Discussão

De alguns anos para cá tem sido observado que os maiores avanços na pesquisa com lectinas vegetais estão relacionados com as atividades antineoplásicas exibidas por lectinas de leguminosas (ORNTOFT; VESTERGAARD, 1999). No presente trabalho demonstrou-se que lectinas da subtribo Diocleinae podem atuar como agentes indutores da apoptose em células neoplásicas da linhagem A549.

Como visto anteriormente na seção de resultados, uma hora de contato prévio entre as células e as lectinas fluoresceinadas foi suficiente para que estas interagissem com a superfície das células e, em alguns casos, fossem até mesmo internalizadas. Muitos trabalhos mostram o efeito de lectinas vegetais sobre a apoptose de células neoplásicas, e alguns destes preocupam-se em determinar com exatidão, a localização destas no interior das células. Em 1980, Virtanen e colaboradores demonstraram que a lectina ConA interagiu com glicoproteínas da membrana de fibroblastos e foi internalizada para o citoplasma. Uma vez no interior da célula, a lectina se ligou, muito provavelmente, ao retículo endoplasmático. ConA conjugada a FITC ou rodamina tem sido utilizada comercialmente como ferramenta para localização do retículo endoplasmático em trabalhos que desejam apontar a localização subcelular correta de seus compostos testados (GREWAL et al., 2003).

Os dados do presente trabalho mostraram que as lectinas da Subtribo Diocleinae após interagirem com alguma glicoproteína ou glicolipídeo presente na superfície das células, foram internalizadas e concentraram-se em região próxima ao núcleo, muito provavelmente a do retículo endoplasmático. Essa observação foi confirmada quando utilizou-se marcador seletivo para o núcleo das células, e a parir da análise das imagens, determinou-se que as lectinas permanecem no citoplasma, não adentrando o núcleo. Boa parte da fluorescência foi vista também de maneira difusa no interior das células, sugerindo que outras estruturas subcelulares possam igualmente interagir com as lectinas. Chang e colaboradores em 2007 mostraram que ConA provavelmente acumula-se também nas mitocôndrias, visto que a membrana mitocondrial de células hepáticas tratadas com a lectina, tiveram sua permeabilidade alterada.

O fato das lectinas estudadas aqui terem interagido, atravessado a membrana e se acumulando no citoplasma das células neoplásicas pode relacioná-las com o possível processo de apoptose e/ou autofagia. Relatos na literatura mostraram que ConA, a primeira lectina de leguminosas a ser relatada, apresentou citotoxidade sobre células hepáticas mediada por mecanismos autofágicos, com comprometimento direto da via mitocondrial (CHANG et al.,

2007). Já se sabe que a autofagia pode ser caracterizada como um processo celular que ocorre em resposta ao estresse, e outras lectinas além da ConA tem sido relacionadas com o desenvolvimento dos mecanismos característicos da autofagia em células não-hepáticas (LIU et al., 2009d).

Recentemente foi demonstrado que a lectina de Polygonatum cyrtonema (PCL) induziu a autofagia e apoptose de células A375 através de uma via mitocondrial mediada por ROS–p38–p53 (Liu et al., 2009c). Os dados mostraram que nenhuma alteração da expressão gênica relativa de p53 de células A549 tratadas com as lectinas da subtribo Diocleinae foi encontrada. A proteína p53 é sem dúvida o supressor tumoral mais estudado e está envolvida na resposta das células a diversos tipos de estresses (LAPTENKO; PRIVES, 2006; CHUMAKOV, 2007).

Uma das formas de deflagrar a apoptose se dá a partir da perda da funcionalidade da membrana mitocondrial, com consequente liberação do citocromo c e formação da holoenzima juntamente com a procaspase 9 conhecida como apoptosoma (ADRAIN; MARTIN, 2009; CAIN, 2003; CZERSKI; NUÑEZ; 2004). No presente trabalho analisamos a expressão gênica de Bax, envolvido na apoptose da via mitocondrial, o qual codifica para uma proteína pro-apoptótica. Nenhum efeito importante foi visto nas células tratadas com lectinas, apesar da expressão aparecer um pouco elevada nas células tratadas com ConBr.

Outro gene analisado foi o que codifica para a BCL-2, proteína designadamente anti-apoptótica. Tanto Bax quanto Bad (outro produto pró-apoptótico) podem transitar entre as mitocôndrias e o citoplasma. A regulação de tal trânsito é feita, principalmente, por BCL-2, a qual passa a maior parte de seu tempo integrada à membrana mitocondrial. A literatura mostra que a lectina de Viscum album, a qual possui especificidade para N- acetilgalactosamina, induz a diminuição na expressão de BCL-2 (BUSSING et al., 1998). Aqui foi reportado que a expressão do gene BCL-2 encontra-se diminuída quando as células foram tratadas com as lectinas, principalmente após 6 horas de contato prévio. Apesar de Bax não ter sofrido alteração em sua expressão gênica, a condição de diminuição da expressão de BCL-2 é indicativa de sinalização para o desenvolvimento da apoptose pela via mitocondrial, visto que o que realmente é necessário para desencadear tal evento, é a relação entre a razão da expressão Bax e BCL-2.

De fato, isto foi observado quando a razão entre tais expressões gênicas foi calculada. Após 6 horas de contato prévio, as células tratadas com ConBr apresentaram razão Bax:BCL-2 de 2,5 vezes. Apesar de ConA não ter sido relacionada com a apoptose de hepatócitos no trabalho de Chang e colaboradores em 2007, aqui ela conseguiu induzir o

aumento na razão Bax:BCL-2 de até 3x nas células A549, aparecendo como um possível agente deflagrador da apoptose pela via mitocondrial. Apesar de ConA ter sido inicialmente relacionada com a autofagia, tal observação não contraria o que tem sido mostrado em experimentos mais recentes. Tem sido notado que a mesma lectina pode atuar tanto através da deflagração dos mecanismos de autofagia quanto pela apoptose (LIU et al., 2009b). De fato, acredita-se que os mecanismos que regulam a apoptose estejam intimamente relacionados com os que participam da regulação da autofagia, pois ambas as vias são reguladas pelos mesmos fatores; compartilham os mesmos componentes; os processos podem sobrepor-se; e não obstante, uma via pode regular e modificar a atividade da outra (LEVINE, 2007).

Em adição, os resultados da expressão gênica relativa da caspase 9 mostraram que as lectinas avaliadas conseguem induzir o aumento da expressão de tal proteína. A caspase 9 está diretamente envolvida com o mecanismo apoptótico deflagrado nas mitocôndrias, uma vez que trata-se do principal componente do apoptosoma, que juntamente com APAF-1 e o citocromo c, formam a caspase ativadora da procaspase 3, uma das caspases encarregadas de executar um aparato de eventos que culminam com a morte da célula.

Com relação à aplicabilidade das lectinas no tratamento de neoplasias, tem sido sugerido que o caráter de malignidade de uma célula está associado a alterações complexas no padrão de glicosilação (ARENAS et al., 1999; GORELIK et al., 2001). Assim sendo, este perfil de transformação da célula poderá servir, num futuro próximo, como alvo para terapias mais seletivas (MODY et al., 1995; WANG et al., 2000). A lectina ConA, por ser uma das mais estudadas, tem sido apontada como possível recurso no tratamento específico de alguns tumores invasivos. Porém, já foi relatada presença de anticorpos anti-ConA no soro de animais que receberam injeções repetidas de tal lectina (LOUIS et al., 2000). Uma estratégia para ultrapassar tal problema é efetuar a administração de lectinas relacionadas, as quais possuam efeitos similares (CHANG et al., 2007). Neste cenário, as lectinas da Subtribo Diocleinae aqui demonstradas poderão servir como potenciais ferramentas para o diagnóstico e/ou tratamento de neoplasias.

Em tempo, o presente trabalho objetivou a avaliação do potencial exercido pelas lectinas da subtribo Diocleinae na indução da apoptose. Fortes evidências apontam para o envolvimento da via mitocondrial.

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4 EFEITO DA LECTINA ISOLADA DE Bryothamnion seafortii SOBRE O PROCESSO CICATRICIAL