Resultados

As células da linhagem A549 são mostradas imediatamente antes de entrarem em contato com as lectinas (Figura 3.5a e b).

Figura 3.5 – (a) Células A549 observadas através de microscopia óptica em campo claro e com objetiva de contraste de fases. Notar a morfologia caraterística de células epiteliais. Observa-se inclusive formação de conexões intracelulares em algumas regiões do poço. Em (b) são mostradas tanto em alta quanto em baixa densidade.

(a)

(b)

Todas as lectinas testadas conseguiram interagir com as células A549 (Figuras 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 e 3.10). A figura 3.6 mostra claramente a interação das células com ConA- FITC. Observou-se que após 1 hora de contato prévio, a lectina demarcava os contornos celulares, permitindo acreditar que estivesse ancorada na membrana das células.

Figura 3.6 – Interação de ConA-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência. Observa-se que a lectina consegue interagir com os contornos celulares, porém com pouca ou nenhuma internalização.

Já ConBr-FITC além de interagir com a periferia da célula, como evidenciado por sua presença nos contornos celulares, após 1 hora de contato prévio, foi internalizada (Figura 3.7, p.51), exibindo perfil diferente de interação daquele de ConA. Observa-se que boa parte da lectina, após internalização, está disposta no interior do citoplasma.

ConBol-FITC apresentou perfil semelhante ao de ConBr, sendo também internalizada pelas células. Os pontos mais brilhantes no interior do citoplasma denotam alta concentração da lectina (Figura 3.8, p.51). O local de acúmulo não pôde ser determinado através da microscopia óptica.

Figura 3.7 – Interação de ConBr-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência. Observa-se que a lectina consegue interagir com os contornos celulares, sendo inclusive internalizada e permanecendo disposta no citoplasma da célula.

Fonte: Dados da pesquisa

Figura 3.8 – Interação de ConBol-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência. Nota-se que a lectina interage com a membrana celular e é internalizada.

As figuras 3.9 e 3.10 mostram, respectivamente, os resultados da interação de Cgran-FITC e CGL-FITC.

Figura 3.9 – Interação de Cgran-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência. A presença da lectina é caracterizada pela fluorescência ao redor das células.

Fonte: Dados da pesquisa

Figura 3.10 – Interação de CGL-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência. A intensidade da fluorescência é menor quando visualmente comparada a de ConBr-FITC ou ConBol-FITC.

Quando as células foram tratadas com Cgran-FITC, o resultado foi uma fraca marcação fluorescente (Figura 3.9, p. 52). Tal marcação não evidenciou tão fortemente os contornos celulares em comparação com as outras lectinas.

Já CGL-FITC, apesar de emitir visualmente um baixo nível de fluorescência, demonstrou ter interagido com as células, pois mesmo fracamente, permite a visualização dos contornos celulares. Assim como ConBr e ConBol, houve acúmulo intracitoplasmático de CGL-FITC (Figura 3.10, p. 52).

Para verificar se a interação ocorrida entre lectinas-FITC e células A549 era estabelecida via sítio lectínico, os mesmos experimentos foram realizados com os sítios lectínicos bloqueados pelo seu açúcar específico.

Após aquisição das imagens das lectinas bloqueadas, notou-se que nenhuma delas apresentou qualquer fluorescência (dados não mostrados). Igualmente, nenhuma fluorescência intrínseca foi vista.

Apesar dos resultados apontarem para a internalização de algumas lectinas pelas células A549 e sua disposição na região central do citoplasma ser evidente, algumas dúvidas foram suscitadas com relação à possibilidade da internalização para o núcleo das células. No sentido de verificar se as lectinas eram transportadas para o núcleo, uma etapa experimental foi adicionada, utilizando-se apenas uma das lectinas que foram sabidamente internalizadas. A proteína escolhida foi a ConBol-FITC.

O ensaio foi realizado através da utilização de um marcador especifico para o núcleo celular (Figura 3.11, p.54). Logo em seguida, a imagem da lectina marcada com FITC (Figura 3.12, p.54) foi sobreposta à imagem fluorescente dos núcleos corados com o marcador seletivo (Figura 3.13, p.55).

Após análise das imagens em sobreposição foi possível concluir que a ConBol- FITC, uma das lectinas que de fato estava sendo internalizada, não adentrou o núcleo, ficando disposta numa região central da célula. Através da coloração do núcleo, constatou-se também que estes encontravam-se deslocados para a periferia das células. Não obstante, as células tratadas com as lectinas perderam algumas de suas características morfológicas, dentre as quais podemos citar a ausência de conexões intracelulares evidentes, fazendo com que ficassem mais esféricas em comparação com a morfologia mais esparsa adotada pelas células epiteliais.

Figura 3.11 – Fotomicrografia de fluorescência demonstrando o núcleo das células A549. Os núcleos estão corados de azul pelo método do Hoechst.

Fonte: Dados da pesquisa

Figura 3.12 – Fotomicrografia de fluorescência demonstrando o acúmulo intracitoplasmático de ConBol-FITC. As regiões em verde brilhante apresentam alta concentração da lectina.

Figura 3.13 – Sobreposição das imagens 2.11 e 2.12. Nota-se que a célula apresenta acúmulo da proteína marcada em região diferente da nuclear. O acúmulo se dá na região central da célula, enquanto o núcleo encontra-se voltado para um dos polos da mesma.

Fonte: Dados da pesquisa

Considerando que a lectina ConBol, assim como ConBr e CGL, interagiu com as células e foi consequentemente internalizada, seu papel na indução da apoptose foi analisado.

Figura 3.14 – Efeito de ConBol sobre a apoptose das células A549. As células com os núcleos corados em vermelho foram incapazes de excluir o iodeto de propídio (PI), caracterizando o evento apoptótico.

Os resultados sugerem que as células tratadas com ConBol (Figura 3.14, p.55), quando comparadas ao controle negativo (Figura 3.15), apresentaram alto índice de apoptose.

Figura 3.15 – Efeito do controle negativo do experimento envolvendo ConBol e células A549. As células com os núcleos corados em vermelho foram incapazes de excluir o iodeto de propídio (PI), caracterizando o evento apoptótico.

Fonte: Dados da pesquisa

Na tentativa de caracterizar de maneira mais afinca o efeito das lectinas da Subtribo Diocleinae sobre as células A549, ensaios de expressão relativa de genes envolvidos no processo apoptótico foram realizados. Os genes avaliados estão listados na tabela 3.2 (p.48).

Os resultados mostraram que a expressão de alguns genes diretamente relacionados com o processo apoptótico não foi alterada, como visto para a expressão do gene supressor de tumores p53 (Figura 3.16, p. 57). Um leve aumento ocorreu na expressão do referido gene nas células tratadas com ConBr 32 µg/mL (após 1 hora de tratamento). Porém, tal aumento não foi estatisticamente significante quando comparado ao controle.

Figura 3.16 – Expressão relativa do gene p53 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA. A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Observa-se leve aumento no grupo ConBr de 1 h, porém sem significância estatística.

Fonte: Dados da pesquisa

A expressão relativa do gene pro-apoptótico Bax, assim como p53, permaneceu inalterada quando comparada a do controle negativo (Figura 3.17). Um leve aumento ocorreu quando a célula foi tratada com ConBr 32 µg/mL. Porém, sem qualquer significância estatística.

Figura 3.17 – Expressão relativa do gene Bax nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA. A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Observa-se leve aumento no grupo ConBr de 1 h, porém sem significância estatística.

Fonte: Dados da pesquisa

Além de Bax, a expressão relativa do gene anti-apoptótico BCL-2 foi igualmente avaliada (Figura 3.18, p. 58).

Figura 3.18 – Expressão relativa do gene BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA. A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Os níveis de expressão foram diminuídos após 6 horas de tratamento para todos os testes.

Fonte: Dados da pesquisa

Os dados mostraram que os níveis de expressão foram diminuídos após o tratamento com as lectinas em ambas as concentrações testadas, sendo significativamente estatísticos após 6 e 12 horas de tratamento (Figura 3.18).

Para tentar caracterizar melhor o papel de Bax e BCL-2 na apoptose das células A549, construiu-se um gráfico que relacionasse o nível de expressão dos dois genes (Figuras 3.19a, b e c).

Figura 3.19 (a) – Razão da expressão relativa de Bax e BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA. A verificação foi realizada após 1horas de contato prévio entre lectinas e células. Observa-se que a maior razão é verificada no grupo ConBr (32 µg/mL) 

(b) Razão da expressão relativa de Bax e BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA. A verificação foi realizada após 6 horas de contato prévio entre lectinas e células. Observa-se que a maior razão é verificada no grupo tratado por ConBol.

Fonte: Dados da pesquisa

(c) Razão da expressão relativa de Bax e BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA. A verificação foi realizada após 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Observa-se que a maior razão é verificada no grupo tratado por ConA.

Fonte: Dados da pesquisa

A figura 3.19a (p.58) mostra que a razão da expressão entre Bax e BCL-2 foi maior quando as células foram tratadas com ConBr (32 µg/mL). O inverso ocorreu na maior dose de ConA, onde o gene anti-apoptótico foi mais expresso do que o pró-apoptótico.

Após 6 horas de contato prévio, a expressão de Bax nos grupos tratados pelas lectinas foi sempre maior do que a de BCL-2. ConBol foi a que apresentou maior razão entre

Bax e BCL-2 (2,5 vezes). Os controles negativos permaneceram com a expressão de BCL-2 sendo mais proeminente.

Efeito semelhante foi visto após 12 horas de contato prévio. Porém o grupo que apresentou maior razão entre Bax e BCL-2 foi o tratado por ConA (3 vezes). Assim como descrito na página anterior, a expressão de BCL-2 foi mais proeminente no controle negativo.

Por fim, estudou-se também a expressão do gene da caspase 9. A parir da análise dos resultados foi possível observar que a expressão foi aumentada em todos os grupos tratados com lectinas, principalmente após 12 horas de contato (Figura 3.20), como evidenciado pelo grupo tratado por ConA (32 µg/mL), visto que a expressão quase triplicou.

Figura 3.20 – Expressão relativa da Caspase 9 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA. A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Os níveis de expressão foram aumentados principalmente após 12 horas de tratamento para todos os testes.