A padronização do embrião é resultado da expressão espacialmente organizada de genes para que os movimentos morfogenéticos, como por exemplo a gastrulação, ocorram de forma correta e organizada. Estudos anteriores mostraram que a via Wnt/β-catenina, uma via de sinalização essencial para a gastrulação, se encontra polarizada tanto em embriões, quanto em CE (ten Berge et al., 2008).
Em nosso laboratório, observamos que COUP-TF2 também se encontra polarizado em CE murinos e que sua expressão se encontra organizada com marcadores de folhetos germinativos, havendo co-localização com PAX6, marcador de ectoderme, e sem co- localização com FOXA2, marcador de endoderme (Rosa, 2015). Já a análise de BRA(T), marcador de mesoderme, apresentou células co-expressando COUP-TF2 e BRA(T) e células expressando apenas uma das duas proteínas (Rosa, 2015), fazendo com que questionássemos sobre o papel de COUP-TF2 na aquisição desse destino.
COUP-TF2 já foi estudado durante o desenvolvimento embrionário (Pereira et al., 1999) e na diferenciação terminal de diversos tipos celulares (Wu et al., 2016). No entanto, pouco se sabe sobre o papel de COUP-TF2 no início do desenvolvimento, especialmente no início da gastrulação. A gastrulação é um evento de complexas mudanças morfogenéticas que resulta na formação dos três folhetos germinativos (Arnold & Robertson, 2009). Esse processo tem como uma das vias de sinalizações mais importantes a via Wnt/β-catenina, que atua na segregação da ectoderme e mesendoderme (ten Berge et al., 2008). Nesse processo células que migram pela linha primitiva (um centro de sinalização Wnt/β-catenina) adquirem o destino mesendodérmico e células que situam em região oposta à linha primitiva e não recebem a sinalização da via Wnt/β-catenina, se diferenciam em células com destino ectodérmico (Arnold & Robertson, 2009; Rivera-Pérez & Hadjantonakis, 2015). Com base nos conhecimentos sobre o papel da via Wnt/β-catenina na gastrulação (ten Berge et al., 2008), juntamente com dados de nosso laboratório (Rosa, 2015), tivemos o interesse de estudar a relação entre a sinalização da via Wnt/β-catenina e a expressão de COUP-TF2.
Neste trabalho, uma das formas utilizadas para modular a expressão de Coup-tf2 foi o tratamento com 4MNol. Le Guével et al. (2017) observaram que a molécula 4MNol age estabilizando a conformação de COUP-TF2 no estado de auto-repressão, reduzindo a sua própria atividade transcricional, assim como observado em nosso experimento de diferenciação de CTE murinas em monocamada (Fig. 6A).
Rosa e Brivanlou (2011) observaram que COUP-TF2 regula a expressão de Oct4 durante a diferenciação de células tronco humanas. Nesse estudo, foi observado que a superexpressão de COUP-TF2 levou à redução da expressão de OCT4, indicando que COUP- TF2 reprime a expressão de OCT4. Além disso, foi mostrado que em células indiferenciadas OCT4 reprime a expressão de Coup-tf2. Assim, foi de nosso interesse analisar a expressão de
Oct4 na diferenciação de CTE murinas tratadas com 4MNol. No entanto, em nosso
experimento, o tratamento com 4MNol resultou em redução da expressão de Oct4 (Fig. 6B), efeito oposto ao observado por Rosa & Brivanlou (2011).
Um outro gene que tivemos interesse em analisar foi Coup-tf1. Tsai e Tsai (1997) mostraram que COUP-TF1 e COUP-TF2 apresentam similaridade nos DBD e LBD, indicando que esses fatores de transcrição tenham funcionalidade redundante, inclusive, a compensação da expressão entre esses dois fatores de transcrição já foi observada em diferentes contextos (Tang et al., 2010; Wu et al., 2010)
O trabalho de Tang et al. (2010) analisou a expressão de COUP-TFs durante o desenvolvimento do olho de camundongos. Nesse estudo foi observado que a deleção condicional específica para o olho de COUP-TF2 leva ao desenvolvimento normal dessa estrutura, sendo observada que a expressão de COUP-TF1 em células que antes expressavam COUP-TF2 no tipo selvagem, resultando no desenvolvimento normal do olho. Já a deleção condicional específica para o olho dos dois fatores de transcrição, COUPTF1e COUP-TF2, leva a anormalidades no desenvolvimento do órgão. No estudo de Wu et al. (2010), foram gerados camundongos com deleção condicional específica para o útero de COUP-TF2 e foram observados fenótipos como redução no número de sítios de implantação e redução na capacidade de adesão do embrião. Em seguida foi realizada a superexpressão de COUP-TF1 que foi capaz de recuperar os fenótipos alterados pela deficiência de COUP-TF2.
Em nosso experimento de tratamento com 4MNol, foi observado que o tratamento levou ao aumento da expressão de Coup-tf1 (Fig. 6C), que pode ser justificado pela compensação que pode ocorrer na expressão de Coup-tf1 diante da redução na expressão de
Coup-tf2. Além disso, a redução na expressão de Oct4 (Fig. 6B) pode não ser um efeito direto
da inativação de COUP-TF2, mas sim o efeito do aumento de Coup-tf1. Ben-Shushan et al. (1995) e Pickens et al. (2013) mostraram que Coup-tf1 atua como repressor da transcrição de
Oct4 em células murinas de carcinoma embrionário, o que justifica a redução da expressão de Oct4 diante do aumento de Coup-tf1 nas células tratadas com 4MNol (Fig. 6B e C).
Ainda no experimento de tratamento com 4MNol, a análise da expressão de marcadores de folhetos germinativos indicou que foi observada a redução da expressão do marcador de mesoderme Bra(T) (Fig. 7A) e uma tendência na redução da expressão do marcador de endoderme Foxa2 (Fig. 7B). Como a via Wnt/β-catenina tem papel fundamental na formação desses dois folhetos (Tanaka et al.,2011), realizamos a análise da expressão de
Axin2 (Fig. 8), um conhecido alvo da via Wnt/β-catenina, (ten Berge et al., 2008) e não foi
observada alterações na sua expressão, sugerindo que se a redução em Bra(T) é um efeito da inativação de COUP-TF2, ela ocorre de forma independente da sinalização de Wnt/β-catenina.
Além disso, sabe-se que COUP-TF1 é expresso na ectoderme neural (Lin et al., 2011), indicando que o tratamento com 4MNol pode estar direcionando a diferenciação para o destino ectodérmico. A redução em Bra(T) e a tendência na redução de Foxa2 (marcadores de mesoderme e endoderme, respectivamente; Fig. 7A e B), podem ser consequência do direcionamento da diferenciação para o destino ectodérmico, pois sabe-se que células que expressam marcadores ectodérmicos são capazes de inibir a formação de mesoderme e endoderme (Sineva & Pospelov, 2014). No entanto, o marcador de ectoderme que escolhemos para esse experimento, Nestin (Fig. 7C) não mostra aumento significativo na formação de ectoderme
No trabalho de Pijuan-Sala et al. (2019) foi realizada a análise de single-cell
transcriptomics durante a gastrulação do embrião de camundongo, a Figura 24A representa
graficamente as populações de células identificadas nessa análise ao longo do processo de gastrulação, agrupadas por tipo celular. Com base nesses dados, podemos observar que apesar de Nestin ser um conhecido marcador de ectoderme (Bratt-Leal et al., 2009; Fig. 24B), ele apresenta expressão mais abrangente que outros marcadores de ectoderme, como por exemplo,
Pax6 (Fig. 24C) e Sox1 (Fig. 24D). Na Figura 24B podemos observar que Nestin é expresso
inclusive em alguns precursores de mesoderme, que pode estar influenciando na não significância na alteração de Nestin observada em nosso tratamento com 4MNol.
Figura 24: Representação gráfica de single cell transcriptomic de embriões de camundongos durante a gastrulação. Células agrupadas por tipo celular (A), expressão (azul) de Nestin (B), Pax6 (C) e Sox1 (D). Imagens retiradas de:
https://marionilab.cruk.cam.ac.uk/MouseGastrulation2018/
Como observamos redução na formação de mesoderme diante do tratamento com 4MNol, porém, sem alteração na sinalização da via Wnt/β-catenina, foi de nosso interesse testar se COUP-TF2 poderia estar agindo abaixo da via Wnt/β-catenina, realizando experimentos de modulações da via. A maneira mais direta para a modulação de uma via é a adição de seu ligante. A proteína WNT3A, é um dos ligantes mais estudados da via (He et al., 2015). Assim, realizamos a ativação da via Wnt/β-catenina com o ligante WNT3A para analisar a expressão gênica de Coup-tf2 em CE formados a partir de CTE humanas.
O tratamento com WNT3A em CTE humanas apresentou redução de Pax6 (Fig. 12A) e aumento, apesar de não significativo, de Bra(T) (Fig. 12B), condizente com o conhecido papel de Wnt/β-catenina na segregação de mesendoderme e ectoderme no embrião
(ten Berge et al., 2008). O tratamento com WNT3A também resultou em uma redução de
Foxa2 (Fig. 12C), indicando redução na indução endodérmica, que contraria a conhecida ação
da via Wnt/β-catenina de induzir a formação de endoderme (Huggins et al., 2017; Qu et al., 2017). Este efeito pode ser decorrente da abrangência da via Wnt/β-catenina, que além de atuar na segregação da mesendoderme no embrião (ten Berge et al., 2008), atua na manutenção da pluripotência de CTE (Sokol, 2011). O trabalho de Huggins et al., (2017) mostrou que o tratamento com WNT3A no cultivo de CTE humanas indiferenciadas levou ao aumento na expressão de Oct4, fator de transcrição essencial para a manutenção da pluripotência (M. Li & Belmonte, 2017). Assim, a tendência de diminuição na expressão de
Foxa2 e o não expressivo aumento em Bra(T) que foi observado em nosso trabalho (Fig. 12),
pode ser explicada pela característica da via Wnt/β-catenina de manter a pluripotência, impedindo a expressão desses marcadores de folhetos germinativos. Já a análise da expressão de Coup-tf2 indicou uma tendência à redução da sua expressão, porém, não significativa (Fig. 13).
Os efeitos difusos da via Wnt/β-catenina se deve, em parte, à existência de 19 ligantes (Miller, 2002) e a modulação que realizamos consistiu na adição de apenas um deles, justificando o não expressivo aumento de Bra(T) (Fig 12B), por exemplo. Para solucionar essa questão, decidimos realizar a inibição da via através do tratamento com C59, um composto que age na via de síntese de Wnts, inibindo a enzima Pocurpine (Proffitt et al., 2013), responsável pela lipidação de Wnts, que é essencial para a sua sinalização (Grainger & Willert, 2018). Em nossos experimentos, foi observada uma robusta inibição da via Wnt, diante do tratamento com C59, evidenciada pela expressiva inibição da formação de mesoderme (Bra(T)) e endoderme (Foxa2), sem alteração na formação de ectoderme (Pax6) (Fig. 14). A análise da expressão gênica de Coup-tf2 indicou uma tendência de redução da sua expressão sob o tratamento com C59 (Fig. 15). Os resultados obtidos nos experimentos de modulação da via Wnt/β-catenina não nos permitem estabelecer uma relação clara entre a sua sinalização e os efeitos na expressão de Coup-tf2. Apesar de ser observada uma tendência à redução da expressão de Coup-tf2 sob a ativação da via (Fig. 9 e 13), observamos uma tendência de redução sob a inibição da via Wnt (Fig. 15).
Contudo, sabemos que COUP-TF2 apresenta uma expressão distinta em relação aos marcadores de folhetos germinativos, inclusive apresenta co-localização parcial com BRA(T) (Rosa, 2015). Além disso, sabe-se que COUP-TF2 tem papel na diferenciação de CTE humanas, controlando a saída da pluripotência e ativando expressão de genes para a
diferenciação neural, como Pax6 (Rosa & Brivanlou, 2011). Em nosso experimento de diferenciação em CE humanos, observamos que o protocolo de diferenciação leva a maioria das células para o destino de ectoderme, como observado pela alta expressão de Pax6, principalmente em D6 (Fig. 11A). Assim, o aumento de Coup-tf2 ao longo da diferenciação, corrobora dados de Rosa & Brivanlou (2011). Com isso, qualquer efeito que Coup-tf2 possa ter em células de destino mesendodérmico poderiam estar sendo ocultados pelo alto número de células que apresentam o destino ectodérmico, já que as análises foram realizadas a partir de todas as células dos CE.
Uma forma de focar em células de destino mesendodérmico, ou seja, que já passaram pela segregação regulada pela via Wnt/β-catenina (ten Berge et al., 2008), foi fazer o uso de CTE humanas transfectadas com TOP-GFP, repórter para a via Wnt. Assim foi de nosso interesse quantificar a expressão de Coup-tf2 em população de células que já sofreram a segregação pela via Wnt. A análise com células TOP-GFP, deram indícios de que COUP-TF2 pode estar agindo na diferenciação da mesendoderme em mesoderme e endoderme, pela maior expressão de Coup-tf2 em células GFP-positivas (Fig. 18). Além disso, um estudo anterior de nosso laboratório (Rosa, 2015), sugeriu que COUP-TF2 estaria agindo na segregação mesoderme-endoderme, colaborando para o destino mesodérmico na definição de folhetos germinativos. Entretanto, nossos resultados mostram que caso COUP-TF2 esteja influenciando na segregação mesoderme-endoderme, tal ação seria independente da via Wnt/β-catenina, uma vez que a modulação da via Wnt/β-catenina não levou a alterações significativas na expressão de Coup-tf2.
Uma outra técnica que utilizamos para a modulação da expressão de Coup-tf2, além do tratamento com 4Mnol, foi a de gerar uma linhagem nocaute (KO) para Coup-tf2 através da ferramenta CRISPR/Cas9. O uso dessa ferramenta levou à redução da expressão desse fator de transcrição em dois clones (Fig. 21A). No entanto, apesar de validarmos a ausência dos DBD e LBD (Fig. 20), e observarmos uma redução de sua expressão (Fig. 21A), esta mutação que levaria à perda de função de Coup-tf2, não afetou a expressão gênica de marcadores pluripotência ou folhetos germinativos (Fig. 22C, 23A e 23B).
O trabalho de Rosa & Brivanlou (2011) estudou a regulação de OCT4 e PAX6 por COUP-TF2 durante a diferenciação de células tronco humanas. A ausência da regulação desses genes em nosso protocolo de diferenciação de CTE murinas (Fig. 22 B e C) pode ser explicada pela característica de COUP-TF2 apresentar diferentes padrões de regulação em diferentes contextos. (Le Guével et al., 2017). Rosa & Brivanlou (2011)discutem em seu
estudo essa ação contexto-dependente de COUP-TF2, citando o trabalho de Tang et al. (2010), no qual COUP-TF2 age inibindo a expressão de Pax6 na diferenciação do olho em camundongos, ao contrário do observado por Rosa & Brivanlou (2011). A atividade contexto- dependente de COUP-TF2 já foi sugerida por diversos estudos que mostram dualidade na ação de COUP-TF2 como fator de transcrição, que pode agir tanto como repressor, quanto ativador de seus genes alvo (Litchfield & Klinge, 2012; Park, Tsai, & Tsai, 2003).
Portanto, a ação de COUP-TF2 durante a definição de folhetos germinativos, contexto estudado em nosso trabalho, pode ser diferente da ação observada, por exemplo, no contexto de diferenciação neural em células humanas do trabalho de Rosa e Brivanlou (2011). No trabalho de Rosa e Brivanlou (2011), COUP-TF2 inibe OCT4 e ativa PAX6, durante a diferenciação neural. Em nossas linhagens nocauteadas era esperado então, que na ausência de Coup-tf2, houvesse um aumento de Oct4 e redução de Pax6. No entanto, não observamos a regulação desses genes (Fig. 22B e C), indicando que COUP-TF2 não tenha papel na definição de folhetos germinativos na diferenciação em CE formados a partir de células tronco murinas.
Como a deleção de Coup-tf2 não resultou no mesmo efeito de sua inativação por 4MNol, provavelmente os efeitos divergentes observados pelos dois métodos de modulação de COUP-TF2 deve-se ao fato de que o tratamento com 4MNol pode estar agindo em outras vias que induzem a mesoderme no processo de diferenciação, como por exemplo a via FGF (Kraushaar et al., 2012), resultando na modulação da formação desse folheto (Fig. 7B) que não é observada em nossos KOs (Fig. 23B). Um ponto interessante a ser ressaltado, é o efeito destas duas condições sobre a expressão de Coup-tf1. Nas células em que COUP-TF2 foi inibido pelo tratamento com 4MNol, observamos um aumento em Coup-tf1 (Fig. 6C), já discutido anteriormente. No entanto, nas células nocauteadas para Coup-tf2, não apresentaram diferença na expressão de Coup-tf1 quando comparadas com o tipo selvagem (Fig. 22A). Indicando novamente, que o tratamento com 4MNol possa regular outros genes, além de
Coup-tf2.
Uma hipótese que pode ser levantada com esses resultados é uma possível função de dominante negativo com o tratamento de 4MNol. A alteração na conformação de COUP- TF2 descrita por Le Guével et al. (2017), pode levar a uma ação repressora de COUP-TF2 em um repressor de Coup-tf1, o que resultaria no aumento de Coup-tf1 com o tratamento com 4MNol (Fig. 25). Uma via candidata para o controle desse mecanismo é a via FGF, que já foi mostrada por inibir a expressão de COUP-TF1 na formação de córtex cerebral de
camundongos (Faedo, Borello, & Rubenstein, 2010). Já no mutante de Coup-tf2, COUP-TF2 não adquire conformação repressora e não afetaria a expressão do repressor de Coup-tf1, assim não haveria regulação na expressão desse fator de transcrição.
Figura 25: Esquema da hipótese do efeito do tratamento com 4MNol na expressão de Coup-tf1. Linhas tracejadas representam regulações propostas neste trabalho.
Vimos que a inativação de Coup-tf2 pelo tratamento com 4MNol diminui a expressão de Coup-tf2 e aumenta a expressão de Coup-tf1, resultando na redução da expressão de Oct4 (Fig. 6). Vimos também que houve redução na diferenciação em mesoderme, porém, essa redução ocorreu de forma independente da sinalização da via Wnt/β- catenina (Fig. 7 e 8). Além disso, vimos que a modulação da via Wnt/β-catenina não alterou significativamente a expressão gênica de Coup-tf2 (Fig. 13 e 15), no entanto, pela característica de CE apresentarem populações celulares com perfis transcricionais distintos, seria interessante isolar populações de interesse para um estudo mais detalhado.
O trabalho de ten Berge (2008), mostra que células Wnt-positivas expressam os marcadores Bra(T) e Foxa2 (mesoderme e endoderme, respectivamente) em CE murinos e células Wnt-negativas expressam o marcador de ectoderme Otx2. No trabalho de Rosa (2015), foi observado em CE murinos que COUP-TF2 apresenta co-localização com marcadores de ectoderme (Pax6) e mesoderme (Bra(T)), mas pouca co-localização com marcador de endoderme (Foxa2). Compilando os dados desses dois trabalhos, foi elaborada a hipótese ilustrada na Figura 26.
Figura 26: Representação da relação entre a expressão de COUP-TF2 e a sinalização da via Wnt/β-catenina na diferenciação em CE murinos (Rosa, 2015)
Dados obtidos no presente trabalho, indicam que a ativação da via Wnt/β-catenina induz a formação de mesoderme (Fig. 12C) e que células de CE com sinalização Wnt ativa apresentam alta expressão de marcador de mesoderme e maior expressão de Coup-tf2 quando comparadas com células Wnt-negativas (Fig 17A e 18). Baseado nesses resultados, sugerimos que Coup-tf2 possa estar agindo após a segregação de Wnt/β-catenina, apenas em células Wnt-positivas. Assim, células com sinalização Wnt/β-catenina ativa e que expressam Coup-
tf2 assumiriam o destino mesodérmico e células com a sinalização Wnt/β-catenina ativa e que
não expressam Coup-tf2 assumiriam o destino endodérmico. Um experimento de diferenciação direcionada apenas para o destino mesendodérmico, por exemplo, juntamente com uma perda de função de Coup-tf2, seria interessante para testar a hipótese de que Coup-
tf2 atuaria nesse processo
Interessantemente, a expressão de Foxa2 é levemente aumentada em um dos nocautes para Coup-tf2 quando estudado em todas as células de CE murinos (Fig. 23A). Pode ser que se esse efeito for estudado somente nas células Wnt-positivas, veríamos um aumento significativo, que poderia sugerir uma ação de COUP-TF2 em reprimir a expressão de Foxa2 nas células mesendodérmicas, permitindo assim a expressão de Bra(T) e a consequente definição do destino mesodérmico.