Avaliação do impacto da presença de helmintos intestinais na resposta imune celular contra o Mycobacterium tuberculosis em pacientes com tuberculose pulmonar

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS. Tatiana de Resende Có. AVALIAÇÃO DO IMPACTO DA PRESENÇA DE HELMINTOS INTESTINAIS NA RESPOSTA IMUNE CELULAR CONTRA O Mycobacterium tuberculosis EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR. Vitória 2006.

(2) TATIANA DE RESENDE CÓ. AVALIAÇÃO DO IMPACTO DA PRESENÇA DE HELMINTOS INTESTINAIS NA RESPOSTA IMUNE CELULAR CONTRA O Mycobacterium tuberculosis EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Doenças Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues. Vitória 2006.

(3) Ao Fabrício, que esteve ao meu lado nas horas em que chorei e nas horas em que sorri, nas horas em que me lamentei e nas horas em que demonstrei alegria. Agradeço pelo sorriso diário, sem mágoas nem rancores. Para você, todo o meu amor..

(4) AGRADECIMENTOS. “A felicidade aparece para aqueles que choram, para aqueles que se machucam. Para aqueles que buscam e tentam sempre. E para aqueles que reconhecem a importância das pessoas que passam por suas vidas” (Clarice Lispector) Ao meu orientador Rodrigo Ribeiro Rodrigues, por toda a ajuda e ensinamentos, não só neste período do mestrado, mas em toda a minha formação profissional. O meu muito obrigada por toda a confiança em mim depositada. A sua alegria e o seu entusiasmo são fontes diárias para o meu amadurecimento pessoal e profissional. A Christina Hirsch, pesquisadora da Case Western Reserve University, pela imprescindível contribuição e participação na realização deste trabalho. Muito obrigada! A Elenice Moreira Lemos, por toda a sua ajuda, que foi fundamental para a realização deste trabalho.. Obrigada pela amizade e por todo o incentivo dado. nestes anos de convivência. Ao Moisés Palaci, que me ensinou a trabalhar com a pesquisa.. Obrigada por. partilhar os seus conhecimentos, de forma sempre alegre e gentil, como lhe é peculiar. Ao Reynaldo Dietze, coordenador do Núcleo de Doenças Infecciosas, a minha admiração por todos os desafios enfrentados para a manutenção deste respeitado centro de pesquisa. Obrigada por permitir que eu faça parte da sua equipe. Ao Dr. Fausto Edmundo Lima Pereira, coordenador da pós-graduação, meu. respeito e profunda admiração pela incessante vontade de saber..

(5) A Fabíola Karla Corrêa Ribero, minha amiga querida, madrinha, afilhada, companheira de todas as horas. Obrigada pela sua amizade e pela sua presença em todos os momentos da minha vida. A amiga Renata Lyrio Peres, que está sempre disposta a ajudar. Obrigada pelo o incentivo, em todos os momentos. A Marcela Segatto, pela atenção e cuidado comigo, pelas palavras de carinho e amizade. Aos meus amigos do Laboratório de TB: João, Maria, Solange, Gustavo, Dete, Rafael e Thiago, que fazem desta equipe mais do que uma equipe de trabalho, mas sim, um grupo especial de amigos. Agradeço especialmente a Maria, por segurar muitas barras sozinha enquanto eu assistia às aulas da pós-graduação. Às minhas amigas do Laboratório de Imunologia: Carlinha, Valéria e Eneida, sempre carinhosas e dispostas a ajudar. Obrigada por toda a colaboração na realização deste trabalho. Um agradecimento especial a Carlinha, que aos 45 minutos do segundo tempo, com todo o carinho e dedicação, me ajudou a finalizar este trabalho. Aos amigos Jauber, Fábio, Bianca, Fabiana, Cris, Ketene, Rômulo, Ana Cláudia, obrigada pelo apoio, sorrisos e pela agradável convivência. A todos os demais amigos do NDI, que com suas diferentes características pessoais, tornam a rotina de trabalho mais alegre e amena. A Dr Valdério do Valle Dettoni pela disponibilidade em me ajudar nas análises das radiografias dos pacientes incluídos neste estudo. A Nair Corrêa Ribeiro (tia Nair), pela correção ortográfica do texto. A Fátima Aparecida Pereira, secretária da pós-graduação, por todos estes anos de amizade e pelo auxílio nas questões burocráticas..

(6) Aos meus pais Euclides e Rosalie Có, agradeço por tudo que hoje sou... se sei o que é ser uma pessoa de bom caráter é porque vocês me ensinaram, não somente com palavras, mas com atos e com exemplo. Obrigada por todas as oportunidades que vocês me deram, imprescindíveis para que eu pudesse buscar os meus ideais. Amo vocês! As minhas irmãs Roberta e Amanda, pela torcida e apoio em todos os momentos. A nossa convivência sempre alegre e harmoniosa faz a minha vida muito mais feliz. Ao meu marido Fabrício Souza Pelição, obrigada pela presença e desculpa pela ausência neste período, que às vezes parecia sem fim. O seu carinho, atenção e incentivo foram fundamentais para que eu pudesse chegar até aqui. A Deus, por todas as maravilhas que tem me permitido. Obrigada por colocar no meu caminho pessoas tão especias como estas..

(7) ” Febre, hemoptise, dispnéia e suores noturnos. A vida inteira que podia ter sido e que não foi. Tosse, tosse, tosse. Mandou chamar o médico: — Diga trinta e três. — Trinta e três . . . trinta e três . . . trinta e três . . . — Respire. O senhor tem uma escavação no pulmão esquerdo e o pulmão direito infiltrado. — Então, doutor, não é possível tentar o pneumotórax? — Não. A única coisa a fazer é tocar um tango argentino.” Manuel Bandeira, 1930. Felizmente hoje podemos mais....

(8) RESUMO A resposta imune celular tem um papel fundamental na evolução clínica do hospedeiro após a exposição ao Mycobacterium tuberculosis (MTB).. Essa. resposta imune é mediada por uma resposta do tipo Th1, com a produção de IFN-γ, principal citocina na ativação do macrófago e, conseqüentemente, na eliminação do bacilo. Vários fatores podem estar relacionados com a resistência a tuberculose. Neste trabalho, foi avaliado o papel da infecção helmíntica na resposta imune MTB-específica durante a tuberculose ativa em pacientes portadores de tuberculose, co-infectados por helmintos intestinais, no momento do diagnóstico e durante a terapia antituberculose. Para isso, foram arrolados 40 pacientes, com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar. Desses pacientes, 27% eram portadores de pelo menos uma espécie de helminto intestinal (grupo TB+Helminto). A presença de helmintos intestinais nos pacientes portadores de tuberculose levou a um efeito negativo nos números absolutos de linfócitos totais, linfócitos B, linfócitos T (CD4+ and CD8+) e células NKT. Essas alterações nos números de células estavam acompanhadas de uma diminuição na produção de IFN-γ e de elevados e prolongados níveis de IL-10 em sobrenadantes de cultura de sangue total no grupo TB+Helminto, quando comparado ao grupo nãoinfectado por helmintos intestinais. Adicionalmente à supressão da imunidade anti-MTB, os pacientes do grupo TB+Helminto apresentaram doença pulmonar mais grave (avaliada pelo exame radiográfico), com uma diferença significativa no número. de zonas pulmonares envolvidas ao final do tratamento. antituberculose.. Os resultados desse trabalho sugerem que a infecção. helmíntica intestinal pode prejudicar a resposta imune protetora nos pacientes portadores de tuberculose..

(9) ABSTRACT The cellular immune response probably plays a pivotal role in determining the clinical outcome after exposure to Mycobacterium tuberculosis (MTB).. This immune. response is mediated by Th1 cells, with production of IFN-γ, the major cytokine in macrophage activation and mycobacteria eradication. Several factors can be related to tuberculosis resistance. We investigated the role of intestinal helminth infection on M. tuberculosis specific immune response during active tuberculosis in patients with concomitant tuberculosis and intestinal helminth infection at the time of diagnosis and during tuberculosis therapy. Forty patients with newly diagnosed tuberculosis were enrolled in this study. Twenty-seven percent of these patients were co-infected with at least one intestinal helminth (TB+Helminths patients). Concomitant intestinal helminth infection and tuberculosis had a negative impact on absolute numbers of total lymphocytes, B cells, T cells (CD4+ and CD8+), and NKT cells. These alterations were also accompanied by lower IFN-γ and elevated and sustained IL-10 levels in whole blood cultures from TB+Helminths patients as compared to TB patients. In addition to a depressed anti-MTB immunity, TB+Helminths patients also presented more severe radiological pulmonary disease, with significant difference in the number of involved lung zones at the end of tuberculosis treatment. The data from this study indicated that intestinal helminth infection can disturb the protective immune response in patients with tuberculosis..

(10) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Número estimado de casos novos de tuberculose em 2004 ...... 20 Figura 2. Contágio da tuberculose e localização da lesão pulmonar típica 21 Figura 3. Micrografia eletrônica do M. tuberculosis (quadro à esquerda). O quadro à direita demonstra esquematicamente os principais constituintes da parede celular do gênero Mycobacterium ......... 22 Figura 4. Representação esquemática dos receptores presentes nas células fagocíticas envolvidos na fagocitose e no reconhecimento do M. tuberculosis. A figura indica a participação dos receptores de complemento, receptores de manose, receptores “scavengers” e receptores “toll like” no mecanismo de ativação imune via ativação de NF-κB ............... 26 Figura 5. Mecanismos celulares envolvidos na resposta imune da tuberculose. A figura representa a participação das células T CD4+, T CD8+, NK e Tγδ na secreção de IFN-γ, citocina que participa na ativação do macrófago infectado. A figura também demonstra a atividade citolítica das células T CD8+, células NK e células Tγδ ................................................................................ 28 Figura 6. Participação das células T reguladoras na modulação de respostas efetoras de células T CD4+ (Th1 e Th2), T CD8+ e neutrófilos .................................................................................... 30 Figura 7. Mapa-mundi indicando as regiões onde os helmintos intestinais são considerados problemas de saúde pública .......................... 33 Figura 8. Produção de citocinas pelas células CD4 Th1 e Th2. No quadro à esquerda está representada a secreção de IL-10 e TGF-β pelas células Th2, que inibem a ativação e a proliferação de células Th1. O quadro, à direita, ilustra a produção de IFN-γ pelas células Th1, que atua inibindo a proliferação de células Th2 .............................................................................................. 34 Figura 9. Seqüência dos procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de populações celulares por citometria de fluxo. A) Gráfico de distribuição pontual Tamanho versus Granulosidade utilizado para a seleção da população de interesse, nesse caso, os linfócitos – R1. B) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o percentual das populações ou subpopulações celulares específicas em R1 ...... 46.

(11) Figura 10. Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de células T reguladoras (CD4+CD25HIGH) por citometria de fluxo. A) Gráfico de distribuição pontual Tamanho versus Granulosidade utilizado para a seleção da população de interesse, nesse caso os linfócitos – R1. B) Gráfico de distribuição pontual FL1/CD4 versus FL2/CD25 utilizado para quantificar o percentual de células T reguladoras (CD4+CD25HIGH) em R4 .............................................................. 47 Figura 11. Números absolutos (células/mm3) de A) linfócitos; B) linfócitos T; C) linfócitos B; D) células NK e E) células NKT circulantes no sangue periférico de indivíduos clinicamente saudáveis e pacientes portadores de tuberculose. Os resultados estão expressos em média dos números de células e desvio padrão para cada grupo analisado. As diferenças significativas (p≤0,05) estão indicadas nas figuras com os respectivos valores de p ................................................................................. 53 Figura 12. Números absolutos (células/mm3) de A) linfócitos T CD4+ e B) linfócitos T CD8+ circulantes no sangue periférico de indivíduos clinicamente saudáveis e pacientes portadores de tuberculose. Os resultados estão expressos em média dos números de células e desvio padrão para cada grupo analisado. As diferenças significativas (p≤0,05) estão indicadas nas figuras com os respectivos valores de p ................................................. 54 Figura 13. Freqüência de A) células CD4+CD25+ e B) células CD4+CD25HIGH circulantes no sangue periférico de indivíduos clinicamente saudáveis e nos indivíduos portadores de tuberculose. Os resultados estão expressos em média do percentual de células e desvio padrão para cada grupo analisado. As diferenças significativas (p≤0,05) estão indicadas nas figuras com os respectivos valores de p .............................. 55 Figura 14. Números absolutos (células/mm3) de A) linfócitos totais; B) linfócitos T; C) linfócitos B; D) células NK e E) células NKT circulantes no sangue periférico de indivíduos clinicamente saudáveis, pacientes portadores de tuberculose não infectados com helmintos intestinais e nos pacientes portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais. Os resultados estão expressos em média dos valores absolutos de células e desvio padrão para cada grupo analisado. As diferenças significativas (p≤0,05) estão indicadas nas figuras com os respectivos valores de p ................................................. 56.

(12) Figura 15. Números absolutos (células/mm3) de A) linfócitos T CD4+ e B) linfócitos T CD8+ circulantes no sangue periférico de indivíduos clinicamente saudáveis, pacientes portadores de tuberculose não infectados com helmintos intestinais e nos pacientes portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais. Os resultados estão expressos em média dos valores absolutos de células e desvio padrão para cada grupo analisado. As diferenças significativas (p≤0,05) estão indicadas nas figuras com os respectivos valores de p .............................. 58 Figura 16. Níveis de citocinas (pg/mL), A) IFN-γ e B) IL-10, em sobrenadantes de cultura de sangue total, no início e no fim do tratamento anti-tuberculose, em pacientes portadores de tuberculose não infectados com helmintos intestinais e nos pacientes portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais. Os resultados estão expressos em média de concentração da citocina e desvio padrão para cada grupo analisado. As diferenças significativas (p≤0,05) estão indicadas nas figuras com os respectivos valores de p .............. 59 Figura 17. Freqüência de células CD4+CD25HIGH em células CD4+ circulantes no sangue periférico de pacientes portadores de tuberculose não infectados com helmintos intestinais e nos pacientes portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais. Os resultados estão expressos em média do percentual de células e desvio padrão para cada grupo analisado ..................................................................................... 61 Figura 18. Análise da extensão da doença pulmonar em pacientes portadores de tuberculose não infectados com helmintos intestinais e nos pacientes portadores de tuberculose coinfectados com helmintos intestinais. Os resultados estão expressos em percentual (%) de pacientes em cada categoria de doença (mínima, moderada e avançada) em cada grupo analisado ..................................................................................... 62 Figura 19. Análise de dados radiográficos específicos, como A) número de cavidades, B) grau de fibrose e C) número de zonas pulmonares envolvidas pela doença em pacientes portadores de tuberculose não infectados com helmintos intestinais e nos pacientes portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais. As análise foram realizadas no início e no fim do tratamento anti-tuberculose e os resultados estão expressos em média e desvio padrão para cada grupo analisado. As diferenças significativas (p≤0,05) estão indicadas nas figuras com os respectivos valores de p .............. 64.

(13) LISTA DE TABELAS Tabela 1. Tabela 2.. Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de populações, subpopulações celulares e moléculas de superfície .............................................................. 45 Dados demográficos dos indivíduos clinicamente saudáveis (grupo Controle) e dos pacientes portadores de tuberculose (grupo TB) ................................................................................... 51.

(14) LISTA DE SIGLAS AIDS: acquired immune deficiency syndrome HIV: human immunodeficiency virus CD: cluster of differentiation CR: complement receptor CTLA-4: cytotoxic T lymphocyte-associated 4 EDTA: ácido etilenodiaminotetracético ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay FITC: fluorescein isothiocyanate FUNASA: Fundação Nacional de Saúde HLA-DR: antígeno leucocitário humano – loccus DR HUCAM: Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes IFN-γγ: interferon-gama Ig: imunoglobulina IL: interleucina NF-κ κB: nuclear factor kappa-B NK: natural killer NKT: natural killer T PE: phicoeritrin PerCP: peridinin-chlorophyll-protein PHA: phytohemagglutinin PPD: purified protein derivative TGF-β β : transforming growth factor beta Th1: T helper TLR: toll like receptor TNF-α α: tumor necrosis factor alpha WHO: World Health Organization.

(15) SUMÁRIO 1. Introdução …………………………………………………………………….. 19. 1.1. A Tuberculose …………………………………………………………………. 19. 1.2. Agente etiológico, diagnóstico e tratamento da tuberculose ……………... 1.3. Aspectos Imunológicos na tuberculose …………………………………….. 24. 1.4. As helmintíases intestinais ........................................................................ 32. 1.5. Resposta imune contra helmintos ............................................................ 34. 1.6. Efeito da infecção helmíntica na resposta Th1 ......................................... 35. 2. Objetivos ................................................................................................. 39. 2.1. Objetivo geral ........................................................................................... 39. 2.2. Objetivos específicos ................................................................................ 39. 3. Material e métodos ................................................................................. 41. 3.1. Modelo de estudo ..................................................................................... 41. 3.2. Considerações éticas ............................................................................... 41. 3.3. Caracterização dos indivíduos do estudo ................................................. 41. 3.4. Avaliação hematológica ............................................................................ 44. 3.5. Avaliação imunofenotípica por citometria de fluxo dos leucócitos do. 22. sangue periférico ...................................................................................... 44 3.6. Análise dos resultados obtidos pela citometria de fluxo ........................... 46. 3.6.1 Análise convencional ................................................................................ 46 3.6.2 Análise de células T reguladoras ............................................................. 47 3.7. Cultura de sangue total ............................................................................ 48. 3.8. Quantificação dos níveis de citocinas ...................................................... 48. 3.9. Análises estatísticas ................................................................................. 49.

(16) 4. Resultados ............................................................................................... 51. 4.1. Caracterização dos indivíduos do estudo ................................................. 51. 4.2. Análise de linfócitos e subpopulações de linfócitos circulantes em pacientes portadores de tuberculose e em indivíduos saudáveis ............. 4.3. Análise de subpopulações de linfócitos T circulantes em pacientes portadores de tuberculose e em indivíduos saudáveis ............................. 4.4. 52 54. Freqüência de linfócitos T CD4+ ativados (CD4+CD25+) e células T reguladoras (CD4+CD25HIGH) no sangue periférico de pacientes portadores de tuberculose e de indivíduos saudáveis .............................. 4.5. 55. Análise de linfócitos e subpopulações de linfócitos circulantes em pacientes portadores de tuberculose co-infectados (TB+Helminto) e não infectados (TB) com helmintos intestinais ................................................. 56. 4.6. Análise de subpopulações de linfócitos T circulantes em pacientes portadores. de. tuberculose. co-infectados. (TB+Helminto). e. não. infectados (TB) com helmintos intestinais ................................................. 58 4.7. Perfil de citocinas no início e no fim do tratamento anti-tuberculose em pacientes portadores de tuberculose co-infectados (TB+Helminto) e não infectados (TB) com helmintos intestinais ................................................. 59. 4.8. Freqüência de células T reguladoras (CD4+CD25HIGH) circulantes em pacientes portadores de tuberculose co-infectados (TB+Helminto) e não infectados (TB) com helmintos intestinais ................................................. 61. 4.9. Extensão da doença pulmonar no raio-X de tórax em pacientes portadores infectados. de. tuberculose. co-infectados. (TB). com. .................................................................... (TB+Helminto). helmintos. e. não. intestinais 62. 5. Discussão ................................................................................................ 66. 6. Conclusões .............................................................................................. 76. 7. Referências .............................................................................................. 79.

(17) Introdução.

(18) 1 INTRODUÇÃO. 1.1 A Tuberculose A análise de registros históricos de diversas civilizações, incluindo o estudo detalhado de múmias (DONOGHUE et al., 2004), indicam que a tuberculose acompanha o homem desde a antiguidade. A doença tem sido registrada na história de povos das várias raças e nos diversos continentes. Dados históricos indicam que o risco de transmissão aumentou na proporção do adensamento das populações, sendo a urbanização, com a decorrente aproximação, e a convivência prolongada dos. indivíduos,. um. fator. importante. na. expansão. da. tuberculose. (BRASIL/MINISTÉRIO DA SAÚDE/FUNASA, 2002). Embora a tuberculose possa ser considerada um problema mundial, atingindo as pessoas indistintamente, ela guarda importantes características sociais, intimamente associadas à transmissão e à evolução da doença. Países em desenvolvimento, concentram mais de 95% de todos os casos e 98% das mortes devidas à tuberculose. Por outro lado, em países industrializados da Europa e na América do Norte, onde a incidência é muito menor, a maioria dos casos ocorre entre os imigrantes de países com alta prevalência de tuberculose (FURIN; JOHNSON, 2005). Apesar de vários autores considerarem a tuberculose como um problema reemergente, essa afirmativa aparenta ser válida apenas para alguns países europeus e para os Estados Unidos da América, contudo, esta afirmativa não é válida para o Brasil. Para nós, a tuberculose não é problema de saúde pública emergente nem, tampouco, reemergente, mas um problema constante e presente em nosso meio (RUFFINO-NETTO, 2002)..

(19) A Organização Mundial de Saúde estima que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis, sendo estimada, em 2004, a ocorrência de 9 milhões de novos casos de tuberculose no mundo, com um saldo de 2 milhões de óbitos (WHO, 2006).. Número estimado de novos casos (todas as formas). 0 - 999 1000 - 9999 10 000 – 99 999 100 000 - 999 999 1 000 000 ou mais Não estimado. Figura 1 – Número estimado de casos novos de tuberculose em 2004. Fonte: WHO, 2006. Dentre os vinte e dois países responsáveis por cerca de 80% de todos os casos de tuberculose no mundo, o Brasil ocupa a décima sexta posição. Em 2004, foram diagnosticados 110.000 novos casos, o que resulta em um coeficiente médio de incidência anual de 60 casos/100.000 habitantes.. A mortalidade, relatada neste. mesmo período, foi de 14.000 óbitos (WHO, 2006). No Estado do Espírito Santo foram notificados 1.301 casos novos em 2004, perfazendo uma incidência anual de 39,4 casos/100.000 habitantes, para todas as formas de tuberculose. A incidência média do Estado está, portanto, abaixo da média nacional e da região Sudeste, que é de 53 casos/100.000/ano (BRASIL, 2006). O contágio na tuberculose se dá mediante a inalação de ar contaminado por bacilos vivos sob a forma de pequenas partículas, envoltos em camada líquida (aerossol), eliminados a partir das lesões pulmonares de um doente através da tosse, espirro,.

(20) riso ou fala. Estima-se que 30% das pessoas expostas ao bacilo venham adquirir a infecção; sendo que, desse total, apenas 10% irão evoluir para alguma forma clínica da doença ao longo da vida. Os 90% dos indivíduos restantes, desenvolvem uma resposta imune suficientemente eficaz para conter ou eliminar a infecção (NORTH; JUNG, 2004).. Figura 2 – Contágio da tuberculose e localização da lesão pulmonar típica. Fonte: www.orchd.com/tb/whattb.asp. A lesão típica observada na tuberculose é o granuloma, normalmente apresentando características bastante específicas. No centro da lesão existe uma ou mais células gigantes, circundadas por diversas células epitelióides. Na periferia encontram-se numerosos linfócitos, alguns macrófagos e poucos plasmócitos.. Dois ou mais. destes granulomas podem fundir-se, originando nódulos visíveis macroscopicamente – os tubérculos.. Freqüentemente, ocorre uma necrose caseosa de extensão. variável no centro do granuloma. Os mecanismos responsáveis pela necrose não são bem conhecidos, mas parece dever-se à ação de linfotoxinas e de produtos secretados por macrófagos, como enzimas e radicais livres (PROLLA et al., 2000). Acredita-se que a resistência ou susceptibilidade ao M. tuberculosis, seja resultante de uma interação complexa entre fatores ambientais, microbiológicos, imunológicos e genéticos.. Evidências sugerem a existência de diferenças raciais na. susceptibilidade à tuberculose (BELLAMY, 1998). Stead et al. (1990), em um estudo que incluiu 25.000 enfermeiros com teste tuberculínico negativo, observaram que houve conversão do teste em 13,8 % dos profissionais negros e em apenas 7,2%.

(21) dos profissionais brancos sugerindo, com estes dados, que indivíduos negros apresentavam uma probabilidade 2 vezes maior de se tornarem infectados em relação aos indivíduos brancos.. Provavelmente, a evidência mais clara de que. fatores genéticos do hospedeiro estão associados à tuberculose, provêem de estudos em gêmeos. Esses estudos comparam a freqüência da tuberculose em gêmeos homozigotos e heterozigotos e relatam uma maior freqüência da doença em indivíduos homozigotos, sugerindo que a resistência ou susceptibilidade à tuberculose possa ser geneticamente determinada (KALLMANN, 1942; apud BELLAMY, 1998).. 1.2 Agente etiológico, diagnóstico e tratamento da tuberculose Em 1882, o cientista alemão Robert Koch apresentou à comunidade científica o isolamento e forma de cultivo do Mycobacterium tuberculosis, a partir de tubérculos (granulomas) macerados, identificando-o como o agente etiológico da tuberculose. O gênero Mycobacterium compreende microrganismos em forma de bastão, com dimensões de 0,2-0,7 x 1,0-10 µm, que não possuem flagelos, não formam esporos e não possuem cápsula.. Figura 3 – Micrografia eletrônica do M. tuberculosis (quadro à esquerda). O quadro à direita demonstra esquematicamente os principais constituintes da parede celular do gênero Mycobacterium. Fonte: www.cbc.ca/story/science/national/2006/03/17/tb-who060317.html.

(22) Uma série de aspectos torna esses microrganismos distintos dos demais gêneros bacterianos, muitos dos quais relacionados à composição de sua parede celular, a qual é composta primordialmente por lipídeos. Estima-se que, aproximadamente, 60% do peso seco do M. tuberculosis sejam devidos a ácidos graxos, tais como ácidos micólicos e ceras, os quais conferem a resistência característica ao tratamento com álcool-ácido, facilmente evidenciada pela técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, bem como resistência a álcalis, ácidos, anti-sépticos e a um amplo espectro de antibióticos (WAYNE; KUBICA, 1986). O M. tuberculosis é um bacilo aeróbio estrito, considerado intracelular facultativo por sua capacidade de multiplicar-se e sobreviver no interior de células fagocitárias. O seu tempo de geração é longo, aproximadamente 18 horas, em temperaturas próximas a 37ºC. Esse crescimento lento é responsável pela demora normalmente observada em sua detecção em meios de cultura e na ação das drogas utilizadas no tratamento. Esse microrganismo possui predileção pelos pulmões devido, tanto à tensão de oxigênio existente nestes órgãos, quanto à temperatura ideal para seu crescimento. A pesquisa bacteriológica ainda é o método de escolha, quer seja para o diagnóstico, quer seja para o controle da eficácia do tratamento da tuberculose. Esse mesmo método permite, também, a identificação da principal fonte de transmissão da infecção, o paciente bacilífero. O diagnóstico da tuberculose pode ser realizado através da pesquisa dos bacilos em amostras de espécimes clínicos (escarro, liquor, lavado bronco-alveolar, líquido pleural, linfonodos, etc) através de exame microscópico (baciloscopia) ou através do isolamento dos mesmos em cultura. Apesar da baciloscopia ser a forma mais rápida, simples e de menor custo para se diagnosticar a tuberculose, sua sensibilidade é baixa, visto que apenas 40% a 60% dos casos de doença pulmonar são detectados por este método. Por outro lado, a cultura convencional, em meio sólido, tem sensibilidade e especificidade superiores às da baciloscopia, mas requerem de 3 a 6 semanas para a detecção dos casos positivos.. Entretanto, a cultura é ainda o único recurso bacteriológico. disponível para análise fenotípica de resistência a drogas antituberculose e como fonte de material biológico (cepas) para estudos de epidemiologia molecular (GARG et al., 2003)..

(23) Desde o final da década de 70, os regimes terapêuticos antituberculose passaram a incluir as drogas isoniazida, rifampicina, pirazinamida, etambutol e estreptomicina, de forma combinada, em razão de suas características antimicrobianas e farmacológicas (COLE; TELENTI, 1995).. Atualmente, no Brasil são empregados. quatro esquemas de tratamento da tuberculose, recomendados pelo Ministério da Saúde, os quais diferem, entre si, quanto à indicação, duração e tipos de drogas utilizadas (CASTELO FILHO et al., 2004). Esses esquemas multiterápicos, quando utilizados de forma regular e adequada, permitem que mais de 90% dos pacientes com tuberculose sejam curados, mesmo quando os bacilos presentes possam ter adquirido resistência a uma determinada droga, sendo os mesmos eliminados pela ação das demais drogas (JACOBS, 1994).. 1.3 Aspectos Imunológicos na Tuberculose Durante os últimos anos, muitos estudos vêm sendo conduzidos com objetivo de elucidar os mecanismos da resposta imune contra o M. tuberculosis. A interação entre macrófagos infectados e linfócitos T é considerada a base para a imunidade celular protetora na tuberculose (VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002; BOOM et al. 2003). Na maioria dos indivíduos saudáveis, a resposta adaptativa mediada pelas células T controla a infecção, porém não é capaz de erradicar o M. tuberculosis. Assim, o desenvolvimento de uma resposta imune protetora é fundamental para a manutenção do bacilo persistente na sua forma dormente, situação conhecida como infecção latente (DANNENBERG, 1994). O primeiro evento ocorrido após a entrada do M. tuberculosis no pulmão é a fagocitose pelos macrófagos alveolares. Também participam do processo fagocítico as células dendríticas e os macrófagos derivados de monócitos (HENDERSON; WATKINS; FLYNN, 1997).. Durante a fagocitose do M. tuberculosis, diferentes. receptores nas células fagocíticas podem ser utilizados.. Os bacilos não-.

(24) opsonizados são reconhecidos e internalizados pelos macrófagos e células dendríticas via receptores de manose, que reconhecem resíduos de manose na superfície da micobactéria. Os receptores de complemento também participam do processo de endocitose do bacilo da tuberculose.. Uma vez opsonizado pelo. componente C3 do complemento, o bacilo é reconhecido e internalizado via receptores 1 (CR1), 3 (CR3) e 4 (CR4) do complemento.. Uma terceira via de. internalização do M. tuberculosis nas células fagocíticas é mediada por receptores do tipo “scavengers”.. Estes receptores são utilizados para mediar a fagocitose do. bacilo quando os receptores de manose e do complemento estão bloqueados (VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002). Além da fagocitose, acredita-se que o reconhecimento do M. tuberculosis ou de produtos micobacterianos pelos macrófagos, mediado por receptores “toll-like” (TLRs), seja uma etapa crucial para o desenvolvimento de uma resposta imune eficaz contra o bacilo. Os TLRs são mediadores da resposta imune inata essenciais para o reconhecimento da micobactéria pelos macrófagos e células dendríticas, garantindo que uma resposta imune apropriada seja desencadeada.. Estes. receptores participam da ativação de fatores transcricionais, como o NF-κB, na sinalização para a produção de citocinas. tuberculosis induzem a produção de IL-12,. Por meio dos TLRs, antígenos do M. importante citocina pró-inflamatória,. pelos macrófagos e células dendríticas (NORTH; JUNG, 2004; RAJA, 2004)..

(25) Figura 4 – Representação esquemática dos receptores presentes nas células fagocíticas envolvidos na fagocitose e no reconhecimento do M. tuberculosis. A figura indica a participação dos receptores de complemento, receptores de manose, receptores “scavengers” e receptores “toll like” no mecanismo de ativação imune via ativação de NF-κB. Fonte: VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002. Além das células fagocíticas, outras células da resposta imune inata estão envolvidas na resposta inicial na tuberculose, dentre elas, as células NK (“natural killer”), as células NKT e as células T γδ. As células NK podem tanto lisar o bacilo diretamente, bem como macrófagos infectados com o bacilo. Adicionalmente, estas células podem estar envolvidas com a produção não-específica de IFN-γ, citocina chave na resposta imune da tuberculose, como veremos adiante (VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002; RAJA, 2004). Em 2002, Chackerian et al., sugeriram a participação de células NKT na tuberculose.. Essas células podem. participar da resposta imune protetora pela rápida produção de IFN-γ, pela sua atividade citolítica ou pela ativação de células NK (GODFREY et al., 2000).. As. células T γδ também participam da produção de IFN-γ na resposta inata, visto que tais células reconhecem diretamente pequenas porções protéicas da micobactéria, independente da célula apresentadora de antígeno (VAN CREVEL; OTTENHOFF;.

(26) VAN DER MEER, 2002; BOOM et al., 2003). Também já foi relatada a atividade citolítica das células T γδ na presença de antígenos micobacterianos, como demonstrado por Munk et al. em 1990. O M. tuberculosis é um exemplo clássico de patógeno cuja resposta protetora é dependente de uma resposta imune eficiente.. O controle imunológico dessa. infecção é baseado na resposta imune celular, mediada predominantemente por células CD4 Th1.. A produção de IL-12 por macrófagos e células dendríticas é. induzida após a fagocitose do bacilo por essas células e direciona o desenvolvimento da resposta Th1 com produção de IFN-γ, que é a citocina crucial para o controle da infecção (LADEL et al., 1997; HENDERSON; WATKINS; FLYNN, 1997). Na tuberculose, o IFN-γ é produzido por linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+ , células NK bem como por macrófagos (ORME et al., 1992; 1993; BARNES et al., 1993; FENTON et al., 1997; LYADOVA et al., 1998; LALVANI et al., 1998; SCHLUGER; ROM, 1998; SERBINA; FLYNN, 1999).. O papel fundamental dessa citocina na. resposta imune ao M. tuberculosis foi demonstrado em vários trabalhos. Cooper et al., em 1993, demonstraram que camundongos “knockout” para gene do IFN-γ são altamente susceptíveis à infecção pelo M. tuberculosis (FLYNN et al., 1993; NEWPORT et al., 1996; OTTENHOFF; KUMARARATNE; CASANOVA, 1998). O mesmo foi observado em indivíduos com deficiência em genes do IFN-γ ou de seu receptor, os quais são mais susceptíveis a infecções micobacterianas, incluindo o M. tuberculosis (JOUANGUY et al., 1997; DORMAN; HOLLAND, 1998). A função principal do IFN-γ é ativar o macrófago infectado e dessa maneira, induzir que esta célula exerça seu papel microbicida, pela ativação da produção de reativos de oxigênio e de nitrogênio, necessários para a eliminação do bacilo (SCHLUGER; ROM, 1998; FLYNN; CHAN, 2001). Além disso, o IFN-γ estimula o macrófago a liberar TNF-α, citocina importante para a formação do granuloma e para o controle da extensão da infecção (FLYNN et al., 1995; ROACH et al., 2002)..

(27) NK cell. Figura 5- Mecanismos celulares envolvidos na resposta imune da tuberculose. A figura representa a participação das células T CD4+, T CD8+, NK e Tγδ na secreção de IFN-γ, citocina que participa na ativação do macrófago infectado. A figura também demonstra a atividade citolítica das células T CD8+, células NK e células Tγδ. Fonte: KAUFFMAN, 2001. Durante a tuberculose ativa, apesar de evidências de uma ativação crônica da resposta imune contra o bacilo serem observadas, paradoxalmente, também encontramos uma supressão desta resposta. Alguns autores demonstraram uma ativação da resposta imune, através da presença de hipergamaglobulinemia policlonal, aumento de níveis séricos de TNF-α e um aumento na expressão de marcadores de ativação nas células T circulantes, como o HLA-DR (WALLIS; ELLNER, 1994; KAPLAN; FREEDMAN, 1996; VANHAM et al., 1996).. Por outro. lado, e apesar das evidências de ativação das células T e monócitos, também é.

(28) amplamente descrita na literatura a diminuição da produção de citocinas características da resposta imune Th1, tais como IFN-γ e IL-2, normalmente acompanhadas por uma aumento de IL-10 e TGF-β (TOOSSI; KLEINHENZ; ELLNER, 1986; HIRSCH et al., 1996; VANHAM et al., 1997; ELLNER, 1997; TORRES et al., 1998; HIRSCH et al., 1999). Esta supressão foi demonstrada experimentalmente, utilizando-se células obtidas de pacientes com tuberculose pulmonar as quais, após estimulação com antígenos micobacterianos. (derivado. protéico. purificado. –. PPD. e. antígeno. 30Kd),. apresentavam uma diminuição na produção de IL-2 e IFN-γ, comparados aos níveis produzidos por células de indivíduos saudáveis. ensaios. demonstraram. que,. nos. pacientes. Adicionalmente, estes mesmos com. tuberculose,. a. resposta. linfoproliferativa antígeno-específica era menor em relação à observada em indivíduos saudáveis (TOOSSI; KLEINHENZ; ELLNER, 1986; TORRES et al., 1994; HIRSCH et al., 1996; TORRES et al., 1998). A supressão da função das células T na tuberculose, evidenciada pela diminuição da produção de citocinas Th1 frente a estímulos específicos, pode estar relacionada a um aumento na produção de citocinas imunossupressoras, como IL-10 e TGF-β (HIRSCH et al., 1996; GONG et al., 1996; HIRSCH et al., 1997; DE LA BARRERA et al, 2004). A produção destas citocinas pode, então, resultar em um efeito supressor, pelo controle da proliferação e diferenciação celular e pela diminuição das funções efetoras das células imunes antígeno-específicas. Recentemente, foi descrita a existência de uma subpopulação das células T CD4 que expressam altos níveis de receptores CD25, as quais foram denominadas CD4+CD25HIGH ou células T reguladoras. Estas células apresentam propriedades de regulação da resposta imune e ocorrem naturalmente em camundongos e em seres humanos. Em indivíduos saudáveis, as células CD4+CD25HIGH representam de 5% a 10% do total de células T CD4+ circulantes (BAECHER-ALLAN et al, 2001; OLDENHOVE et al., 2003; AKBAR et al., 2003; SAKAGUCHI, 2003; BLUESTONE; ABBAS, 2003).. Evidências apontam uma função primordial das células T. reguladoras in vivo: a manutenção da tolerância a antígenos próprios, que se dá.

(29) pela modulação da atividade de células T auto-reativas, o que causaria resposta auto-imune caso não houvesse modulação (BAECHER-ALLAN et al., 2001; SAKAGUCHI et al., 2001).. Figura 6 – Participação das células T reguladoras na modulação de respostas efetoras de células T CD4+ (Th1 e Th2), T CD8+ e neutrófilos. Fonte: MILLS, 2004.

(30) Os mecanismos de modulação da resposta imune empregados pelas células T reguladoras ainda não são completamente conhecidos. Entretanto, existem evidências de que a função imunossupressora destas células in vitro seja dependente de uma sinalização via CTLA-4 (antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos), molécula presente nas células T reguladoras, que inibe o sinal coestimulatório nas células T efetoras (READ; MALMSTROM; POWRIE, 2000). Adicionalmente,. outros. estudos. demonstram. a. participação. de. citocinas. supressoras, como IL-10 e TGF-β nos mecanismos reguladores destas células (READ; MALMSTROM; POWRIE, 2000; NAKAMURA; KITANI; STROBER, 2001; BELKAID et al., 2002). Os estudos realizados inicialmente demonstraram a participação destas células nos mecanismos de modulação de respostas auto-imunes (BAECHER-ALLAN et al., 2001; MONTERO et al., 2004; EARLE et al., 2005). Além disso, a participação das células T reguladoras nas doenças infecciosas, também vem sendo evidenciada (MILLS, 2004). Utilizando um modelo murino de infecção por Leishmania major foi demonstrado um acúmulo de células T reguladoras na derme (sítio da infecção), com conseqüente supressão da atividade das células T CD4+ efetoras em eliminar o parasita do local da infecção.. Os autores demonstram, neste trabalho, que os. mecanismos responsáveis pela supressão mediada pelas células T reguladoras, incluem mecanismos dependentes e independentes de IL-10 (BELKAID et al., 2002). Em um trabalho publicado recentemente pelo nosso grupo, observamos que o número de células circulantes com fenótipo CD4+CD25HIGH em pacientes portadores de tuberculose era 3 vezes maior do que o observado em indivíduos saudáveis. Além disso, para avaliar a participação das células reguladoras na modulação da resposta imune, analisamos a produção de IFN-γ em cultura na presença e na ausência de células reguladoras. O resultado foi que, com a depleção das células reguladoras, a produção de IFN-γ pelas células mononucleares de sangue periférico era aumentada (RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2006).. Corroborando esses. resultados, Guyot-Revol et al. (2006) também demonstraram um aumento do número de células T reguladoras nos pacientes portadores de tuberculose e.

(31) sugeriram a participação destas células na supressão da resposta Th1 observada durante esta infecção. Dentre os possíveis mecanismos responsáveis pela supressão da resposta imune, observada na tuberculose, destacamos também a influência de uma resposta Th2 pré-existente, modulando negativamente a resposta Th1 necessária para o controle da infecção.. Assim, a pré-existência de helmintos intestinais, patógenos. sabidamente indutores de uma forte resposta imune do tipo Th2, em indivíduos portadores de M. tuberculosis, pode ser um dos mecanismos responsáveis pela supressão imune na tuberculose.. Em um artigo de revisão publicado em 1999,. Bentwich et al. postularam que as infecções helmínticas poderiam afetar prejudicialmente a resposta imune contra o HIV e o M. tuberculosis, contribuindo dessa forma a uma rápida evolução para a AIDS e para as formas mais graves da tuberculose.. 1.4 As helmintíases intestinais Os helmintos intestinais são causa de significativa morbidade em humanos. Estimase que mais de 1 bilhão de pessoas no mundo estão infectadas por pelo menos uma espécie de helminto (BETHONY et al., 2006). Em seu artigo de revisão publicado em 2003, Awasthi et al. postularam que, em países em desenvolvimento, é mais comum estar infectado do que não estar infectado. A prevalência das infecções helmínticas no Brasil e no Espírito Santo não é completamente conhecida, visto que esta doença não é de notificação obrigatória. Os dados que indicam a prevalência da infecção por helmintos são obtidos de estudos realizados isoladamente. Em um estudo conduzido com amostras de uma população urbana de São Paulo, foi observada uma prevalência de 24% de infecção pelo A. lumbricoides (FERREIRA; FERREIRA; NOGUEIRA, 1991). Tavares-Dias e Grandini (1999) em um estudo no interior de São Paulo também observaram uma prevalência elevada de enteroparasitoses, incluindo 13,9% de positividade para o A. lumbricoides, 8,3% de S. stercoralis e 3,7% de T. trichiura. Um levantamento da.

(32) positividade de 942 exames de fezes realizados pelo Laboratório de Parasitologia do Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes (HUCAM), em pacientes internados nesta unidade, no período de 1996 a 1998, mostrou uma prevalência de 24% de positividade para os nematóides intestinais (dados não publicados).. Figura 7 – Mapa-mundi indicando as regiões onde os helmintos intestinais são considerados problemas de saúde pública (regiões indicadas em vermelho). Fonte: http:// vega.soi.city.ac.uk/~dk708/images/who_helminths.gif.

(33) 1.5 Resposta imune contra helmintos A resposta imune típica induzida pelos helmintos intestinais é dependente de células Th2, resposta que envolve produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, assim como a produção de IgE e a mobilização e expansão de células efetoras específicas, como mastócitos, eosinófilos e basófilos.. A polarização da resposta imune para uma. resposta tipo Th2 influencia negativamente a resposta do tipo Th1, inibindo a proteção imunológica do hospedeiro frente a patógenos cuja resposta protetora é Th1 dependente (ABBAS; MURPHY; SHER, 1996). As células Th2 produzem IL-10, o qual age sobre os macrófagos inibindo a ativação de resposta Th1 e bloqueando a síntese de IL-12 pelo macrófago. Adicionalmente, as células Th2 produzem TGF-β, o qual atua diretamente sobre as células Th1, impedindo a sua proliferação (JANEWAY et al., 2002).. Figura 8 – Produção de citocinas pelas células CD4 Th1 e Th2. No quadro à esquerda está representada a secreção de IL-10 e TGF-β pelas células Th2, que inibem a ativação e a proliferação de células Th1. O quadro, à direita, ilustra a produção de IFN-γ pelas células Th1, que atua inibindo a proliferação de células Th2. Fonte: JANEWAY et al., 2002.

(34) 1.6 Efeito da infecção helmíntica na resposta Th1 A modulação da resposta imune frente a patógenos, induzida por infecções helmínticas, vem sendo demonstrada por vários autores. Borkow et al. (2000), em estudo de pacientes com infecções helmínticas crônicas, sugeriram que a ativação persistente do sistema imune pelos helmintos está associada a uma diminuição na transdução. de. sinais. com. conseqüente. diminuição. da. resposta. imune. (hiporesponsividade) e anergia. Esta hiporesponsividade é manifestada por prejuízo na transdução de sinais na célula T, diminuição na expressão de CD28 (receptor coestimulatório) com concomitante aumento na expressão de CTLA-4, diminuição da secreção de quimiocinas e diminuição de resposta imune do tipo tardia.. A. modulação postulada pelos autores poderia, inclusive, influenciar negativamente a resposta imune específica frente a uma vacina. Também, em estudo de pacientes cronicamente infectados por helmintos intestinais, foi demonstrada uma diminuição no número de células T CD4+ e aumento de células T CD8+ circulantes e estas células apresentavam um alto nível de ativação. Estes achados sugerem que uma infecção helmíntica crônica tem efeito importante e prolongado no sistema imune do hospedeiro (KALINKOVICH et al., 1998). Além da estimulação de uma resposta Th2 vigorosa, alguns estudos realizados demonstraram que as infecções helmínticas podem induzir células T reguladoras, que. produzem. citocinas. reguladoras. e. suprimem. respostas. Th1. e,. conseqüentemente, interferem na ativação das células T efetoras (KING et al., 1993; DOETZE et al., 2000; SATOGUINA et al., 2002; MCKEE; PEARCE, 2004).. Em. 2004, em um interessante estudo experimental, McKee e Pearce demonstraram que células CD4+CD25+ de camundongos infectados com Schistosoma mansoni produziam IL-10, inibiam a produção de desenvolvimento de resposta Th1 pela diminuição na secreção de IL-12, e suprimiam proliferação de células T CD4+ após a estimulação com antígeno do ovo do S. mansoni..

(35) Nesse contexto, nosso grupo tem avaliado a importância da associação entre as helmintíases intestinais e as doenças micobacterianas, incluindo a hanseníase e a tuberculose.. Em um trabalho, onde foram realizados exames parasitológicos de. fezes em indivíduos portadores de hanseníase com diferentes formas clínicas, foi observado que 30% dos indivíduos avaliados também eram portadores de infecção helmíntica.. Os resultados demonstraram ainda que a freqüência de helmintos. intestinais era significativamente maior entre os pacientes com as formas multibacilares da doença (38,3%) em relação aos pacientes com formas paucibacilares (24,6%), sugerindo que a infecção por nematóides intestinais pode aumentar o risco para uma forma mais grave da hanseníase (DINIZ et al., 2001). Em um outro estudo conduzido por nosso grupo em indivíduos portadores de hanseníase, infectados ou não por helmintos intestinais, onde avaliamos a produção de citocinas por células mononucleares, observamos que pacientes portadores de hanseníase co-infectados com helmintos intestinais apresentavam uma menor produção de IFN-γ, quando comparados a pacientes portadores de hanseníase sem infecção helmíntica. Por outro lado, pacientes infectados por M. leprae e helmintos apresentavam uma maior produção de IL-4 e IL-10 em relação aos pacientes infectados apenas pela micobactéria.. Neste mesmo estudo, também foram. avaliados os níveis de IL-5, entretanto não foi observada diferença significativa entre os dois grupos estudados (DINIZ et al., em fase de pré-publicação). Para avaliar se, da mesma forma que observada na hanseníase, a tuberculose poderia estar associada à presença de helmintos intestinais, um outro estudo foi conduzido por nosso grupo (TRISTÃO-SÁ et al., 2002). Os resultados indicaram uma associação positiva entre a tuberculose e a infecção helmíntica. Os dados demonstraram ainda uma prevalência significativamente maior de nematóides intestinais em pacientes com tuberculose pulmonar (57,8%) em relação ao grupo controle (20,9%), sendo S. stercoralis o helminto mais prevalente (24,5%) encontrado entre todos os pacientes portadores de tuberculose avaliados neste estudo..

(36) Em suma, a avaliação dos trabalhos já realizados, indica a existência de uma forte associação entre infecção helmíntica e doenças micobacterianas, incluindo a tuberculose.. Essa associação entre infecção helmíntica e tuberculose torna-se. relevante quando consideramos a situação de países em desenvolvimento, onde ambas as infecções apresentam prevalências elevadas. Apesar de não conclusivos, alguns estudos indicam que a presença de patógenos, que fundamentalmente induzem uma resposta imune tipo Th2 como os helmintos, pode afetar a habilidade do hospedeiro em organizar uma resposta imune apropriada para o controle de uma nova infecção, cuja resposta imune é Th1 dependente.. Além disso, existem. evidências que a infecção por helmintos podem induzir células T reguladoras, que modulam respostas imunes importantes no controle de outras infecções. Baseada nestas evidências, a proposta do nosso estudo foi avaliar a resposta imune celular em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais..

(37) Objetivos.

(38) 2 OBJETIVOS. 2.1 Objetivo geral Avaliar o impacto da presença de helmintos intestinais na resposta imune celular contra o Mycobacterium tuberculosis em pacientes com tuberculose pulmonar.. 2.2 Objetivos específicos. •. Avaliar o número de linfócitos, subpopulações de linfócitos e células T reguladoras em pacientes portadores de tuberculose e relacionar com o número de células em indivíduos clinicamente saudáveis;. •. Avaliar o número de linfócitos, subpopulações de linfócitos e células T reguladoras em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais e relacionar com o número de células em pacientes portadores de tuberculose não infectados por helmintos intestinais;. •. Avaliar a produção de citocinas em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais;. •. Avaliar a freqüência de células T reguladora nos pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais;. •. Correlacionar os parâmetros imunológicos avaliados com achados clínicos e radiográficos nos pacientes portadores de tuberculose coinfectados e não infectados por helmintos intestinais..

(39) Material e Métodos.

(40) 3 MATERIAL E MÉTODOS. 3.1 Modelo de estudo O presente trabalho é um estudo descritivo, longitudinal, para avaliação do impacto da presença de helmintos intestinais nas características imunológicas de pacientes portadores de tuberculose pulmonar.. O estudo foi conduzido no laboratório de. Imunologia Celular e Molecular do Núcleo de Doenças Infecciosas, localizado no Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.. 3.2 Considerações éticas Os dados utilizados neste trabalho foram obtidos durante a realização do projeto intitulado. “Análise. do. Potencial. Preditivo. de. Marcadores. Imunológicos. e. Microbiológicos na Avaliação da Resposta Terapêutica Anti-Tuberculose em Pacientes Adultos HIV-negativos com Baciloscopia Positiva para Tuberculose Pulmonar”, conduzido no Núcleo de Doenças Infecciosas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. Tal projeto obteve aprovação no Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), parecer nº 919/2000 e no Comitê de Ética em Pesquisa do Centro Biomédico (CEP local) memo nº 006/99. Todos os indivíduos foram esclarecidos quanto ao estudo e, aqueles que concordaram em participar, assinaram o Termo de Consentimento.. 3.3 Caracterização dos indivíduos do estudo No período de junho de 2000 a março de 2002 foram coletadas amostras de sangue e fezes de 40 pacientes portadores de tuberculose pulmonar atendidos no Centro de Pesquisa Clínica do Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes (HUCAM), Vitória - Espírito Santo. Como critério de inclusão no estudo, os pacientes deveriam apresentar:.

(41) a). idade entre 18 e 60 anos,. b). baciloscopia e cultura de escarro positivas para M. tuberculosis,. c). sorologia negativa para HIV,. d). ausência de história pregressa de tuberculose, e. e). não ter iniciado o tratamento com as drogas tuberculostáticas.. Também foram coletadas amostras de 25 indivíduos clinicamente saudáveis (grupo controle), utilizadas como parâmetro comparativo para as análises. Após o diagnóstico clínico e laboratorial, os pacientes portadores de tuberculose iniciaram o tratamento com as drogas tuberculostáticas do Esquema I, preconizado pelo Ministério da Saúde.. Este esquema de tratamento tem uma duração de 6. meses, sendo na fase inicial (2 primeiros meses), composto por doses diárias de isoniazida, rifampicina e pirazinamida, seguido de uma segunda fase (4 meses restantes), com doses diárias de isoniazida e rifampicina (CASTELO FILHO et al., 2004). Os pacientes do estudo também foram submetidos a exame radiológico torácico e os resultados foram avaliados pelo Dr. Valdério do Valle Dettoni, médico pneumologista do Ambulatório de Tisiologia do HUCAM. Considerando o aspecto radiográfico das lesões pulmonares no raio-X de tórax, os pacientes portadores de tuberculose foram classificados em 3 diferentes categorias de acordo com o grau de extensão da doença: mínima, moderada ou avançada (CLASSIFICATION OF PULMONARY TUBERCULOSIS, 1969). Os critérios para determinação da extensão da doença são descritos a seguir: a). doença mínima: caracterizada pela presença de infiltrações de densidade. leve a moderada e nenhuma cavidade deve estar presente.. As lesões podem. envolver uma pequena porção de ambos os pulmões, porém o volume total de infiltrações deve ser o volume de um pulmão; b). doença moderada: as lesões podem estar presentes em ambos os pulmões,. mas a extensão total destas não deve ser maior que o volume total de um pulmão ou o volume equivalente de ambos. Caso elas se apresentem em formas densas e.

(42) confluentes, não devem envolver mais do que 1/3 do volume de um pulmão, sendo que o diâmetro total da cavidade (se presente) não deve ser maior que 4 cm; c). doença avançada: lesões mais extensas do que as descritas na doença. moderada. O exame radiográfico foi repetido no fim do tratamento anti-tuberculose e os resultados foram comparados aos obtidos no início do tratamento. Para avaliar a prevalência de helmintíases intestinais nos pacientes portadores de tuberculose e o impacto da infecção helmíntica na tuberculose, foram realizados exames parasitológicos de fezes em todos os indivíduos do estudo.. Para o. diagnóstico foram utilizadas 3 amostras de fezes coletadas em dias consecutivos. Foram empregados os métodos de sedimentação (realizado no Laboratório Henrique Tommasi Neto Análises Clínicas Ltda) e Baerman-Moraes (realizado no Laboratório de Helmintologia do Núcleo de Doenças Infecciosas). Todos os pacientes com diagnóstico positivo para helmintíase intestinal foram tratados com drogas anti-helmínticas apropriadas para cada tipo de helminto intestinal encontrado.. Os pacientes portadores de S. stercoralis receberam. tratamento com tiabendazol, ao passo que os portadores de infecção pelo T. trichiura ou pelo A. lumbricoides foram tratados com mebendazol. Com o resultado do exame parasitológico de fezes, os pacientes portadores de tuberculose foram divididos em dois grupos: a) pacientes portadores de tuberculose co-infectados com helmintos intestinais, denominado grupo TB+Helmintos (n=11) e b) pacientes portadores de tuberculose sem infecção com helmintos intestinais, denominado grupo TB (n=29).. Esta subdivisão dos pacientes portadores de. tuberculose em dois grupos foi utilizada para comparação de parâmetros imunológicos entre os grupos TB e TB+Helminto em um segundo momento do estudo..

(43) 3.4 Avaliação hematológica Todos os indivíduos foram submetidos à avaliação hematológica no início do estudo. A avaliação hematológica consistiu na realização de hemograma para contagem global e diferencial de leucócitos, e foram realizadas no Laboratório Henrique Tommasi Netto Análises Clínicas Ltda.. Para este foram utilizadas amostras de. sangue coletadas com anticoagulante EDTA (BD Vacutainer) e os parâmetros hematológicos avaliados em contador automático de células (Coulter STKS).. 3.5 Avaliação imunofenotípica por citometria de fluxo dos leucócitos do sangue periférico Os ensaios de imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico foram realizados segundo o protocolo proposto pelo fabricante (Becton Dickinson), modificado conforme descrito a seguir. Em tubos de poliestireno de 12 x 75 mm foram adicionados 5µl do anticorpo monoclonal específico para o marcador de superfície celular de interesse, conjugado com fluorocromos distintos (Tabela 1). Para cada análise foram utilizados 100µl de sangue periférico coletado a vácuo em tubos de 5 ml contendo EDTA (BD Vacutainer). Após homogeneização em vórtex, as amostras foram incubadas por 15 minutos, a 4ºC e ao abrigo da luz. Após o período de incubação, as amostras foram submetidas à lise dos eritrócitos, utilizando 2 ml de solução de lise comercial (FACS Lysing Solution – Becton Dickinson) diluída 10 vezes em água destilada. Após nova homogeneização em vórtex, as amostras foram incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente e, então, submetidas à centrifugação (400 g, 10 minutos, temperatura ambiente).. O sobrenadante foi descartado e as amostras foram. lavadas, utilizando 2 ml de tampão fosfato (0,015M pH 7,4), nas mesmas condições de centrifugação descritas anteriormente. Em seguida as amostras foram fixadas, utilizando 300µl de solução fixadora (paraformaldeído 1%). Após um período de 15 minutos a 4ºC, a análise dos parâmetros fenotípicos das células, presentes em cada tubo, foi determinada com o auxílio do citômetro de fluxo (FACSort -. Becton.

(44) Dickinson), utilizando o programa CELLQuestTM para aquisição e análise dos dados, empregando diferentes estratégias de análises, como descrito no item 3.6 - Análise dos resultados obtidos pela citometria de fluxo. Tabela 1– Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de populações, subpopulações celulares e moléculas de superfície.. Anticorpos. Fluorocromo. Clone. Anti-IgG1. PE. X40. Anti-CD3. PerCP, PE. SK7. Anti-CD4. FITC. SK3. Anti-CD8. PerCP. SK1. Anti-CD16. PE. B73.1. Anti-CD19. FITC. 4G7. Anti-CD25. PE. 2A3. Anti-CD56. PE. My31.

(45) 3.6 Análise dos resultados obtidos pela citometria de fluxo Os dados obtidos através da imunofenotipagem dos leucócitos de sangue periférico foram analisados utilizando-se estratégias diferentes, dependendo do fenótipo celular analisado.. Assim, empregando os recursos múltiplos do programa. CELLQuestTM, foram adotadas diferentes estratégias para a análise fenotípica, como descrito a seguir:. 3.6.1 Análise convencional Esse tipo de análise consistiu na seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos morfométricos, através de gráficos de distribuição pontual de tamanho (forward scatter - FSC) versus granulosidade (side scatter – SSC) (FIGURA 9A). Após a seleção da região de interesse (R1), o percentual de subpopulações celulares fluorescentes, dentro da população selecionada, foi obtido em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de fluorescência (FL), incluindo as modalidades FL1 versus FL2, FL2 versus FL3 e FL1 versus FL3 (FIGURA 9B).. R1 Tamanho. B. R1. FL-2. Granulosidade. A. FL-1. Figura 9 – Seqüência dos procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de populações celulares por citometria de fluxo. A) Gráfico de distribuição pontual Tamanho versus Granulosidade utilizado para a seleção da população de interesse, nesse caso, os linfócitos – R1. B) Gráfico de distribuição puntual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o percentual das populações ou subpopulações celulares específicas em R1..