Os mecanismos envolvidos na patogenia da tuberculose ainda não são totalmente conhecidos. Ao longo das últimas décadas, vários pesquisadores têm procurado compreender os fatores determinantes da infecção, adoecimento e cura da doença, investigando, desde aspectos moleculares do bacilo até os mecanismos de resposta imune inata e adquirida, os quais possam estar relacionados à patogênese das lesões (ROOK; ZUMLA, 2001). Embora muitos dos elementos envolvidos na tuberculose já tenham sido descritos, estudos adicionais investigando, mais profundamente, as respostas do hospedeiro frente ao M. tuberculosis e os mecanismos responsáveis pelo controle da doença, se fazem necessários. Tal conhecimento, uma vez adquirido, pode ser útil no desenvolvimento de vacinas com melhor imunogenicidade, como também na implementação de terapias adjuvantes no tratamento da tuberculose.
Sabe-se que a resposta imune celular, particularmente aquela mediada por linfócitos T, tem um papel central no controle da replicação do M. tuberculosis (ORME et al., 1993; COOPER et al., 1993; KAUFMANN, 2001). A caracterização das células envolvidas nessa resposta e dos seus mecanismos efetores é relevante e pode ser fonte de conhecimento das interações que ocorrem entre o patógeno e o hospedeiro.
Iniciamos este estudo avaliando o perfil celular dos pacientes portadores de tuberculose e comparando-o com o obtido para indivíduos clinicamente saudáveis, que chamamos de grupo controle. Para isso, analisamos o fenótipo das populações e subpopulações de linfócitos circulantes no sangue periférico dos indivíduos do estudo. Nossa primeira observação foi que os pacientes portadores de tuberculose apresentavam uma redução significativa no número de linfócitos totais, linfopenia, em relação ao grupo controle. Esta observação corrobora dados de outros autores (BECK et al., 1985; ONWUBALILI; EDWARDS; PALMER, 1987; SINGHAL et al., 1989; VEENSTRA et al., 2006) e nos permite confirmar que a tuberculose está associada a uma linfopenia significativa.
Quando as subpopulações de linfócitos B e T dos pacientes foram analisadas e correlacionadas com dados obtidos para indivíduos saudáveis, observamos que a diminuição do número de linfócitos totais é conseqüência direta da redução do número de linfócitos B, linfócitos T e suas subpopulações CD4+ e CD8+. Em relação a linfopenia de células T CD4+, os dados encontrados no nosso estudo corroboram os relatados por diversos outros autores, os quais mostraram que pacientes portadores de tuberculose apresentam uma redução no número de linfócitos T CD4+, quando comparados a indivíduos saudáveis (BECK et al., 1985; ONWUBALILI; EDWARDS; PALMER, 1987; SINGHAL et al., 1989; TURETT; TELZAK, 1994; RODRIGUES et al., 2002; VEENSTRA et al., 2006). Com relação aos números de linfócitos B e T CD8+, os dados encontrados na literatura são controversos. Beck et al. (1985), em um estudo realizado na Indonésia, relataram que o número absoluto de células T CD4+ era menor nos pacientes portadores de tuberculose em relação
aos controles, porém não foi observada diferença significativa na contagem de linfócitos T CD8+ e linfócitos B quando pacientes com tuberculose e controles saudáveis foram comparados. Em 1987, Onwubalili, Edwards e Palmer reportaram que a tuberculose pulmonar, em sua fase ativa, está associada a uma redução significativa nos números absolutos de linfócitos T CD4+ e linfócitos B, entretanto, relata que não existe diferença na contagem de células T CD8+.
Esta linfopenia significativa associada à tuberculose, como demonstrada em nosso estudo e suportada por dados de vários autores, pode ter um papel importante na imunossupressão observada durante a tuberculose. Esta supressão pode ser evidenciada claramente através da diminuição na produção de citocinas importantes, tais como IL-2 e IFN-γ (TOOSSI; KLEINHENZ; ELLNER, 1986; HIRSCH et al., 1999; TORRES et al., 1998), e pelo decréscimo da capacidade de proliferação de linfócitos durante a infecção (TORRES et al., 1994). Além disso, alguns autores descrevem que a gravidade da doença pode estar relacionada à depleção acentuada de linfócitos T, especialmente, dos linfócitos T CD4+ (JONES et al., 1997; PILHEU et al., 1997; MCDYER et al., 1997; RODRIGUES; SALOMAO; KALLAS, 2006).
Por outro lado, quando o número de células NK e NKT foi avaliado, nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos pacientes e controle. Células NK e NKT, na imunidade à tuberculose, são capazes de ativar células fagocíticas no local da infecção, além de produzirem IFN-γ, citocina primordial para uma resposta eficaz contra o bacilo (CHACKERIAN; PERERA; BEHAR, 2002; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002; RAJA, 2004). Os trabalhos encontrados na literatura também apresentam resultados controversos quanto aos números de células NK e NKT na tuberculose. Em 2000, Jason et al. demonstraram que o número células NKT em pacientes com tuberculose e em indivíduos controles eram semelhantes, dados que confirmam o encontrado no nosso estudo. Entretanto, um estudo publicado recentemente demonstra que pacientes com tuberculose no momento do diagnóstico apresentam um número reduzido de células NK e NKT quando comparados a indivíduos controles (VEENSTRA et al., 2006).
Outra subpopulação de linfócitos T avaliada neste estudo foram as células T CD4+CD25HIGH, ou células reguladoras. Os resultados obtidos em nosso estudo
revelaram que pacientes portadores de tuberculose pulmonar apresentam uma maior freqüência de células T reguladoras quando comparados a indivíduos saudáveis. O envolvimento destas células no controle de respostas auto-imunes já foi anteriormente comprovado, entretanto o papel das células reguladoras nas doenças infecciosas ainda é motivo de interesse no meio científico. É possível que alguns patógenos possam explorar as propriedades reguladoras de tais células para subverter a resposta protetora do hospedeiro, induzindo a produção de respostas antiinflamatórias ou imunossupressoras permitindo, assim, a permanência do patógeno no hospedeiro infectado (MILLS, 2004). Recentemente, dois grupos de pesquisadores demonstraram que a freqüência de células T reguladoras é 3 vezes maior em pacientes com tuberculose quando comparados a indivíduos saudáveis (RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2006; GUYOT-REVOL et al., 2006). Estes estudos forneceram as primeiras evidências do papel das células T reguladoras na tuberculose e são consistentes com a hipótese de que as células T reguladoras participam da supressão da resposta imune observada na doença.
A história natural da tuberculose mostra que a maioria dos indivíduos são resistentes, provavelmente por sua habilidade em gerar uma resposta imune eficaz
contra a infecção pelo M. tuberculosis. Dos indivíduos que são expostos ao bacilo, apenas 10% a 30% se tornam infectados, indicando que alguns indivíduos são capazes de eliminar o bacilo antes mesmo que ocorra a sua instalação no pulmão. Dos indivíduos que se tornam infectados (adquirem sensibilidade tardia a antígenos micobacterianos, evidenciada pelo teste tuberculínico), 90% ou mais não desenvolvem a tuberculose, o que significa que esses indivíduos são capazes de controlar a infecção completamente, ou a níveis incapazes de causar doença (NORTH; JUNG, 2004). Neste contexto, acredita-se que características individuais possam ser fatores determinantes de susceptibilidade ou resistência à tuberculose. A presença de outras infecções crônicas, induzindo alterações imunológicas no hospedeiro e, conseqüentemente, modificando a susceptibilidade ao patógeno, pode ser um fator importante para o desenvolvimento da tuberculose.
Paralelamente, sabe-se que infecções helmínticas afetam mais de um quarto da população mundial, especialmente nos países em desenvolvimento. Tais infecções podem provocar uma ativação sistêmica da resposta imunitária, com um predomínio do perfil de respostas do tipo Th2 e um estado de hiporesponsividade imune celular e anergia. Estas alterações no sistema imune, aliadas à distribuição geográfica similar das infecções helmínticas e da tuberculose, sugerem que a investigação dos efeitos da infecção helmíntica na resposta imune dos indivíduos também infectados pelo M. tuberculosis, possa ser importante para a elucidação dos mecanismos envolvidos na imunopatologia da tuberculose. Nesse contexto, o perfil celular de pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais e a produção de citocinas importantes, tais como IL-10 e IFN-γ, foram avaliados. Adicionalmente, tentamos avaliar o impacto da infecção helmíntica nos achados radiográficos dos pacientes portadores de tuberculose a fim de contribuirmos com a elucidação da interação entre duas importantes causas de morbidade no nosso meio.
Para avaliarmos o impacto das infecções helmínticas na resposta imune frente ao M.
tuberculosis, dividimos os pacientes portadores de tuberculose do nosso estudo em
dois grupos, de acordo com a presença, ou não, de co-infecção por helmintos intestinais: pacientes portadores de tuberculose sem infecção helmíntica (grupo TB) e pacientes portadores de tuberculose com infecção helmíntica (grupo
TB+Helmintos). Analizamos, então, os perfis celulares dos pacientes com tuberculose, agora subdivididos nos dois grupos distintos.
Na avaliação imunofenotípica por citometria de fluxo, onde podemos conhecer as subpopulações celulares, observamos que os pacientes do grupo TB+Helmintos apresentavam um reduzido número de linfócitos T e que esta linfopenia era acompanhada da redução no número de linfócitos T CD4+ e T CD8+. Assim, podemos sugerir que a infecção helmíntica induz uma maior depleção de células T auxiliares e citotóxicas, fundamentais para o controle da infecção pelo M.
tuberculosis. Essa diminuição no número de células T CD4+ e T CD8+ observada
em sangue periférico pode ser conseqüência da compartimentalização destas células para os locais das infecções, ou seja, compartimentalização das células no trato respiratório e no trato gastrointestinal.
Os resultados obtidos no nosso estudo demonstraram que a presença de helmintíases intestinais não altera o número de linfócitos B e celulas NK nos pacientes portadores de tuberculose. Entretanto, quando avaliamos o número de células NKT, observamos que os pacientes co-infectados apresentam uma redução no número dessas células. Um estudo experimental publicado recentemente demonstra a participação das células NKT na resposta imune frente ao
Schistossoma mansoni (MALLEVAEY et al., 2006). Nesse trabalho os autores
relatam que, em camundongos infectados com ovos de Schistossoma mansoni, observa-se a preseça de células NKT com fenótipo ativado, além da produção de citocinas como IFN-γ e IL-4. Desse modo, os autores demonstram o envolvimento destas células na imunidade frente ao helminto.
A imunossupressão observada nos pacientes portadores de tuberculose tem sido associada à baixa produção de IFN-γ (HIRSCH et al., 1999). No nosso estudo, foi possível avaliar a produção desta citocina em pacientes co-infectados e não infectados com helmintos intestinais. Quando avaliamos os níveis de IFN-γ em cultura de sangue total, observamos que a produção desta citocina foi significativamente menor em pacientes do grupo TB+Helminto quando comparados aos pacientes do grupo TB. Pudemos também observar que esta diminuição no
nível de IFN-γ produzido em cultura de sangue dos pacientes do grupo TB+Helminto era reduzido, não só no momento do diagnóstico, mas que, a supressão na produção de IFN-γ por este grupo de pacientes se mantinha reduzido quando avaliado no fim do tratamento anti-tuberculose. Este dado indica que a infecção helmíntica presente no momento do diagnóstico pode refletir em alterações imunológicas por um período prolongado, evidenciada pela supressão na produção de citocina no sexto mês após o diagnóstico de ambas as infecções.
Avaliamos também os níveis de IL-10 em sobrenadantes de cultura de sangue total, obtidos no início do tratamento. Observamos que não houve diferença estatísticamente significativa na produção desta citocina entre os dois grupos estudados. Entretanto, ao término do tratamento antituberculose, os níveis de IL-10 nos pacientes do grupo TB sofreram uma redução significativa, enquanto os níveis desta citocina no grupo TB+Helminto permaneceram elevados, mantendo níveis semelhantes aos observados no Dia 0. A observação da manutenção dos níveis de IL-10 no fim do tratamento anti-tuberculose nos pacientes do grupo TB+Helminto pode ser correlacionada com a supressão prolongada na produção de IFN-γ nos mesmos pacientes. Assim, com os níveis de IL-10 (uma importante citocina imunossupressora) em declínio, a produção de IFN-γ se eleva e a resposta imune eficaz contra o M. tuberculosis pode ser estabelecida. Entretanto, nos pacientes co- infectados com helmintos intestinais, observamos que os níveis de IL-10 permanecem comparáveis no início e no fim do tratamento com as drogas tuberculostáticas. Portanto, estes dados sugerem que, ao final do tratamento anti- tuberculose, a produção suprimida de INF-γ em cultura nos pacientes do grupo TB+Helminto pode ser resultado de uma produção contínua de IL-10.
Nesse contexto, decidimos investigar os níveis de IL-5 em cultura de sangue total nos grupos estudados, a fim de avaliarmos a influência de uma citocina Th2 na resposta imune de indivíduos portadores de tuberculose infectados ou não por helmintos intestinais. Entretanto, esta citocina não foi detectada nos sobrenadantes de cultura de sangue total nas amostras avaliadas. Este fato nos sugere que a produção de IL-5 pode não estar relacionada à regulação da produção de IFN-γ pelas células Th1 ou, simplesmente, à limitação de sensibilidade do imunoensaio
utilizado para detecção desta citocina. Estudos futuros, avaliando a expressão de RNA mensageiro, poderão ser úteis na elucidação da participação da IL-5 e de outras citocinas Th2 na regulação da resposta imune observada.
A participação das células T reguladoras em infecções helmínticas também vem sendo descrita na literatura (SATOGUINA et al., 2002; MCKEE; PEARCE, 2004). Em um estudo, utilizando um modelo experimental murino, infectado por S. mansoni, foi demonstrada a elevada produção de IL-10 pelas células T reguladoras e a produção desta citocina contribuía para a polarização Th2 da resposta imune pela supressão do desenvolvimento de uma resposta Th1 (MCKEE; PEARCE, 2004). Este achado poderia estar relacionado à contínua produção de IL-10 em nosso estudo. Sendo assim, foram então avaliadas as freqüências de células T reguladoras nos pacientes portadores de tuberculose, infectados ou não com helmintos intestinais. Surpreendentemente, os resultados obtidos demonstraram que em ambos os grupos estudados, a freqüência de células T reguladoras circulantes é muito semelhante. Este fato nos leva a pensar que tais células podem estar seqüestradas nos sítios inflamatórios em questão, trato respiratório e o tecido linfóide associado às mucosas, e dessa forma, estariam com o seu número reduzido no sangue periférico. Assim, nesse estudo, não foi possível comprovarmos a participação das células T reguladoras na imunodepressão acentuada existente nos pacientes portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais.
Para investigar se as diferenças encontradas nos números de células e nos perfis de produção de citocinas apresentavam uma correlação clínica, avaliamos dados obtidos nos exames radiográficos, tais como quantificação do número de cavidades e zonas pulmonares acometidas, assim como o grau de fibrose, dos pacientes portadores de tuberculose co-infectados e não infectados por helmintos intestinais. Apesar de observarmos que a maioria dos pacientes do nosso estudo apresentava doença grave, este fato pode ser explicado, pois, um dos critérios de inclusão dos pacientes no estudo era que eles apresentassem baciloscopia de escarro positiva. Sabe-se que pacientes com esta característica, normalmente, apresentam doença em um estágio mais avançado (GOMES; SAAD JUNIOR; STIRBULOV, 2003; MATSUOKA et al., 2004). Apesar de não ser estatisticamente siginficativa, a freqüência de pacientes com doença moderada e avançada tende a ser maior no
grupo TB+Helminto. Além disso, no nosso grupo de pacientes estudados, não foi observado nenhum paciente do grupo TB+Helminto com doença mínima. Assim, avaliando estes resultados, sugerimos que pacientes portadores de co-infecção tuberculose e helmintíase intestinal têm uma doença mais avançada quando comparados aos pacientes não infectados por helmintos.
A hipótese, sugerindo que pacientes co-infectados com tuberculose e helmintos têm uma doença mais grave, pode ser diretamente relacionada à queda significativa no número de células T CD4+ nestes mesmos pacientes, como foi observado em nosso
trabalho. Em 1997, em um estudo que relacionava a gravidade da doença com os números de células T circulantes, os autores reportam que pacientes com piores condições clínicas, incluindo perda de peso acentuada, apresentavam uma redução significativa na contagem de células T CD4+ quando comparados a pacientes com condições clínicas mais preservadas (PILHEU et al., 1997).
A análise mais específica dos dados radiográficos, incluindo a quantificação do número de cavidades e zonas acometidas, assim como o grau de fibrose observado nos exames de raios-X dos pacientes portadores de tuberculose, confirma o achado descrito anteriormente. Avaliando estes parâmetros no momento do diagnóstico da tuberculose (Dia 0) e no fim do tratamento anti-tuberculose (Mês 6), observamos que os pacientes co-infectados apresentavam características que indicam um maior grau de severidade da doença.
Um dado interessante é o que demonstra o número de zonas envolvidas nos pacientes dos dois grupos avaliados antes e após o tratamento. Apesar de não existir diferença significativa no Dia 0, os pacientes do grupo TB+Helminto apresentavam um maior número de zonas pulmonares acometidas ao final do tratamento. Assim, mesmo com a regressão da doença nos dois grupos de pacientes avaliados, os pacientes portadores de tuberculose co-infectados apresentaram uma doença pulmonar mais prolongada em relação aos portadores de tuberculose não infectados por helmintos intestinais. Isto nos sugere que indivíduos portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais podem apresentar uma demora na recuperação das lesões pulmonares e na cura da doença, fato que demanda estudos mais aprofundados.
É importante ressaltar que, apesar das considerações realizadas com base nos achados clínicos e radiográficos, todos os pacientes do estudo apresentaram cura clínica e bacteriológica da tuberculose, independente da presença dos helmintos intestinais. Foram realizadas culturas de escarro semanalmente e todos os pacientes estudados apresentaram cultura negativa na oitava semana após o início do tratamento com as drogas tuberculostáticas (dados não demonstrados).
Em suma, acreditamos que, na presença de infecção helmíntica, onde existe polarização para uma resposta imune Th2, a presença concomitante de infecção pelo M. tuberculosis induz, de forma ineficaz uma resposta Th1. Nessa situação, consideramos que vários fatores em conjunto possam co-existir, levando a uma falha na imunidade mediada por células na resposta anti-M. tuberculosis . Dentre eles: a) hipoergia e/ou anergia, com aumento da expressão de CTLA-4 (BORKOW et al, 2000) e aumento na secreção de citocinas imunossupressoras, como IL-10 e TGF-β (LENG; BENTWICH; BORKOW, 2006); b) interferência nos mecanismos de transdução de sinal (BENTWICH et al, 1999); c) aumento do número de células T reguladoras, com conseqüente regulação negativa da resposta do tipo Th1 (SATOGUINA et al, 2002; MCKEE; PEARCE, 2004) e finalmente d) diminuição da atividade de macrófagos, permitindo assim a proliferação do bacilo.
Avaliando os dados obtidos na literatura científica e os resultados obtidos em nosso estudo, reforçamos a hipótese de que a infecção helmíntica pode influenciar a patogênese da tuberculose. A presença dos helmintos, aparentemente, induz uma maior susceptibilidade do hospedeiro à infecções pelo M. tuberculosis, prejudicando a habilidade do hospedeiro em organizar uma resposta imune protetora a essa infecção. Uma implicação prática, baseada nessa hipótese, é que a erradicação dos parasitas intestinais, com a conseqüente eliminação da modulação imune causada pelos mesmos, poderia alterar a história natural da tuberculose.