Neste ensaio laboratorial foram utilizados ratos fêmea (Rattus norvegicus) da estirpe Sprague-Dawley. Estes animais são os mais frequentemente utilizados em ensaios de carcinogénese da mama (Russo e Russo, 2000;Thompson et al., 2000), não só devido às semelhanças histológicas que apresentam relativamente ao tecido mamário da mulher, como também devido à sua fácil manipulação e manutenção em laboratório, ao vasto conhecimento que se tem da espécie e à facilidade de indução do desenvolvimento de neoplasias nas glândulas mamárias destes animais.
Os animais dos grupos MNU sedentário e MNU exercitado receberam uma administração intraperitoneal do agente carcinogénico MNU. Este agente carcinogé nico é internacionalmente reconhecido para o estudo deste tipo de cancro, pois as lesões mamárias induzidas são semelhantes às lesões encontradas em humanos (Thompson, 2011). A via de administração utilizada é a que confere maior fiabilidade, sendo também a mais rápida e simples de executar (Hlawatsch et al., 2002).Quanto à dose administrada e à idade de administração, foram baseadas em estudos previamente realizados por outros investigadores (Gullino et al., 1975; McCormick et al., 1981; Thompson et al., 1983). Gullino et al. (1975) testaram inicialmente a administração da MNU em três injeções intravenosas com intervalos de um mês entre administrações, sendo que a primeira dose seria administrada entre os 50 e os 55 dias de idade dos animais. Posteriorme nte McCormick et al. (1981) concluíram que uma única injeção intravenosa seria suficie nte para induzir o desenvolvimento de carcinomas mamários, administrando a MNU ao animal com 50 dias de idade. Por sua vez, Thompson et al. (1983) recorreu à administração subcutânea em animais com 50 dias de idade, com uma concentração de 50 mg MNU/kg, durante um período de ensaio de 180 dias, demonstrando eficácia no desenvolvimento de neoplasias.
A divisão dos animais em dois grupos (sedentário e exercitado) teve como objetivo verificar e comparar as possíveis alterações decorrentes da prática de exercício físico no número de neoplasias desenvolvidas, no tipo de neoplasia, no potencial angiogénico das neoplasias e na DMV. De realçar que este protocolo de exercício físico com a duração de 35 semanas após a administração do agente carcinogénico foi o mais longo realizado até à data num modelo animal de cancro da mama.
Segundo Shepard (1990), o exercício físico tem influência no combate ao desenvolvimento de neoplasias devido a um maior gasto energético por parte do
32 organismo, que compete com as neoplasias pela absorção de nutrientes. Zielinski et al. (2004), também afirmaram que o exercício físico é benéfico no combate às neoplasias. Segundo o estudo que estes desenvolveram em tumores alogénicos injetados subcutaneamente, a prática de exercício físico retardou o desenvolvimento de neoplasias, no entanto não foi eficaz na redução do tamanho das lesões. Ainda assim obtiveram- se resultados favoráveis quando comparados com animais sedentários: a rejeição do tumor foi favorecida em animais exercitados. Daneryd et al. (1995) abordaram o exercício físico de outra perspetiva, verificando que o exercício é benéfico na manutenção da musculatura, o que permite uma melhoria do paciente relativamente ao desenvolvime nto de caquexia.
A ultrassonografia foi a técnica utilizada para quantificar a vascularização das neoplasias mamárias. As neoplasias identificadas por palpação nos grupos MNU sedentário (n=17) e MNU exercitado (n=18) no decorrer do protocolo experimental foram avaliados pelos modos Power Doppler e B Flow com o objetivo de identificar diferenças na vascularização. Embora as diferenças não tenham atingido o nível da significâ nc ia estatística (p>0,05), a DPC média detetada pelos modos Power Doppler e B Flow foi superior nas lesões do grupo MNU exercitado. Assim, as lesões do grupo MNU exercitado exibiram maior vascularização do que as lesões do grupo MNU sedentário. Estes resultados encontram-se de acordo com outros estudos previamente publicados em que foi contabilizado um maior número de vasos nas neoplasias de animais exercitados (Jones et al., 1985). A DPC superior no modo B Flow comparativamente com o modo
Power Doppler permitiu verificar que o modo B Flow é mais sensível na deteção da vascularização, o que está em concordância comestudos previamente publicados (Handa
et al., 1990; Kagawa et al., 1996;Martinoli et al., 1998;Rago et al., 1998).
A avaliação e classificação histopatológica das neoplasias detetadas foi realizada segundo a classificação previamente estabelecida por Russo e Russo (2000). O tipo de lesões histológicas identificadas neste ensaio e a predominância de carcinomas papilares são semelhantes aos observados por Thompson et al. (1991) aquando da administração de MNU (50 mg/kg) a ratos fêmea Sprague-Dawley (McCormick et al., 1981). Embora as diferenças entre grupos não tenham atingido o nível da significância estatística, os dados da análise histopatológica são sugestivos de um potencial efeito benéfico da prática de exercício físico durante um longo período de tempo na carcinogénese da mama, pois o número total de lesões mamárias foi superior no grupo MNU sedentário (28 vs 23 lesões), os animais do grupo MNU exercitado desenvolveram maior número de lesões
33 benignas comparativamente ao grupo MNU sedentário (7 vs 2 lesões) e o número de lesões malignas foi superior no grupo MNU sedentário (26 vs 16 lesões). A malignidade das lesões foi também superior no grupo MNU sedentário, sendo o comedo carcinoma invasivo a lesão com maior grau de malignidade. Este tipo de carcinoma apresenta elevado grau de proliferação, alto grau de lesão nuclear, aneuploidia e é clinicamente mais agressivo que os restantes tipos de lesões, comummente designados de carcinomas não comedo (Silverstein, 1998). Murphy et al. (2011) estudaram os benefícios do exercício físico no desenvolvimento do cancro da mama e na inflamação em murganhos C3(1)SV40Tag. Os animais foram divididos em dois grupos, 12 animais no grupo exercitado e 14 animais no grupo sedentário. O grupo exercitado foi submetido a um protocolo de exercício físico no tapete rolante 6 dias por semana, 60 min/dia, a uma velocidade de 20 m/min e com uma inclinação de 5%, num total de 20 semanas. Apesar das diferenças no protocolo experimental e no modelo animal utilizado, os resultados observados foram semelhantes aos do presente estudo, pois os animais sedentários apresentaram um número médio de neoplasias superior aos animais exercitados (4,9±1,2
vs 1,5±0,7; p=0,036).
A deteção do VEGF-A através de métodos de imunohistoquímica foi realizada através da utilização do clone JH121. A imunohistoquímica é processo de diagnóst ico constituído por vários passos, sendo cada passo importante para a obtenção de bons resultados. Para a obtenção de resultados desejáveis é necessário que a qualidade do tecido seja mantida. Para tal é desejável que o tecido esteja bem fixado, livre de contaminações e que o seu processamento seja apropriado. Um outro parâmetro importante é a falta de marcação ou a marcação não específica. Uma marcação inadequada pode induzir erros de análise e de interpretação dos resultados (Omata et al., 1980).
Os níveis de expressão de VEGF nas neoplasias da mama são utilizados como indicador do potencial angiogénico, permitindo estabelecer um prognóstico de forma mais viável e seguro do que a determinação de VEGF a nível sérico. Greb et al. (1999) verificaram que o nível de expressão de VEGF diminui no tecido mamário normal após a menopausa, no entanto este fenómeno não se verifica no tecido mamário neoplásico. Este facto vem provar que a regulação da vascularização em tecidos com cancro da mama não é hormonodependente ao contrário do verificado no tecido mamário normal (Callagy
34 A avaliação da imunoexpressão (extensão e intensidade) do VEGF-A neste trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da prática de exercício físico durante um longo período de tempo na expressão de VEGF-A em neoplasias da mama. A maioria das lesões do grupo MNU sedentário (46,4% das lesões) exibiu uma imunoexpressão do VEGF-A entre os 50 e os 75% (score 3) e a maioria das lesões do grupo MNU exercitado (47,8% das lesões) exibiu uma imunoexpressão superior a 75% (score 4). Considerando a bibliografia disponível, e uma vez que a imunoexpressão de VEGF-A é superior nas neoplasias do grupo MNU exercitado, seria expectável uma maior malignidade das lesões desenvolvidas pelos animais deste grupo (Schneider et al., 2005).No entanto isto não se verificou, pois o número de lesões malignas foi superior no grupo MNU sedentário.
A intensidade de imunomarcação de VEGF-A no grupo MNU sedentário teve
score 2 em 71,4% das lesões mamárias analisadas. Por sua vez, o grupo MNU exercitado
teve score 1 em 47,8% das lesões mamárias. Comparando os dados da extensão com os dados da intensidade da imunomarcação em ambos os grupos verifica-se que o grupo MNU exercitado, que possuía um score de imunoexpressão superior relativamente ao grupo MNU sedentário teve um score inferior de intensidade de imunomarcação. Tendo em conta que quanto maior o grau de malignidade e desenvolvimento do tumor, menor será a diferenciação celular e consequentemente menor será o nível de pigmentação apresentado (Restucci et al., 2002), ao contrário do que foi observado neste trabalho, seria expectável uma intensidade de marcação menor no grupo MNU sedentário, pois os animais deste grupo desenvolveram lesões com grau de malignidade superior às lesões identificadas no grupo exercitado.
À semelhança do que acontece com o VEGF-A, a DMV também constitui um fator prognóstico no cancro da mama. De acordo com a bibliografia, ambos os parâmetros estão positivamente correlacionados entre si e com o maior grau de malignidade das lesões neoplásicas (Guidi et al., 1994; Guidi et al., 1997). Neste estudo verificou-se que à semelhança do que aconteceu com a imunoexpressão do VEGF-A, a DMV também foi mais elevada no grupo MNU exercitado (p<0,05). Este resultado encontra-se de acordo os resultados observados em estudos anteriormente publicados (Jones et al., 1985). Jones et al. (1985) desenvolveram um estudo acerca do efeito do exercício na fisiolo gia do tumor em animais modelos do cancro da mama humano. Estes também observaram uma maior contagem de vasos sanguíneos em animais exercitados comparativamente a animais sedentários e uma correlação significativa entre os níveis de VEGF e o número de vasos sanguíneos no grupo exercitado.
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