Dos 17 pares de iniciadores de mini-indels desenhados, 15 foram eficientes em suas amplificações ao serem utilizados individualmente. A ausência de amplificação de produto com esses dois pares de iniciadores provavelmente ocorreu devido ao mau desenho dos mesmos, ou a ocorrência de mutações ou deleções no sítio de anelamento desses iniciadores, não presentes nas amostras estudadas pelo dBNP. Para que estas indels sejam incorporadas num possível novo multiplex juntamente com as mini-indels do cromossomo X que não fizeram parte do multiplex desenvolvido nesta dissertação, sugere-se que estas duas indels tenham seus iniciadores redesenhados.
O desenvolvimento de um único multiplex com as 17 mini-indels do cromossomo X não foi possível, possivelmente devido à temperatura de anelamento utilizada na padronização do multiplex ou pela concentração de iniciadores usada. Entretanto conseguiu-se desenvolver um sistema para a co-amplificação de oito mini-indels. Com as sete mini-indels restantes (não incluindo as que não amplificaram individualmente) tentou-se construir um novo sistema para a co- amplificação, entretanto este teve que ser temporariamente abandonado devido à falta de tempo disponível para a conclusão da dissertação.
Pode-se constatar a eficiência do sistema de co-amplificação de oito mini- indels já que os eletroferogramas dos indivíduos genotipados apresentaram picos bem definidos e com alta intensidade, entretanto, notou-se que quando co- amplificados alguns locos passaram a apresentar a presença de picos relativos a fragmentos sem a adição de adenina (menos A) pela Taq polimerase (CLARK, 1988). A presença de fragmentos menos A pode ocorrer pela dificuldade de se obter um balanço adequado de reagentes quando da reação em multiplex. Para evitar a presença de fragmentos menos A, uma alternativa seria anexar uma seqüência “Pig Tail” a extremidade 5’ do iniciador reverso. Isso buscará a maximização da adição de Adenina sem a presença de molde pela Taq Polimerase (BROWNSTEIN et al., 1996) .
Os PICs iniciais calculados com os dados do NCBI para as oito mini-indels do cromossomo X ficaram entre 0,34 e 0,44 e os PICs calculados com os dados da população brasileira ficaram entre 0,31 e 0,44, não demonstrando diferenças. Os
valores de PIC são baixos, pois se tratam de marcadores bialélicos, logo, terão PICs menores do que marcadores multialélicos (EDELMAN et al., 2001; POETSCH et al., 2005; ASAMURA et al., 2006b; TURRINA et al., 2007).
Quando calculamos os MECsT iniciais para as oito indels selecionadas para constituir o multiplex, com os dados provenientes do NCBI, estes variaram entre 0,331 a 0,366, com um MECT cumulativo de 96,9% e os MECDs variaram de 0,210 a 0,241 com um MECD cumulativo de 87,27%. Os valores de MECsT calculados para as oito indels constituintes do multiplex, com os dados da população brasileira, estes variaram de 0,284 a 0,375 e foram responsáveis por um MECT cumulativo de 96,89%, já os valores de MECD para as mesmasvariou de 0,171 a 0,250 com um MECD cumulativo de 87,51%. Os valores de MEC para a população brasileira não apresentaram diferença quando comparados aos MEC calculados com os dados do NCBI. Quando simulamos uma situação em que todas as oito indels tivessem heterozigosidade máxima, ou seja, as freqüências de inserção e deleção fossem iguais a 0,5; o valor de MECT seria de 0,375 e o MECT cumulativo seria de 97,67%. Já o valor de MECD seria de 89,99%, valores não muito acima dos encontrados neste trabalho. Quando comparamos com o MECT calculado com apenas 4 X-STRs
(98,76%) (PEPINSKI et al., 2005) e com 8 X-STRs (99,99%) (TURRINA et al., 2007) comprovamos que os STRs são mais eficientes, mesmo em menor número e que para aumentarmos o valor do MEC são necessários mais locos.
Os PDM calculados para os dados do NCBI com as oito indels constituintes
do multiplex, variaram de 0,575 a 0,616 com um PDM cumulativo de 0,9993 e os PDH
variaram de 0,419 a 0,482 com um PDH cumulativo de 0,9922. Os PDM calculados
com os dados da população brasileira variaram de 0,509 a 0,625 e PDM cumulativo foi de 0,9993. O PDH variou de 0,342 a 0,500 com um PDH cumulativo de 0,9927.
Quando comparamos esses parâmetros com os X-STRs, observamos que com apenas 4 marcadores é possível encontrar PDM cumulativo (0,9997) e PDH cumulativo (0,9926) similares aos encontrados utilizando 8 mini-indels do cromossomo X (PEPINSKI et al., 2005) e com 8 X-STRs temos um PDM cumulativo (0,9999) e PDH cumulativo (0,9999) maiores do que os encontrados utilizando 8 mini indels do cromossomo X (PEPINSKI et al., 2007; TURRINA et al., 2007). Observando esses dados, as análises combinadas dessas oito mini-indels do cromossomo X, discutidas nessa dissertação, são uma boa ferramenta para análises
forenses, visando complementar a análise de outros marcadores que tenham se mostrado pouco eficientes nas amplificações com baixas concentrações de DNA.
A análise de variância molecular entre e dentro das populações, investigada utilizando o programa Arlequin 3.01 (EXCOFFIER et al., 1992), para as oito mini- indels do cromossomo X foi realizada entre as amostras regionais da população brasileira mostrando uma pequena, porém significativa diferença entre as regiões (Fst= 2,1% p=0,006). A análise de variância loco a loco, mostrou algumas das indels com valores de Fst significativos entre as populações brasileiras. Os resultados de Fst par a par entre as amostras regionais de brasileiros revelaram evidências de estruturação populacional significativas entre elas. Esta observação sugere que, em relação às mini-indels do cromossomo X aqui genotipadas, a amostra brasileira se comporta como uma amostra heterogênea. Esses resultados vão de encontro a outros resultados publicados sobre a população brasileira, que não encontraram nenhuma evidência de estruturação significativa entre as regiões brasileiras com a utilização de outros marcadores como: cromossomo Y (GRATTAPAGLIA et al., 2005; CARVALHO-SILVA et al., 2006; PEREIRA et al., 2006) e SNPs (ABREU, 2007). Um dos fatores que podem ter levado a esse resultado, pode ter sido a maneira de utilização dos dados para estes cálculos. Pelo fato dos homens serem hemizigotos para o cromossomo X e possuírem um haplótipo determinado, esses foram transformados em indivíduos homozigotos a fim de prosseguir com os cálculos no programa Arlequin 3.01 (EXCOFFIER et al., 2005). Esse resultado sugere a necessidade de se ter bancos de dados regionais ou utilizar a correção com o coeficiente de ancestralidade.
Embora os marcadores do cromossomo X estejam disponíveis para a utilização em testes de parentesco, esses têm sido empregados raramente na prática forense. Os marcadores autossômicos são especificamente eficientes na resolução de casos deficientes, contudo, uma demanda crescente para o uso dos marcadores do cromossomo X deve ser esperada (SZIBOR et al., 2003). Espera-se que a demanda para testes de parentesco, onde apenas parentes distantes estejam disponíveis para contribuir com informações genéticas, cresça, particularmente a partir do desejo de reunir famílias nos contextos de guerra e de migração, além da incorporação do uso dos marcadores do cromossomo X na identificação de corpos e ossadas de vítimas de guerra ou de desastres de massa. Deve-se chamar a
atenção de que algumas vezes os marcadores do cromossomo X são mais eficientes do que os cromossomos autossômicos, especialmente em casos que envolvam a paternidade de uma mulher ou a maternidade de um homem. Isso é refletido pelas fórmulas usadas para calcular a chance média de exclusão (MEC) para marcadores autossômicos e marcadores do cromossomo X. Se os marcadores possuem um conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) comparável, o MEC para o cromossomo X é maior do que para os marcadores autossômicos (SZIBOR, 2007). Ainda sobre o cromossomo X, a opção de utilização de produtos amplificados de tamanho menor, gerados a partir de marcadores do cromossomo X deve ser considerada, especialmente se restos de ossadas humanas estiverem sendo analisados, ou outras amostras de difícil análise (ASAMURA et al., 2006a).
Geralmente, para uma inclusão de paternidade, o IPC mínimo aceitado é de 100 ou maior (BUTLER, 2005). Nos estudos de caso analisados nesta dissertação, as mini-indels do cromossomo X mostraram-se muito úteis em sua complementação. Nos trios, se analisarmos apenas o IPC das mini-indels do X, veremos que este valor será insuficiente para um resultado conclusivo. Entretanto quando combinamos o IPC das mini-indels com o IPC dos autossômicos, temos um IPC alto suficiente para finalizar o caso. O mesmo acontece com os casos de post- mortem. É importante ressaltar que durante os estudos de casos Post Mortem, em um caso onde não ocorreu nenhuma exclusão categórica na utilização de STRs autossômicos, a análise de 8 mini-indels do cromossomo X foi capaz de detectar uma exclusão categórica. Mais uma vez corroborando a afirmação que este multiplex servirá como forma complementar de análise, principalmente em casos quando o IPC dos marcadores autossômicos não for alto o suficiente.
Quando se trata de amostras forenses, muitas vezes a amostra em questão apresenta-se em baixa qualidade e/ou quantidade, residindo aí o problema enfrentado. Algumas técnicas tentam contornar esse problema, como a utilização de mini-STRs, a aplicação da metodologia de LCN, a utilização de SNPs, a utilização da metodologia de WGA entre outras. Visando a utilização deste multiplex em análises forenses, este foi desenhando seguindo os mesmos critérios dos mini- STRs, logo o multiplex desenhado tornou-se um multiplex de mini-INDELS. Para testar a eficiência do mesmo em amostras com baixas quantidades foi realizado um
teste de sensibilidade. Esse teste demonstrou que o multiplex de oito mini-indels é sensível o suficiente para obter resultados de amostras com concentração de 100 pg numa reação de 12,5 L, o que o torna uma ferramenta a mais na análise de amostras com baixa quantidade de DNA. Esse resultado indica uma maior sensibilidade do que os kits comerciais que possuem uma sensibilidade de 0,25 pg numa reação de 25 L. Em geral, os iniciadores desenhados como “mini”, a fim de gerar um produto amplificado de tamanho menor, oferecem uma nova ferramenta para a recuperação de informações úteis das amostras degradadas. Entretanto, em alguns casos, picos de artefato podem surgir devido ao alto grau de degradação, assim como um imbalanço entre os picos (MARTÍN, 2006).
O aumento do número de ciclos de amplificação pode expandir a utilidade dos perfis de DNA em casos forenses. É desejável manter o número de ciclos de PCR no mínimo, ou estes irão aumentar a incidência de artefatos, podendo comprometer a qualidade do resultado. Foi demonstrado que com a utilização de 34 ciclos, houve um aumento de imbalanço entre os heterozigotos (GILL et al., 2000; GILL et al., 2007). Além disso, com o aumento de ciclos, também há uma maior incidência de contaminação da amostra. Quando utilizamos a metodologia de LCN em amostras degradadas, esta técnica mostrou-se realmente eficaz quando em combinação com as mini-indels do cromossomo X. Entretanto deve-se analisar esse resultado com cautela uma vez que as quantificações das amostras de DNA foram realizadas em gel de agarose, o que não proporciona uma precisão perfeita.
A utilização da metodologia de WGA para amplificação anterior a amplificação das mini-indels do cromossomo X mostrou-se ineficaz contrariando o resultado obtido no artigo de (BALLANTYNE et al., 2007). A quantificação das amostras utilizadas com essa metodologia de WGA também foi feita via gel de agarose, portanto deve-se analisar esse resultado com cautela, uma vez que esse tipo de quantificação não é tão preciso. Seria de extremo interesse se esses experimentos de LCN e WGA pudessem ser repetidos com uma técnica precisa de quantificação de DNA com PCR em tempo real.