concordante com o mesmo prognóstico em mulher. Apenas um estudo tentou relacionar a expressão de HER-2 (por IHQ) com a amplificação do gene HER-2 e TOPIIA em gatos (por FISH) (Soares et al., 2013). Apesar de 33,3% dos carcinomas mamários felinos apresentarem sobreexpressão para o HER-2, valor semelhante na mulher (Peña et al., 2014), o estudo dos genes do HER-2 e TOPIIA, não comprovou uma amplificação dos mesmos, o que poderá indicar que o mecanismo responsável pela expressão do HER-2 possa ser diferente do descrito na mulher (Soares et al., 2013).
Na mulher, a sobreexpressão de HER-2 é encontrada em cerca de 30% dos carcinomas mamários e está associado à amplicação do respetivo gene, em 85 a 90% dos casos (Peña et al., 2014). Na cadela, a importância da sobreexpressão de HER-2 não está bem definida, pois embora existam cada vez mais estudos, há também uma grande variabilidade nos resultados. Como os genes que dão origem às proteínas HER-2 e TOPIIA estão localizados em diferentes cromossomas na cadela, seria de esperar que a sua sobreexpressão não estivesse correlacionada, como de facto foi obtido. Seria também importante realizar a amplificação dos genes HER-2 e TOPIIA em TMC, para verificar se existe uma co-amplificação como acontece frequentemente na mulher, ou não, o que poderia indicar que na mulher esta co- amplificação é de facto por estarem no mesmo cromossoma.
É importante referir também que tumores HER-2 positivos na cadela e na mulher não têm o mesmo prognóstico. Na mulher estes são dos tumores com pior prognóstico, juntamente com os triplo-negativos, enquanto que na cadela, Ressel et al. (2013) concluiram que a sobreexpressão de HER-2 não identifica tumores com pior prognóstico, e até que a sobreexpressão de HER-2 estava presente em tecido mamário não neoplásico. Outro facto que poderia explicar a não associação da expressão da TOPIIA com o HER-2, é a tendência de associação da sobreexpressão de HER-2 com um menor índice proliferativo de Ki-67 (Pedrosa, 2016). Logo, estando a expressão da TOPIIA correlacionada positivamente com o Ki-67, não poderia estar também com o HER-2. Deste modo, também não foi encontrada uma correlação entre o estatuto de HER-2 e do Ki-67 (dos 12 tumores positivos para HER-2, 6 eram Ki-67 positivos).
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O cut-off utilizado para classificar os tumores como positivos para Ki-67 foi de 10%, no entanto, outros valores têm sido considerados válidos. Se se considerar 15% (mediana do valor de Ki-67, como sugerido por Gama et al. (2008b), então 52% dos tumores analisados (26/50) foram considerados positivos para o Ki-67, enquanto que com um cut-off de 20% (Romero et al., 2011; Bravaccini, Rocca & Bronte, 2018), apenas 32% (16/50) foram positivos para o Ki-67.
São vários os autores (Sandri et al., 1996; Biesaga et al., 2011; Nikolényi et al, 2011) que observaram uma correlação positiva entre o número de células com marcação positiva para Ki-67 e o número de células positivas para TOPIIA na mulher. Na gata, Soares et al. (2016) concluiu que gatos com carcinomas mamários com sobreexpressão de Ki-67 (>14%), apresentavam pior prognóstico, associado a um menor TS, e Peña et al. (1998) num estudo em TMC também associou maior index de Ki-67, a menor tempo de vida. Quanto ao utilizar o Ki-67 como marcador preditivo na eficácia do uso de antracicilinas, Bravaccini et al. (2018) mostrou que tratamento contendo antraciclinas eram mais eficazes que o tratamento CMF, em pacientes humanos com um maior index de Ki-67 (>20%). Os resultados obtidos neste estudo estão de acordo com a literatura existente, pois o Ki-67 sendo um conhecido marcador de proliferação celular, e num tecido mamário tumoral com o aumento de células em proliferação, o aumento de expressão da TOPIIA seria expectável. Apesar do coeficiente de correlação obtido ser baixo (r=0,28), pode-se afirmar que há uma correlação positiva entre estes dois parâmetros.
Quanto à dimensão do tumor, os resultados obtidos indicam que tumores de maior dimensão não apresentam necessariamente maior expressão da TOPIIA. Isto pode justificar-se pela diversidade dos tipos histológicos de carcinomas detetados, em que tumores de maior diâmetro podem apresentar cavidades quísticas, não contribuindo para o seu grau de malignidade histológica. Ao analisar a distribuição dos tumores por classes, 82,14% tinha entre 0 a 3cm de eixo maior. De facto, os tumores mamários na cadela, são normalmente de maior dimensão e menos agressivos, quando comparados com tumores mamários na gata. Sandri et al. (1996), num estudo com número igual de carcinomas mamários, não encontrou relação entre a expressão da TOPIIA e o tamanho do tumor, apesar de ser reconhecido como uma variável a ter em conta. Hellemanns et al. (1995), por outro lado, encontrou uma correlação positiva entre a expressão da TOPIIA e o tamanho do tumor e o seu grau de malignidade.
Ao analisar a expressão da TOPIIA e o grau de malignidade de cada carcinoma, não foi demonstrada correlação positiva, mesmo ao agrupar os graus de malignidade em grau I+II versus grau III, como recomendado por alguns autores (Karayannopoulou et al., 2015; Santos
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et al., 2015). Tal pode ser justificado pela distribuição dos TMC pelos graus de malignidade, em que 50% (28/56) eram de grau II, e uma distribuição igual de 25% entre o grau I e grau II. Porém, Biesaga et al. (2011) no seu estudo encontraram correlação entre a sobreexpressão de TOPIIA e o grau de malignidade do tumor (P=0,000).
Pela análise da curva de sobrevivência, observou-se que a maioria dos animais que faleceram, apresentavam tumores TOPIIA-positivos (7 mortes em 15 animais), ao contrário dos animais com tumores TOPIIA-negativos (1 em 13). Este facto é reflectido no resultado da análise estatística, que comprovou a existência de uma associação entre a sobreexpressão da TOPIIA e um menor TS (p=0,0264), com um TS médio de 47 meses (3 anos e 11 meses). Este resultado é concordante com outros estudos que também associam uma maior expressão de TOPIIA, a um menor TS na mulher. Di Leo et al. (2001) refere um prognóstico menos favorável associado a altos níveis de expressão de TOPIIA, mas que este facto poderia ser contrabalançado pelo uso de antraciclinas na quimioterapia; Fritz et al. (2005) também mostrou que pacientes com sobreexpressão de TOPIIA, tinham uma taxa de sobrevivência menor, em que apenas 54,4% dos pacientes tinham 5 anos de sobrevivência; Biesaga et al. (2011) concluiu também que o maior TS pertencia aos pacientes com tumores HER-2 negativos e com baixos níveis de expressão de TOPIIA (94% dos pacientes tinham o maior tempo livre de doença). Pode-se assim considerar que o nível de expressão da TOPIIA pode ser válido como fator de prognóstico nas cadelas com tumores mamários, dado que animais com tumores TOPIIA-positivos parecem ter um menor tempo de sobrevivência.