UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
ALINE MIKA MATSUGUMA
Estudo da expressão polarizada da via Wnt/β-catenina e Coup-tf2 em corpos embrioides formados a partir de células-tronco embrionárias
CAMPINAS 2019
Estudo da expressão polarizada da via Wnt/β-catenina e Coup-tf2 em corpos embrioides formados a partir de células-tronco embrionárias
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução.
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA ALINE MIKA MATSUGUMA E ORIENTADA PELO PROF. DR. HENRIQUE MARQUES BARBOSA DE SOUZA.
Orientador: Prof. Dr. Henrique Marques Barbosa de Souza
CAMPINAS 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Henrique Marques Barbosa de Souza
Profa. Dra. Katlin Brauer Massirer
Dra. Hozana Andrade Castillo
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que
se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Agradeço à minha família, Clara, Hélcio e Yuki Matsuguma, pela educação, amor e ensinamentos passados a mim, que deram todas as condições para que eu pudesse focar em meus estudos e realizar todos os sonhos que tive até hoje.
Ao meu melhor amigo Gustavo Davanzo que nesses últimos anos esteve ao meu lado, torcendo pelo meu sucesso e dando valiosos conselhos, sempre com muito amor e companheirismo.
À família Nakada, que me acolheu durante o intercâmbio, me deu um lar na Califórnia e permitiu que eu pudesse aproveitar ao máximo essa experiência incrível.
Aos meus amigos e colegas de laboratório, Viviane, Thaísa, Amanda, Diego, Cyro e a todos os colegas de departamento com quem passei a maior parte dos meus dias nesses últimos anos. Obrigada pelos almoços, bares e cafés na copa, hoje os tenho como grandes amigos que vou levar para a vida toda.
Ao meu orientador Henrique Marques pelos ensinamentos, pela compreensão dos imprevistos encontrados pelo caminho e pela liberdade e incentivo que nos dá para responder a todas as nossas perguntas.
Ao Willert Lab, que em poucos meses me acolheu, auxiliou em todos os experimentos e ensinaram muito sobre Ciência. Agradeço especialmente ao Prof. Dr. Karl Willert que me deu total autonomia para realizar os experimentos.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - Processo: 2016/13095-8.
Um importante evento do desenvolvimento embrionário é a gastrulação, na qual o embrião forma os três folhetos germinativos: ectoderme, mesoderme e endoderme. Esse processo é organizado por diversas vias de sinalização, diferencialmente expressas que resultam na padronização do embrião. Uma via importante para a correta gastrulação, é a via Wnt/β-catenina, que forma um gradiente de sinalização resultando em um embrião polarizado. Durante a gastrulação, a via Wnt/β-catenina atua segregando a ectoderme da mesendoderme e em seguida, atua na formação da mesoderme e endoderme. A polarização da sinalização da via Wnt/β-catenina é observada tanto em embriões, quanto em corpos embrioides (CE). Em nosso laboratório foi observado que COUP-TF2, um fator de transcrição importante para a determinação de destinos celulares, se encontra polarizado em CE, assim como a via Wnt/β-catenina. Portanto, foi de nosso interesse investigar o papel de COUP-TF2 na determinação de folhetos germinativos de CE no contexto da gastrulação. Nossos resultados mostraram que o tratamento de células-tronco embrionárias (CTE) murinas com 4MNol, molécula que inativa COUP-TF2, resultou em redução na expressão de marcadores de mesoderme (Bra(T)) e endoderme (Foxa2). Análise da expressão gênica de Axin2, gene alvo da via Wnt/β-catenina, mostrou que não houve modulação da sinalização dessa via, sugerindo que COUP-TF2 não regula a via catenina. Adicionalmente, foi observado que a modulação da via Wnt/β-catenina não regula a expressão de Coup-tf2 em CE humanos. No entanto, análises preliminares em CE humanos realizadas em populações de células de CE já segregadas pela via Wnt/β-catenina em ectoderme e mesendoderme, mostraram que Coup-tf2 pode ter papel na segregação mesoderme-endoderme. Linhagens de CTE murinas nocauteadas para Coup-tf2 não mostraram alteração na expressão de marcadores de mesoderme e endoderme em CE murinos, indicando que Coup-tf2 não regula a formação desses folhetos e que os resultados encontrados no tratamento com 4MNol podem ser resultantes de uma ação inespecífica da molécula, que levaria a redução da formação de mesoderme e endoderme. Nesse trabalho, foi observado que Coup-tf2 não é essencial para a definição dos três folhetos germinativos, no contexto da gastrulação em CE murinos. No entanto, Coup-tf2 pode estar agindo em um segundo momento, na segregação da mesendoderme em mesoderme e endoderme.
Gastrulation is an important event during embryonic development, in which the embryo originates three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm. This process is organized by several signaling pathways that are differentially expressed, culminating in the patterning of the embryo. The Wnt/β-catenin signaling pathway is important for the proper gastrulation. This pathway is patterned as a gradient resulting in a polarized embryo. During gastrulation, Wnt/β-catenin signaling pathway segregates the ectoderm from the mesendoderm, then it regulates the mesoderm and endoderm formation. The Wnt/β-catenin pathway is known to be polarized both in mice embryos and embryoid bodies (EB). Previous studies from our group showed that COUP-TF2, a transcription factor known to regulate cell fate decisions, is polarized in mice EB, resembling the Wnt/β-catenin pathway polarized pattern. Thus, we were interested in investigating the role of COUP-TF2 in germ layer differentiation in EB in the context of gastrulation. Our results showed that mice embryonic stem cells treated with 4MNol, a molecule that inactivates COUP-TF2, led to reduced expression of mesodermal (Bra(T)) and endodermal (Foxa2) markers. However, gene expression analysis of Axin2, a Wnt/β-catenin pathway target gene, showed no regulation of this pathway, suggesting that COUP-TF2 does not regulate Wnt/β-catenin signaling. Additionally, we showed that Wnt/β-catenin signaling modulation does not regulate Coup-tf2 expression in human EB. however, exploratory analysis of Wnt-segregated cell populations from human EB, suggested that Coup-tf2 is more expressed in Wnt-positive cells when compared to Wnt-negative cells, indicating that Coup-tf2 might have a role in mesoderm-endoderm segregation. Gene expression analysis in Coup-tf2 knockout mice EB showed that
Coup-tf2 does not regulate mesoderm and endoderm formation, indicating that the regulation
observed in the 4MNol treatment might be a consequence of non-specific action of 4MNol that could lead to impaired mesoderm and endoderm formation. This study showed that
Coup-tf2 does not regulate germ layer formation during gastrulation in mice EB. However, Coup-Coup-tf2
might have a role in the following step, during mesendodermal differentiation in mesoderm and endoderm.
Figura 1: Representação do embrião de camundongo no dia E6.5 durante o processo de gastrulação e aquisição de folhetos germinativos. Adaptado de Tam & Loebel (2007). ... 15 Figura 2: Vias de sinalização envolvidas na definição de eixos embrionários (Adaptado de Arnold & Robertson, 2009). ... 16 Figura 3: Mecanismos moleculares da via Wnt/β-catenina de sinalização. Via inativa (A) e via ativa (B) (Adaptado de Macdonald et al., 2009). ... 18 Figura 4: Vias de sinalização envolvidas na diferenciação de células-tronco mesenquimais (Adaptado de Xie et al., 2011). ... 20 Figura 5: Mecanismos moleculares envolvidos na definição de destinos celulares em angioblastos. Destino arterial (A) e destino venoso (B) (Adaptado de Fish & Wythe, 2015). ... 21 Figura 6: Expressão gênica relativa a Rps29 de Coup-tf2 (A), Oct4(B) e Coup-tf1 (C) em CTE murinas no 5º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento com 50µM de 4MNol (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão. *: P ≤ 0,05. ... 23 Figura 7: Expressão gênica relativa a Rps29 de Bra(T) (A), Foxa2 (B) e Nestin (C) em CTE murinas no 5º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento com 50µM de 4MNol (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão. *: P ≤ 0,05. ... 24 Figura 8: Expressão gênica relativa a Rps29 de Axin2 em CTE murinas no 5º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento com 50µM de 4MNol (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão. ... 25 Figura 9: Expressão gênica relativa a Rps29 de Axin2 (A) e Coup-tf2 (C) em CTE murinas no 6º dia de diferenciação em monocamada em meio suplementado com WNT3A (L-WNT3A) ou não (L-cell) (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão. ... 26
Figura 10: Expressão gênica relativa a Rps29 de Axin2 (A) e Coup-tf2 (C) em CTEmurinas no 6º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento de 5µM de CHIR99021 (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão. ... 27
representam o desvio padrão. ... 28 Figura 12: Expressão gênica relativa a β-actin de Pax6 (A), Bra(T) (B) e, Foxa2 (C) em CE humanos no 6º dia de diferenciação sob o tratamento de 7nM de WNT3A (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão e *: P ≤ 0,05. ... 29 Figura 13: Expressão gênica relativa a β-actin de Coup-tf2 em CE humanos no 6º dia de diferenciação sob o tratamento de 7nM de WNT3A (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão. ... 29 Figura 14: Expressão gênica relativa a β-actin de Bra(T) (A), Foxa2 (B) e Pax6 (C) durante a diferenciação de CE humanos sob o tratamento de 20µM de C59 (n=2). ***: P ≤ 0.001; **** P ≤ 0.0001. ... 30 Figura 15: Expressão gênica relativa a β-actin de Coup-tf2 durante a diferenciação de CE humanos sob o tratamento de 20µM de C59 (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão. ... 31 Figura 16: Padrão de expressão da via Wnt/β-catenina em CE humanos transfectados com TOP-GFP. A-K: dias 2 a 12 de diferenciação (barra 1000µm); L: Destaque de CE que apresentam polarização da via Wnt/β-catenina (aumento de 2x do quadro E). Setas brancas indicam CE que apresentam polarização da via Wnt/β-catenina. ... 32 Figura 17: Expressão gênica relativa a β-actin de Bra(T) (A), Sox17 (B) e Pax6 (C) em CE humanos no 6º dia de diferenciação expressando TOP-GFP após cell sorting (n=1) ... 33
Figura 18: Expressão gênica relativa a β-actin de Coup-tf2 no 6º dia de diferenciação de CE humanos expressando TOP-GFP após cell sorting (n=1) ... 33 Figura 19: Representação de produtos do gene Coup-tf2. Locais de edição representados por setas vermelhas. ... 34 Figura 20: Alinhamento do sequenciamento de gDNA de clones KO#1 e KO#2, com a sequência do tipo selvagem (wt) como referência. ... 35
erro representam o desvio padrão, ***: P ≤ 0.001. ... 35 Figura 22: Expressão gênica relativa a Rps29 de Oct4 (A) e Pax6 (B) em CE murinos tipo selvagem (wt) e clones editados (KO#1 e KO#2) no 5º dia de diferenciação (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão. ... 36 Figura 23: Expressão gênica relativa a Rps29 de Foxa2 (A) e Bra(T) (B)em CE murinos tipo selvagem (wt) e clones editados (KO#1 e KO#2) no 5º dia de diferenciação (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão. ... 37 Figura 24: Representação gráfica de single cell transcriptomic de embriões de camundongos durante a gastrulação. Células agrupadas por tipo celular (A), expressão (azul) de Nestin (B), Pax6 (C) e Sox1 (D). Imagens retiradas de: ... 41 Figura 25: Esquema da hipótese do efeito do tratamento com 4MNol na expressão de Coup-tf1. Linhas tracejadas representam regulações propostas neste trabalho. ... 45 Figura 26: Representação da relação entre a expressão de COUP-TF2 e a sinalização da via Wnt/β-catenina na diferenciação em CE murinos (Rosa, 2015) ... 46
CE: corpos embriodes
COUP-TF2: do inglês, Chick Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor 2 CTE: células-tronco embrionárias
DBD: do inglês, DNA Binding Domain E: estádio embrionário
FGF: do inglês, Fibroblast Growth Factor FOXA2: do inglês, Forkhead Box A2
GSK3: do inglês, Glycogen Synthase Kinase 3 LBD: do inglês, Ligand Binding Domain NANOG: do inglês, Nanog homeobox
OCT4: do inglês, Octamer-binding transcription factor 4 PAX6: do inglês, Paired Box 6
SOX17: do inglês, SRY-box 17 SOX2: do inglês, SRY-box 2
1. Introdução ... 14
1.1. Padronização do embrião... 14
1.2. Formação do eixo anteroposterior ... 15
1.3. Corpos Embrioides ... 16
1.4. Padronização de CE ... 17
1.5. Via Wnt/β-catenina ... 17
1.6. COUP-TF2 (Chicken Ovoalbumin Promoter – Transcription Factor 2) ... 18
1.7. COUP-TF2 e via Wnt/β-catenina ... 19
2. Hipótese ... 22
3. Objetivos Gerais ... 22
3.1. Objetivos específicos ... 22
4. Resultados ... 23
4.1. Modulação de COUP-TF2 por 4MNol ... 23
4.2. Modulação de Wnt/β-catenina – ativação por meio condicionado com WNT3A ... 25
4.3. Modulação de Wnt/β-catenina – ativação por CHIR99021 ... 26
4.4. Modulação de Wnt/β-catenina – ativação por WNT3A ... 27
4.5. Modulação de Wnt/β-catenina – inativação por C59 ... 30
4.6. TOP-GFP ... 31
4.7. Modulação de Coup-tf2 por CRISPR-Cas9 ... 34
5. Discussão ... 38
6. Conclusão ... 47
7.2. Experimentos realizados no laboratório do Prof. Dr. Karl Willert ... 52
8. Referências ... 54
Anexo I ... 60
1. Introdução
O desenvolvimento embrionário consiste em diversos eventos que levam o zigoto à formação de um organismo completo. Nesse processo, uma célula deve passar por diversas decisões até atingir um estado diferenciado e com funcionalidade definida. O desenvolvimento embrionário é um processo organizado pela expressão de determinados genes controlados temporal e espacialmente, resultando na padronização do embrião (Zernicka-Goetz, 2004). Essa padronização permite que haja a definição de porções no embrião que virão a formar tecidos específicos para cada função.
1.1. Padronização do embrião
Em embriões de mamíferos, o zigoto passa por sucessivas divisões simétricas, resultando em blastômeros morfologicamente semelhantes (Zernicka-Goetz, Morris, & Bruce, 2009). Na fase de blastocisto, o embrião sofre cavitação e ocorre a primeira diferenciação celular, na qual os blastômeros perdem a totipotência, formando duas populações celulares: a trofectoderme e massa celular interna (Arnold & Robertson, 2009). A trofectoderme é formada por células da superfície externa do embrião (expressando Cdx2, marcador de trofectoderme), que irão proliferar e compor tecido extraembrionário, que tem como uma das funções a fixação do embrião ao endométrio (Takaoka & Hamada, 2012). A porção distal da trofectoderme se diferencia em ectoderme extraembrionária, de onde origina sinalizações importantes que orquestram o processo de gastrulação do embrião (Arnold & Robertson, 2009).
A massa celular interna, por sua vez, é formada por células que expressam Oct4,
Sox2 e Nanog, que compões uma rede de regulação que mantém a pluripotência (M. Li &
Belmonte, 2017) e é a população de células isolada para o cultivo in vitro de células-tronco embrionárias (CTE) (Arnold & Robertson, 2009). As células da massa celular interna, em E4.5, se diferenciam em duas populações: o epiblasto, que são as células que continuam a expressar Nanog e a endoderme primitiva, camada de células que recobre o epiblasto, deixam de expressar o marcador de pluripotência Nanog e passam a expressar Gata6 (Takaoka & Hamada, 2012). A endoderme primitiva dá origem à endoderme visceral que é dividida em endoderme visceral parietal e distal (Rivera-Pérez & Hadjantonakis, 2015). A endoderme visceral distal expressa Dkk1, um antagonista da via Wnt/β-catenina, gerando um gradiente de
sinalização que auxilia na formação de estruturas importantes para o processo de gastrulação que ocorrerá no epiblasto (Rivera-Pérez & Hadjantonakis, 2015).
O epiblasto, é formado pela população de células que continua expressando
Nanog, mantendo assim a sua pluripotência (Arnold & Robertson, 2009). O epiblasto dá
origem aos três folhetos germinativos: ectoderme, que forma a epiderme e nervos; endoderme, que forma o tubo digestivo, órgãos associados e pulmões; e mesoderme, que forma o sistema cardiovascular, rins, gônadas, ossos e o tecido conjuntivo (Gilbert, 2000). Esses três folhetos germinativos são formados durante a gastrulação, que se inicia em E6.25, quando parte das células do epiblasto passam pelo processo de transição epitélio-mesênquima e migram para a região posterior do embrião e contribuem para a formação da linha primitiva (Fig. 1). Já as células que mantém a morfologia epitelial e, portanto, não migram, vão originar a ectoderme, agora na região anterior (Stower & Srinivas, 2018). A partir da linha primitiva serão formadas a mesoderme e a endoderme, processo controlado pelas vias Wnt/β-catenina e FGF (Nowotschin & Hadjantonakis, 2010). Uma porção de células da linha primitiva passa por alterações morfológicas e se tornam capazes de migrar pelo espaço entre o epiblasto e a endoderme visceral, formando a mesoderme (Nowotschin & Hadjantonakis, 2010). A outra porção de células, migra a partir da linha primitiva e se inserem sob a camada epitelial do embrião, onde irão formar a endoderme definitiva (Nowotschin & Hadjantonakis, 2010).
Figura 1: Representação do embrião de camundongo no dia E6.5 durante o processo de gastrulação e aquisição de folhetos germinativos. Adaptado de Tam & Loebel (2007).
A formação do eixo anteroposterior, se dá pelo gradiente de sinalização da via Wnt/β-catenina, que é dependente da sinalização proveniente da ectoderme extraembrionária e da endoderme visceral distal (Arnold & Robertson, 2009; Fig. 2). A importância desse tecido extraembrionário para a padronização do embrião foi evidenciada por sua remoção, que leva à ausência da expressão de marcadores de região posterior e da linha primitiva como
Cripto, Nodal e Brachyury (Bra(T)) e sugerindo que fatores extraembrionários estão
envolvidos também na formação da linha primitiva (Rodriguez, 2005). A sinalização da via Wnt/β-catenina também é essencial para a formação e manutenção da linha primitiva e portanto, da definição da porção posterior, assim como a expressão de seus antagonistas é importante para a formação da região anterior (Arkell, Fossat, & Tam, 2013).
Figura 2: Vias de sinalização envolvidas na definição de eixos embrionários (Adaptado de Arnold & Robertson, 2009).
1.3. Corpos Embrioides
Como modelo de estudo desses processos in vitro usamos corpos embrioides (CE), que são agregados formados a partir de CTE que, ao se diferenciarem, são capazes de reproduzir eventos que ocorrem em um embrião em seus estágios iniciais (Bratt-Leal, Carpenedo, & McDevitt, 2009). As CTE, como citado anteriormente, são células isoladas da massa celular interna de blastocistos e cultivadas em meio de cultura condicionados à manutenção do seu estado indiferenciado (Martin, 1981). CTE são células pluripotentes, ou
seja, são capazes de se diferenciar e realizar a auto renovação, expressar os marcadores da pluripotência, dar origem aos três folhetos germinativos e formar teratomas (Silva & Smith, 2008). Por serem capazes de originar qualquer célula de um organismo adulto, os CE formados a partir de CTE são amplamente utilizados como modelos para o estudo do desenvolvimento embrionário.
1.4. Padronização de CE
Diferente do embrião, o CE é formado apenas por células da massa celular interna do blastocisto e é, portanto, desprovido de sinalizações provenientes de tecidos extraembrionários que padronizam os eixos corporais no embrião. Portanto, é esperado que a formação dos diferentes tipos celulares nos CE ocorra sem uma organização global aparente.
No entanto, existem evidências de que CE apresentam uma organização (Leahy, Xiong, Kuhnert, & Stuhlmann, 1999) e estudos mostram que apresentam inclusive a capacidade de padronização de marcadores importantes para a gastrulação, como BRA(T) e SOX17 (van den Brink et al., 2014), e padronização da via Wnt/β-catenina (ten Berge et al., 2008). No entanto, os fatores que levam à padronização dos CE ainda não foram totalmente elucidados.
1.5. Via Wnt/β-catenina
A via Wnt/β-catenina é uma via de sinalização importante para o desenvolvimento embrionário de todos os metazoários (Bazan, Janda, & Garcia, 2012). Essa via atua em processos como a padronização de embriões e diferenciação sináptica, e a perda de função de genes dessa via pode levar desde à morte do embrião e anormalidades do sistema nervoso central à defeitos no desenvolvimento de rins e membros (Logan & Nusse, 2004).
Quando esta via está inativa, o complexo de destruição está ativo e é responsável pela fosforilação de β-catenina. O complexo de destruição é formado pelas proteínas AXIN, APC (Adenomatou Polyposis Coli); CK1 (Casein Kinase 1) e GSK3 (Glycogen Synthase
Kinase 3). Uma vez fosforilada, a β-catenina é reconhecida por β-TRCP, que ocasiona a sua
ubiquitinação. Uma vez marcada, a β-catenina é endereçada ao proteassomo, onde será degradada, impedindo a sua atividade no núcleo celular (Fig. 3A; adaptado de MacDonald, Tamai, & He, 2009)
Quando a via Wnt/β-catenina está ativa (Fig. 3B), os ligantes de Wnt/β-catenina se ligam ao receptor Frizzeld (FZD) e correceptores LRP6/5 (Low-density Lipoprotein
Receptor-related Protein 6/5), formando um complexo. Esse complexo recruta a proteína
Dishevelled (DVL), levando à ativação e ao recrutamento do complexo de destruição para o local dos receptores. Assim, o complexo de destruição é impedido de causar a fosforilação da β-catenina, que é acumulada no citoplasma e transportada ao núcleo, onde se liga à TCF/LEF, que bloqueia a região promotora de genes-alvo da via Wnt/β-catenina, liberando estes genes para transcrição (MacDonald et al., 2009).
Os genes alvo da via Wnt/β-catenina variam de acordo com o tipo celular. Essa via é capaz de regular genes que atuam na própria via (Logan & Nusse, 2004) e genes alvos relacionados à proliferação celular, polarização celular e decisões de destinos celulares (MacDonald et al., 2009).
Figura 3: Mecanismos moleculares da via Wnt/β-catenina de sinalização. Via inativa (A) e via ativa (B) (Adaptado de Macdonald et al., 2009).
No embrião, a polarização da via Wnt/β-catenina tem papel importante na definição do eixo anteroposterior (Yamaguchi, 2001). A deleção de β-catenina no embrião leva à falha da gastrulação, ausência da linha primitiva e, consequentemente, falha na formação da mesoderme (Huelsken et al., 2000).
1.6. COUP-TF2 (Chicken Ovoalbumin Promoter – Transcription Factor 2)
O gene Coup-tf2, tem papel importante em diversos estágios do desenvolvimento embrionário. Ele já foi descrito atuando como regulador da determinação de destinos celulares específicos na angiogênese, desenvolvimento do coração, diferenciação neural edesenvolvimento do estômago (Lin et al., 2011). A deleção desse gene em camundongos leva ao lento crescimento dos embriões e um desenvolvimento anormal do sistema cardiovascular, resultando em uma hemorragia severa, causando a sua morte após o 10º dia de gestação (Pereira et al., 1999).
Em nosso laboratório foi observado que, assim como a via Wnt/β-catenina, COUP-TF2 encontra-se polarizado em CE (Rosa, 2015) sugerindo um envolvimento desse fator de transcrição no mecanismo de padronização de CE. Observamos que quarto dia de diferenciação, cerca de 50% das células dos CE expressam COUP-TF2, formando duas populações celulares distintas, em polos opostos, onde precursores dos três folhetos germinativos estão distintamente distribuídos. Nesse estádio de diferenciação, parte das células positivas para COUP-TF2 também são positivas para BRA(T) (marcador mesodérmico) e há grande co-localização com PAX6 (marcador de ectoderme), não havendo co-localização com FOXA2 (marcador de endoderme) (Rosa, 2015), indicando um possível envolvimento desse fator de transcrição na diferenciação dos folhetos germinativos. A expressão polarizada de COUP-TF2 em CE e sua relação com a expressão de marcadores de folhetos germinativos, descrita por nosso grupo, corroboram a existência de um mecanismo intrínseco às CTE, que resulta em uma organização global controlando a diferenciação celular nos CE de forma análoga ao desenvolvimento embrionário.
1.7. COUP-TF2 e via Wnt/β-catenina
Na literatura, a relação entre Coup-tf2 e a via Wnt/β-catenina varia de acordo com o tipo celular ou nível de sinalização analisado. Boutant et al. (2012) estudaram o efeito de
Coup-tf2 em células β pancreáticas e observaram que houve a diminuição de expressão de
β-catenina e outros genes da via Wnt/β-β-catenina como c-Myc, Gsk3 e Axin2 na ausência de COUP-TF2. Nesse mesmo trabalho foi induzida a expressão de COUP-TF2 e foi observado aumento da expressão de β-catenina e Cyclin D1, um gene alvo da via, indicando uma relação positiva entre os dois fatores, na qual a ausência de COUP-TF2 leva a redução na sinalização da via.
Okamura et al. (2009) também observaram uma relação positiva entre Coup-tf2 e a via Wnt/catenina. Esse segundo estudo foi realizado em pré-adipócitos silenciados para β-catenina, que apresentaram redução da expressão de Coup-tf2. Essas mesmas células foram tratadas com WNT3A, um ligante da via Wnt/β-catenina, e a ativação da via resultou na indução da expressão de Coup-tf2.
No entanto, o estudo de Li et al. (2009) também com pré-adipócitos, mostrou que o silenciamento de COUP-TF2 resultou no aumento da expressão de β-catenina e Wnt10b, sugerindo uma relação negativa entre COUP-TF2 e a via Wnt/β-catenina, contrária à observada por Okamura et al. (2009). Nesta mesma linha, Xie et al. (2011) (Fig. 4) observaram, em células-tronco mesenquimais, que a deficiência de COUP-TF2 resultou no aumento de Wnt10b, e que o silenciamento de COUP-TF2 levou à indução da expressão de β-catenina. Os dois trabalhos (Okamura et al., 2009; Xie et al., 2011 ) demonstraram que a região regulatória de Wnt10b apresenta um sítio de ligação para COUP-TF2. Xie et al. (2011) demonstraram também que a remoção de COUP-TF2 levou à redução da expressão do gene
Sox9 (gene envolvido na diferenciação das células-tronco mesenquimais), que promove a
degradação de β-catenina.
Figura 4: Vias de sinalização envolvidas na diferenciação de células-tronco mesenquimais (Adaptado de Xie et al., 2011).
Um importante papel de COUP-TF2 é na definição dos angioblastos quanto ao destino arterial ou venoso. O estudo de Fish and Wythe (2015) sugere que, quando COUP-TF2 é expresso em angioblastos, esta expressão inibe a sinalização da via Notch, definindo o destino venoso da célula. Nestas células, com o destino venoso, não é observada a ativação da via Wnt/β-catenina. Nos angioblastos onde a via Wnt/β-catenina está ativa, a expressão de
algum fator Sox abaixo da via Wnt/β-catenina pode estar interagindo com COUP-TF2, ativando-o, e assim inibindo a via Notch (Fig. 5; Fish and Wythe, 2015).
Figura 5: Mecanismos moleculares envolvidos na definição de destinos celulares em angioblastos. Destino arterial (A) e destino venoso (B) (Adaptado de Fish & Wythe, 2015).
Esses estudos, juntamente com estudos do papel da sinalização da via Wnt/β-catenina e da expressão de COUP-TF2 durante o desenvolvimento embrionário, motivaram a realização do presente estudo que visa relacionar a sinalização da via Wnt/β-catenina e a expressão polarizada de COUP-TF2 durante a diferenciação de CE, a fim de elucidar como a relação entre esses dois fatores pode regular a aquisição de destinos celulares no contexto da gastrulação e formação dos três folhetos germinativos.
2. Hipótese
A polarização da expressão de genes é importante para a formação dos eixos corporais e o correto desenvolvimento do embrião. Nosso laboratório observou expressão polarizada do gene COUP-TF2 (Rosa, 2015) em CE, assim como a já descrita (ten Berge et al., 2008) polarização da via Wnt/β-catenina. Nosso interesse é de relacionar esses dois padrões de expressão durante a diferenciação dos CE provenientes de CTE.
3. Objetivos Gerais
1. Modulação da expressão de Coup-tf2 e análise de marcadores de folhetos germinativos;
2. Modulação da via Wnt/β-catenina e análise da expressão de Coup-tf2;
3. Geração de células-tronco embrionárias nocautes para Coup-tf2 e análise da expressão de marcadores de folhetos germinativos.
3.1. Objetivos específicos
1. Modulação da expressão de Coup-tf2 e análise de marcadores de pluripotência e folhetos germinativos;
a. Inativação de COUP-TF2 através do tratamento com 4MNol; 2. Modulação da via Wnt/β-catenina e análise da expressão de Coup-tf2;
a. Ativação da via através do tratamento com WNT3A; b. Inibição da via através do tratamento com C59;
3. Gerar linhagens nocauteadas para Coup-tf2 através da técnica CRISPR/Cas9;
a. Identificação de clones nocauteados para Coup-tf2 através de sequenciamento e análise de expressão gênica de Coup-tf2;
b. Análise da expressão gênica de marcadores de pluripotência e folhetos germinativos.
4. Resultados
4.1. Modulação de COUP-TF2 por 4MNol
Sabe-se que COUP-TF2 é um receptor nuclear que apresenta papel fundamental na determinação de destinos celulares, tanto na saída da pluripotência (Rosa & Brivanlou, 2011; Zhuang & Gudas, 2008), quanto na diferenciação terminal de diversos tipos celulares (Wu et al., 2016). No entanto, a natureza de seus ligantes ainda é desconhecida. O trabalho de Le Guével et al. (2017) realizou um estudo da estrutura de COUP-TF2 e a molécula 4MNol (4-Methoxy-1-Naphthol) foi identificada por se ligar à proteína de COUP-TF2, reprimindo a sua atividade como fator de transcrição, apesar de não ser um ligante de COUP-TF2.
Em nosso trabalho, foi realizado o tratamento com 4MNol para modular a atividade de COUP-TF2 durante a diferenciação em monocamada de CTE murinas e analisamos a expressão gênica de marcador de pluripotência e marcadores de folhetos germinativos no 5º de diferenciação. Foi escolhido esse dia de diferenciação, pois Rosa (2015) observou que no início da diferenciação de CTE murinas, COUP-TF2 encontra-se expresso na porção citoplasmática e a partir do quarto dia de diferenciação (D4), é possível observar COUP-TF2 expresso no núcleo (Rosa, 2015). As análises de expressão gênica sob o tratamento de 4MNol mostraram que houve redução da expressão de Coup-tf2 (Fig 6A) e
Oct4 (Fig. 6B), marcador de pluripotência (M. Li & Belmonte, 2017). Além disso, foi
observado aumento na expressão gênica de Coup-tf1 (Fig. 6C).
Figura 6: Expressão gênica relativa a Rps29 de Coup-tf2 (A), Oct4(B) e Coup-tf1 (C) em CTE murinas no 5º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento com 50µM de 4MNol (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão. *: P ≤ 0,05.
Em seguida foi realizada a análise da expressão gênica dos marcadores de folhetos germinativos. Foi observada uma significativa redução na expressão do marcador de mesoderme (Bra(T); Fig. 7A) e uma tendência na redução do marcador de endoderme (Foxa2; Fig. 7B), enquanto não foi observada alteração significativa no padrão de expressão do marcador de ectoderme (Nestin; Fig. 7B).
Figura 7: Expressão gênica relativa a Rps29 de Bra(T) (A), Foxa2 (B) e Nestin (C) em CTE murinas no 5º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento com 50µM de 4MNol (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão. *: P ≤ 0,05.
Para avaliar se a diminuição dos marcadores de mesoderme e endoderme se deu pela modulação da via Wnt/β-catenina por COUP-TF2, foi realizada a análise da expressão gênica de Axin2, um gene alvo da via (ten Berge et al., 2008). Foi observado que a expressão gênica de Axin2 não foi alterada nas amostras analisadas, indicando que a redução de marcadores de mesoderme e endoderme ocorre de maneira independente da sinalização da via Wnt/β-catenina na diferenciação em monocamada de CTE tratadas com 4MNol (Fig. 8).
Figura 8: Expressão gênica relativa a Rps29 de Axin2 em CTE murinas no 5º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento com 50µM de 4MNol (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão.
Os resultados com 4MNol mostraram que a regulação de Coup-tf2 levou a alterações na mesoderme e endoderme, de forma independente da via Wnt/β-catenina. Assim, foi de nosso interesse investigar se Coup-tf2 poderia estar atuando abaixo da via Wnt/β-catenina.
4.2. Modulação de Wnt/β-catenina – ativação por meio condicionado com
WNT3A
Visando explorar uma possível regulação de Coup-tf2 pela via Wnt/β-catenina, decidimos modular esta via durante a diferenciação de CTE e observar a expressão de
Coup-tf2 e dos marcadores dos folhetos germinativos.
Primeiramente testamos o uso de meio condicionado com WNT3A, que consiste na suplementação do meio de diferenciação com o sobrenadante do cultivo de fibroblastos L-WNT3A (gentilmente doado pelo Prof. Dr. José Garcia – UFRJ), capazes de secretar a proteína WNT3A, um ligante da via Wnt/β-catenina. As análises de expressão gênicas foram realizadas após o tratamento e diferenciação das CTE murinas em monocamada por 6 dias (Fig. 9). Como observado na Figura 9A, há uma tendência no aumento da expressão de Axin2 e uma tendência de redução da expressão de Coup-tf2 (Fig. 9B) em relação ao tratamento, porém não significativas.
Figura 9: Expressão gênica relativa a Rps29 de Axin2 (A) e Coup-tf2 (C) em CTE murinas no 6º dia de diferenciação em monocamada em meio suplementado com WNT3A (L-WNT3A) ou não (L-cell) (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão.
Assim, como o tratamento com meio condicionado com WNT3A não levou ao aumento significativo de Axin2 (Fig 9), foi de nosso interesse buscar outras alternativas para a modulação da via Wnt/β-catenina.
4.3. Modulação de Wnt/β-catenina – ativação por CHIR99021
Em seguida, foi testado o tratamento com CHIR99021, um inibidor de GSK3 que resulta na ativação da sinalização da via Wnt/β-catenina (Naujok, Diekmann, & Lenzen, 2014). O tratamento foi realizado durante a diferenciação de CTE murinas em monocamada e amostras foram coletadas para análise de expressão gênica no 6º dia de diferenciação. As análises mostraram tendência de redução na expressão gênica de Axin2, indicando uma possível inibição da via (Fig 10A). Tal como observado para a ativação da via, observamos que a redução na sinalização da via Wnt/β-catenina resultou em aumento da expressão de
Figura 10: Expressão gênica relativa a Rps29 de Axin2 (A) e Coup-tf2 (C) em CTEmurinas no 6º dia de diferenciação em monocamada sob tratamento de 5µM de CHIR99021 (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão.
4.4. Modulação de Wnt/β-catenina – ativação por WNT3A
Devido à dificuldade na elaboração de um protocolo robusto para a modulação da via Wnt/β-catenina, colaboramos com o laboratório do Prof. Dr. Karl Willert, que estuda a via Wnt/β-catenina na diferenciação em CE a partir de CTE humanas e é especialista no uso da proteína WNT3A para a ativação da via (Huggins et al., 2017).
Primeiramente, observamos o padrão de expressão dos marcadores de folhetos germinativos e Coup-tf2 em CE humanos em diferentes dias de diferenciação (Fig. 11). Foi observado que no 6º de diferenciação as amostras apresentam expressão dos marcadores dos três folhetos germinativos e um pico na expressão de Coup-tf2, sendo este então o dia de diferenciação escolhido para a análise do efeito da modulação da via Wnt/β-catenina na expressão de Coup-tf2.
Figura 11: Expressão gênica relativa a β-actin de Pax6 (A), Bra(T) (B), Foxa2 (C) e Coup-tf2 (D) durante a diferenciação espontânea de CE humanos (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão.
Após selecionar o dia de análise para os seguintes experimentos, avaliamos o efeito da ativação da via Wnt/β-catenina na expressão de Coup-tf2 em CE humanos. Para a ativação da via Wnt/β-catenina, foi realizada a diferenciação espontânea em CE (como descrito em Materiais e Métodos) com a adição da proteína WNT3A purificada (Willert, 2008) e as amostras foram coletadas para análise da expressão gênica no 6º dia de diferenciação.
Como apresentado anteriormente, sabe-se que via de sinalização Wnt/β-catenina se encontra ativa na mesendoderme e inativa na ectoderme durante a segregação dessas duas populações (ten Berge et al., 2008). No tratamento com WNT3A foi observada a redução do marcador de ectoderme (Pax6, Fig. 12A). Além disso, foi observada uma tendência no aumento na expressão do marcador de mesoderme (Bra(T), Fig 12B), porém não significativo, e redução não significativa na expressão de Foxa2, marcador de endoderme (Fig. 12C).
Figura 12: Expressão gênica relativa a β-actin de Pax6 (A), Bra(T) (B) e, Foxa2 (C) em CE humanos no 6º dia de diferenciação sob o tratamento de 7nM de WNT3A (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão e *: P ≤ 0,05.
Nessas mesmas amostras foram realizadas as análises da expressão de Coup-tf2, sendo observado que o tratamento com WNT3A resultou em uma pequena diminuição, não significativa estatisticamente, na expressão de Coup-tf2 em CE formados a partir de CTE humanas (Fig. 13).
Figura 13: Expressão gênica relativa a β-actin de Coup-tf2 em CE humanos no 6º dia de diferenciação sob o tratamento de 7nM de WNT3A (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão.
4.5. Modulação de Wnt/β-catenina – inativação por C59
Como WNT3A representa apenas um dos ligantes da via Wnt/β-catenina, realizamos também a inibição da via Wnt/β-catenina utilizando o composto C59, um composto que age na via de síntese de Wnts (Proffitt et al., 2013), inibindo a síntese de todos os ligantes da via Wnt de sinalização. No tratamento com C59, foi observada inibição robusta de marcadores de mesoderme (Fig. 14A) e endoderme (Fig. 14B), sem alteração no marcador de ectoderme (Fig. 14C).
Figura 14: Expressão gênica relativa a β-actin de Bra(T) (A), Foxa2 (B) e Pax6 (C) durante a diferenciação de CE humanos sob o tratamento de 20µM de C59 (n=2). ***: P ≤ 0.001; **** P ≤ 0.0001.
Nessas mesmas amostras realizamos a análise da expressão de Coup-tf2 e observamos uma redução maior (cerca de 40%) de sua expressão em relação ao controle (Fig. 15), ainda assim não representando uma diferença estatisticamente significativa.
Figura 15: Expressão gênica relativa a β-actin de Coup-tf2 durante a diferenciação de CE humanos sob o tratamento de 20µM de C59 (n=2). Barras de erro representam o desvio padrão.
4.6. TOP-GFP
Como a análise da expressão gênica dessas amostras foi realizada a partir de RNA extraído de todas as células dos CE, as possíveis diferenças na expressão polarizada de COUP-TF2 e a via Wnt/β-catenina poderiam estar sendo ocultadas, então realizamos um experimento com CTE transfectadas com TOP-GFP, que expressam GFP quando a via Wnt/β-catenina está ativa.
Primeiramente, realizamos diferenciação dessas células em CE para observar o padrão de expressão do gene repórter nesse protocolo de diferenciação (Fig. 16). Em nosso protocolo de diferenciação, analisamos a ativação da via Wnt/β-catenina pela observação de GFP, que se inicia no dia 3 (Fig. 16B) de forma esparsa e a partir do dia 6 (Fig. 16E) é possível observar CE que apresentam expressão polarizada da via Wnt/β-catenina (Fig. 16E setas brancas, destaque no quadro L).
Figura 16: Padrão de expressão da via Wnt/β-catenina em CE humanos transfectados com TOP-GFP. A-K: dias 2 a 12 de diferenciação (barra 1000µm); L: Destaque de CE que apresentam polarização da via Wnt/β-catenina (aumento de 2x do quadro E). Setas brancas indicam CE que apresentam polarização da via Wnt/β-catenina.
Foi possível observar que, no 6º dia de diferenciação, há regiões positivas e negativas para GFP no CE, sendo observado um padrão de expressão da via Wnt/β-catenina semelhante ao observado por ten Berge et al. (2008) em camundongos. Como Coup-tf2 é expresso neste dia de diferenciação (Fig. 11), amostras foram coletadas no 6º dia de diferenciação e preparadas para cell sorting de acordo com protocolo descrito em Materiais e Métodos. As células foram separadas em 2 populações: GFP-positivas e GFP-negativas e foi realizada a análise da expressão gênica dessas amostras. Devido ao pouco tempo para realizar esses ensaios, não foi possível realizar o experimento em replicatas biológicas.
Figura 17: Expressão gênica relativa a β-actin de Bra(T) (A), Sox17 (B) e Pax6 (C) em CE humanos no 6º dia de diferenciação expressando TOP-GFP após cell sorting (n=1)
Foi observado que células GFP-positivas apresentam expressão de marcador de mesoderme Bra(T) (Fig. 17A) e endoderme Sox17 (Fig. 17B) e não apresentam expressão de marcador ectodérmico (Pax6, Fig. 17C). A análise da expressão de Coup-tf2 nessas amostras mostrou uma expressão relativa de Coup-tf2, cerca de três vezes maior em células GFP-positivas em relação às células GFP-negativas (Fig. 18).
Figura 18: Expressão gênica relativa a β-actin de Coup-tf2 no 6º dia de diferenciação de CE humanos expressando TOP-GFP após cell sorting (n=1)
Nossos resultados demonstraram que, pelos meios de modulação da via Wnt/β-catenina utilizados nesse trabalho foi possível notar uma possível relação positiva entre a sinalização da via e a expressão de Coup-tf2, mas nenhuma diferença observada foi considerada significativa estatisticamente, sugerindo que a via de sinalização não controla a
expressão de Coup-tf2. Corroborando esta possível ação positiva de Wnt sobre a expressão de
Coup-tf2, a análise em células que já passaram pela separação em de populações de células de
CE Wnt-positivas e Wnt-negativas, nos mostrou uma maior expressão de Coup-tf2 em células com sinalização Wnt/β-catenina ativa.
4.7. Modulação de Coup-tf2 por CRISPR-Cas9
Os resultados da inativação de COUP-TF2 por 4MNol nos mostraram regulação na formação da mesoderme (Fig. 7A), porém foi observada uma redução na expressão de
Oct4 (Fig.6B), contrário ao esperado com base no trabalho de Rosa & Brinvalou (2011), que
pode indicar uma ação inespecífica da molécula além da inativação de COUP-TF2. Para tentar solucionar essa questão, utilizamos a técnica CRISPR-Cas9 que nos permite realizar a microdeleções na região genômica de Coup-tf2 e eliminar a função de COUP-TF2. Os guias para a deleção foram desenhados flanqueando os exons 1 e 2 de Coup-tf2, pois neles se encontram o DBD e o LBD, regiões importantes para a atividade de COUP-TF2 (Litchfield & Klinge, 2012).
Figura 19: Representação de produtos do gene Coup-tf2. Locais de edição representados por setas vermelhas.
Seguindo o protocolo descrito em Materiais e Métodos, realizamos a construção de 4 sequências de RNA, que guiam a Cas9 (sgRNAs), em plasmídeos contendo a sequência para a enzima Cas9n, esses plasmídeos foram transfectados nas células, foi realizada a seleção com puromicina e por fim, foi necessária a seleção de clones que contivessem a deleção desejada. Para identificar clones que receberam os plasmídeos e apresentam a microdeleção na região desejada, foi necessária a genotipagem através da técnica de PCR a partir do DNA genômico (gDNA) dos clones, utilizando primers que flanqueam a região editada. Assim, foram identificados dois clones que apresentam a deleção em homozigose (KO#1 e KO#2) e os fragmentos amplificados foram enviados para sequenciamento (Fig 20). Ambos os clones apresentaram deleções de cerca de 3kb na região desejada. Em seguida, foi realizada a
diferenciação em CE dessas linhagens para a análise da expressão gênica e análises mostraram que houve redução na expressão gênica de Coup-tf2 (Fig. 21).
Figura 20: Alinhamento do sequenciamento de gDNA de clones KO#1 e KO#2, com a sequência do tipo selvagem (wt) como referência.
Figura 21: Expressão gênica relativa a Rps29 de Coup-tf2 em CE murinos tipo selvagem (wt) e clones editados (KO#1 e KO#2) no 5º dia de diferenciação (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão, ***: P ≤ 0.001.
Assim como no experimento de tratamento com 4MNol realizamos a análise da expressão de Coup-tf1 e não houve alteração na expressão de Coup-tf1 no 5º dia de diferenciação em CE de linhagens nocauteadas para Coup-tf2 (Fig. 22A). Além de Coup-tf1, foi realizada a análise da expressão gênica de Oct4, uma vez que Rosa e Brivanlou (2011) demonstraram que COUP-TF2 age como repressor de Oct4 e induz a expressão Pax6 durante
KO#1
o processo de diferenciação de células-tronco humanas, então foi de nosso interesse observar a expressão de Oct4 e Pax6 em nosso modelo de diferenciação. Como mostrado nas Figuras. 22B e C, não foram observadas alterações significativas nas expressões de Oct4 e Pax6 em linhagens nocauteadas para Coup-tf2 no 5º dia de diferenciação em CE.
Figura 22: Expressão gênica relativa a Rps29 de Oct4 (A) e Pax6 (B) em CE murinos tipo selvagem (wt) e clones editados (KO#1 e KO#2) no 5º dia de diferenciação (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão.
Em seguida, foi realizada a análise da expressão gênica de marcadores de mesoderme e endoderme na diferenciação em CE para verificar se haveria modulação semelhante à observada no tratamento com 4MNol. Como já citado anteriormente, a via Wnt/β-catenina é a principal via reguladora da formação de mesoderme e endoderme, assim foi de nosso interesse analisar se a expressão reduzida de Coup-tf2 poderia levar a alterações na formação desses folhetos. Foi observado que no 5º dia de diferenciação, CE formados a partir de linhagens nocauteadas para Coup-tf2 não apresentam alteração da expressão de
Figura 23: Expressão gênica relativa a Rps29 de Foxa2 (A) e Bra(T) (B)em CE murinos tipo selvagem (wt) e clones editados (KO#1 e KO#2) no 5º dia de diferenciação (n=3). Barras de erro representam o desvio padrão.
As análises de linhagens nocauteadas para Coup-tf2 sugerem que Coup-tf2 não regula a via Wnt/β-catenina, uma vez que não houve alterações na expressão de marcadores de mesoderme e endoderme (Fig. 23), como observado no tratamento com 4MNol (Fig. 7). Apesar de 4MNol regular a formação desses folhetos, ela ocorre de forma independente da sinalização da via Wnt/β-catenina (Fig. 8).
Além disso, os experimentos de modulação da via Wnt/β-catenina não indicaram regulação robusta da expressão de Coup-tf2, quando as análises foram feitas em CEs inteiros (Fig. 15). Interessantemente, resultados preliminares obtidos de populações já segregadas pela expressão ou não da via Wnt/β-catenina, mostraram que Coup-tf2 pode ter um papel na segregação mesoderme-endoderme uma vez que há uma tendência à expressão aumentada de
Coup-tf2 na população de células com sinalização ativa da Wnt/β-catenina quando comparada
5. Discussão
A padronização do embrião é resultado da expressão espacialmente organizada de genes para que os movimentos morfogenéticos, como por exemplo a gastrulação, ocorram de forma correta e organizada. Estudos anteriores mostraram que a via Wnt/β-catenina, uma via de sinalização essencial para a gastrulação, se encontra polarizada tanto em embriões, quanto em CE (ten Berge et al., 2008).
Em nosso laboratório, observamos que COUP-TF2 também se encontra polarizado em CE murinos e que sua expressão se encontra organizada com marcadores de folhetos germinativos, havendo localização com PAX6, marcador de ectoderme, e sem co-localização com FOXA2, marcador de endoderme (Rosa, 2015). Já a análise de BRA(T), marcador de mesoderme, apresentou células co-expressando COUP-TF2 e BRA(T) e células expressando apenas uma das duas proteínas (Rosa, 2015), fazendo com que questionássemos sobre o papel de COUP-TF2 na aquisição desse destino.
COUP-TF2 já foi estudado durante o desenvolvimento embrionário (Pereira et al., 1999) e na diferenciação terminal de diversos tipos celulares (Wu et al., 2016). No entanto, pouco se sabe sobre o papel de COUP-TF2 no início do desenvolvimento, especialmente no início da gastrulação. A gastrulação é um evento de complexas mudanças morfogenéticas que resulta na formação dos três folhetos germinativos (Arnold & Robertson, 2009). Esse processo tem como uma das vias de sinalizações mais importantes a via Wnt/β-catenina, que atua na segregação da ectoderme e mesendoderme (ten Berge et al., 2008). Nesse processo células que migram pela linha primitiva (um centro de sinalização Wnt/β-catenina) adquirem o destino mesendodérmico e células que situam em região oposta à linha primitiva e não recebem a sinalização da via Wnt/β-catenina, se diferenciam em células com destino ectodérmico (Arnold & Robertson, 2009; Rivera-Pérez & Hadjantonakis, 2015). Com base nos conhecimentos sobre o papel da via Wnt/β-catenina na gastrulação (ten Berge et al., 2008), juntamente com dados de nosso laboratório (Rosa, 2015), tivemos o interesse de estudar a relação entre a sinalização da via Wnt/β-catenina e a expressão de COUP-TF2.
Neste trabalho, uma das formas utilizadas para modular a expressão de Coup-tf2 foi o tratamento com 4MNol. Le Guével et al. (2017) observaram que a molécula 4MNol age estabilizando a conformação de COUP-TF2 no estado de auto-repressão, reduzindo a sua própria atividade transcricional, assim como observado em nosso experimento de diferenciação de CTE murinas em monocamada (Fig. 6A).
Rosa e Brivanlou (2011) observaram que COUP-TF2 regula a expressão de Oct4 durante a diferenciação de células tronco humanas. Nesse estudo, foi observado que a superexpressão de TF2 levou à redução da expressão de OCT4, indicando que COUP-TF2 reprime a expressão de OCT4. Além disso, foi mostrado que em células indiferenciadas OCT4 reprime a expressão de Coup-tf2. Assim, foi de nosso interesse analisar a expressão de
Oct4 na diferenciação de CTE murinas tratadas com 4MNol. No entanto, em nosso
experimento, o tratamento com 4MNol resultou em redução da expressão de Oct4 (Fig. 6B), efeito oposto ao observado por Rosa & Brivanlou (2011).
Um outro gene que tivemos interesse em analisar foi Coup-tf1. Tsai e Tsai (1997) mostraram que COUP-TF1 e COUP-TF2 apresentam similaridade nos DBD e LBD, indicando que esses fatores de transcrição tenham funcionalidade redundante, inclusive, a compensação da expressão entre esses dois fatores de transcrição já foi observada em diferentes contextos (Tang et al., 2010; Wu et al., 2010)
O trabalho de Tang et al. (2010) analisou a expressão de COUP-TFs durante o desenvolvimento do olho de camundongos. Nesse estudo foi observado que a deleção condicional específica para o olho de COUP-TF2 leva ao desenvolvimento normal dessa estrutura, sendo observada que a expressão de COUP-TF1 em células que antes expressavam COUP-TF2 no tipo selvagem, resultando no desenvolvimento normal do olho. Já a deleção condicional específica para o olho dos dois fatores de transcrição, COUPTF1e COUP-TF2, leva a anormalidades no desenvolvimento do órgão. No estudo de Wu et al. (2010), foram gerados camundongos com deleção condicional específica para o útero de COUP-TF2 e foram observados fenótipos como redução no número de sítios de implantação e redução na capacidade de adesão do embrião. Em seguida foi realizada a superexpressão de COUP-TF1 que foi capaz de recuperar os fenótipos alterados pela deficiência de COUP-TF2.
Em nosso experimento de tratamento com 4MNol, foi observado que o tratamento levou ao aumento da expressão de Coup-tf1 (Fig. 6C), que pode ser justificado pela compensação que pode ocorrer na expressão de Coup-tf1 diante da redução na expressão de
Coup-tf2. Além disso, a redução na expressão de Oct4 (Fig. 6B) pode não ser um efeito direto
da inativação de COUP-TF2, mas sim o efeito do aumento de Coup-tf1. Ben-Shushan et al. (1995) e Pickens et al. (2013) mostraram que Coup-tf1 atua como repressor da transcrição de
Oct4 em células murinas de carcinoma embrionário, o que justifica a redução da expressão de Oct4 diante do aumento de Coup-tf1 nas células tratadas com 4MNol (Fig. 6B e C).
Ainda no experimento de tratamento com 4MNol, a análise da expressão de marcadores de folhetos germinativos indicou que foi observada a redução da expressão do marcador de mesoderme Bra(T) (Fig. 7A) e uma tendência na redução da expressão do marcador de endoderme Foxa2 (Fig. 7B). Como a via Wnt/β-catenina tem papel fundamental na formação desses dois folhetos (Tanaka et al.,2011), realizamos a análise da expressão de
Axin2 (Fig. 8), um conhecido alvo da via Wnt/β-catenina, (ten Berge et al., 2008) e não foi
observada alterações na sua expressão, sugerindo que se a redução em Bra(T) é um efeito da inativação de COUP-TF2, ela ocorre de forma independente da sinalização de Wnt/β-catenina.
Além disso, sabe-se que COUP-TF1 é expresso na ectoderme neural (Lin et al., 2011), indicando que o tratamento com 4MNol pode estar direcionando a diferenciação para o destino ectodérmico. A redução em Bra(T) e a tendência na redução de Foxa2 (marcadores de mesoderme e endoderme, respectivamente; Fig. 7A e B), podem ser consequência do direcionamento da diferenciação para o destino ectodérmico, pois sabe-se que células que expressam marcadores ectodérmicos são capazes de inibir a formação de mesoderme e endoderme (Sineva & Pospelov, 2014). No entanto, o marcador de ectoderme que escolhemos para esse experimento, Nestin (Fig. 7C) não mostra aumento significativo na formação de ectoderme
No trabalho de Pijuan-Sala et al. (2019) foi realizada a análise de single-cell
transcriptomics durante a gastrulação do embrião de camundongo, a Figura 24A representa
graficamente as populações de células identificadas nessa análise ao longo do processo de gastrulação, agrupadas por tipo celular. Com base nesses dados, podemos observar que apesar de Nestin ser um conhecido marcador de ectoderme (Bratt-Leal et al., 2009; Fig. 24B), ele apresenta expressão mais abrangente que outros marcadores de ectoderme, como por exemplo,
Pax6 (Fig. 24C) e Sox1 (Fig. 24D). Na Figura 24B podemos observar que Nestin é expresso
inclusive em alguns precursores de mesoderme, que pode estar influenciando na não significância na alteração de Nestin observada em nosso tratamento com 4MNol.
Figura 24: Representação gráfica de single cell transcriptomic de embriões de camundongos durante a gastrulação. Células agrupadas por tipo celular (A), expressão (azul) de Nestin (B), Pax6 (C) e Sox1 (D). Imagens retiradas de:
https://marionilab.cruk.cam.ac.uk/MouseGastrulation2018/
Como observamos redução na formação de mesoderme diante do tratamento com 4MNol, porém, sem alteração na sinalização da via Wnt/β-catenina, foi de nosso interesse testar se COUP-TF2 poderia estar agindo abaixo da via Wnt/β-catenina, realizando experimentos de modulações da via. A maneira mais direta para a modulação de uma via é a adição de seu ligante. A proteína WNT3A, é um dos ligantes mais estudados da via (He et al., 2015). Assim, realizamos a ativação da via Wnt/β-catenina com o ligante WNT3A para analisar a expressão gênica de Coup-tf2 em CE formados a partir de CTE humanas.
O tratamento com WNT3A em CTE humanas apresentou redução de Pax6 (Fig. 12A) e aumento, apesar de não significativo, de Bra(T) (Fig. 12B), condizente com o conhecido papel de Wnt/β-catenina na segregação de mesendoderme e ectoderme no embrião
(ten Berge et al., 2008). O tratamento com WNT3A também resultou em uma redução de
Foxa2 (Fig. 12C), indicando redução na indução endodérmica, que contraria a conhecida ação
da via Wnt/β-catenina de induzir a formação de endoderme (Huggins et al., 2017; Qu et al., 2017). Este efeito pode ser decorrente da abrangência da via Wnt/β-catenina, que além de atuar na segregação da mesendoderme no embrião (ten Berge et al., 2008), atua na manutenção da pluripotência de CTE (Sokol, 2011). O trabalho de Huggins et al., (2017) mostrou que o tratamento com WNT3A no cultivo de CTE humanas indiferenciadas levou ao aumento na expressão de Oct4, fator de transcrição essencial para a manutenção da pluripotência (M. Li & Belmonte, 2017). Assim, a tendência de diminuição na expressão de
Foxa2 e o não expressivo aumento em Bra(T) que foi observado em nosso trabalho (Fig. 12),
pode ser explicada pela característica da via Wnt/β-catenina de manter a pluripotência, impedindo a expressão desses marcadores de folhetos germinativos. Já a análise da expressão de Coup-tf2 indicou uma tendência à redução da sua expressão, porém, não significativa (Fig. 13).
Os efeitos difusos da via Wnt/β-catenina se deve, em parte, à existência de 19 ligantes (Miller, 2002) e a modulação que realizamos consistiu na adição de apenas um deles, justificando o não expressivo aumento de Bra(T) (Fig 12B), por exemplo. Para solucionar essa questão, decidimos realizar a inibição da via através do tratamento com C59, um composto que age na via de síntese de Wnts, inibindo a enzima Pocurpine (Proffitt et al., 2013), responsável pela lipidação de Wnts, que é essencial para a sua sinalização (Grainger & Willert, 2018). Em nossos experimentos, foi observada uma robusta inibição da via Wnt, diante do tratamento com C59, evidenciada pela expressiva inibição da formação de mesoderme (Bra(T)) e endoderme (Foxa2), sem alteração na formação de ectoderme (Pax6) (Fig. 14). A análise da expressão gênica de Coup-tf2 indicou uma tendência de redução da sua expressão sob o tratamento com C59 (Fig. 15). Os resultados obtidos nos experimentos de modulação da via Wnt/β-catenina não nos permitem estabelecer uma relação clara entre a sua sinalização e os efeitos na expressão de Coup-tf2. Apesar de ser observada uma tendência à redução da expressão de Coup-tf2 sob a ativação da via (Fig. 9 e 13), observamos uma tendência de redução sob a inibição da via Wnt (Fig. 15).
Contudo, sabemos que COUP-TF2 apresenta uma expressão distinta em relação aos marcadores de folhetos germinativos, inclusive apresenta co-localização parcial com BRA(T) (Rosa, 2015). Além disso, sabe-se que COUP-TF2 tem papel na diferenciação de CTE humanas, controlando a saída da pluripotência e ativando expressão de genes para a
diferenciação neural, como Pax6 (Rosa & Brivanlou, 2011). Em nosso experimento de diferenciação em CE humanos, observamos que o protocolo de diferenciação leva a maioria das células para o destino de ectoderme, como observado pela alta expressão de Pax6, principalmente em D6 (Fig. 11A). Assim, o aumento de Coup-tf2 ao longo da diferenciação, corrobora dados de Rosa & Brivanlou (2011). Com isso, qualquer efeito que Coup-tf2 possa ter em células de destino mesendodérmico poderiam estar sendo ocultados pelo alto número de células que apresentam o destino ectodérmico, já que as análises foram realizadas a partir de todas as células dos CE.
Uma forma de focar em células de destino mesendodérmico, ou seja, que já passaram pela segregação regulada pela via Wnt/β-catenina (ten Berge et al., 2008), foi fazer o uso de CTE humanas transfectadas com TOP-GFP, repórter para a via Wnt. Assim foi de nosso interesse quantificar a expressão de Coup-tf2 em população de células que já sofreram a segregação pela via Wnt. A análise com células TOP-GFP, deram indícios de que COUP-TF2 pode estar agindo na diferenciação da mesendoderme em mesoderme e endoderme, pela maior expressão de Coup-tf2 em células GFP-positivas (Fig. 18). Além disso, um estudo anterior de nosso laboratório (Rosa, 2015), sugeriu que COUP-TF2 estaria agindo na segregação mesoderme-endoderme, colaborando para o destino mesodérmico na definição de folhetos germinativos. Entretanto, nossos resultados mostram que caso COUP-TF2 esteja influenciando na segregação mesoderme-endoderme, tal ação seria independente da via Wnt/β-catenina, uma vez que a modulação da via Wnt/β-catenina não levou a alterações significativas na expressão de Coup-tf2.
Uma outra técnica que utilizamos para a modulação da expressão de Coup-tf2, além do tratamento com 4Mnol, foi a de gerar uma linhagem nocaute (KO) para Coup-tf2 através da ferramenta CRISPR/Cas9. O uso dessa ferramenta levou à redução da expressão desse fator de transcrição em dois clones (Fig. 21A). No entanto, apesar de validarmos a ausência dos DBD e LBD (Fig. 20), e observarmos uma redução de sua expressão (Fig. 21A), esta mutação que levaria à perda de função de Coup-tf2, não afetou a expressão gênica de marcadores pluripotência ou folhetos germinativos (Fig. 22C, 23A e 23B).
O trabalho de Rosa & Brivanlou (2011) estudou a regulação de OCT4 e PAX6 por COUP-TF2 durante a diferenciação de células tronco humanas. A ausência da regulação desses genes em nosso protocolo de diferenciação de CTE murinas (Fig. 22 B e C) pode ser explicada pela característica de COUP-TF2 apresentar diferentes padrões de regulação em diferentes contextos. (Le Guével et al., 2017). Rosa & Brivanlou (2011)discutem em seu
estudo essa ação contexto-dependente de COUP-TF2, citando o trabalho de Tang et al. (2010), no qual COUP-TF2 age inibindo a expressão de Pax6 na diferenciação do olho em camundongos, ao contrário do observado por Rosa & Brivanlou (2011). A atividade contexto-dependente de COUP-TF2 já foi sugerida por diversos estudos que mostram dualidade na ação de COUP-TF2 como fator de transcrição, que pode agir tanto como repressor, quanto ativador de seus genes alvo (Litchfield & Klinge, 2012; Park, Tsai, & Tsai, 2003).
Portanto, a ação de COUP-TF2 durante a definição de folhetos germinativos, contexto estudado em nosso trabalho, pode ser diferente da ação observada, por exemplo, no contexto de diferenciação neural em células humanas do trabalho de Rosa e Brivanlou (2011). No trabalho de Rosa e Brivanlou (2011), COUP-TF2 inibe OCT4 e ativa PAX6, durante a diferenciação neural. Em nossas linhagens nocauteadas era esperado então, que na ausência de Coup-tf2, houvesse um aumento de Oct4 e redução de Pax6. No entanto, não observamos a regulação desses genes (Fig. 22B e C), indicando que COUP-TF2 não tenha papel na definição de folhetos germinativos na diferenciação em CE formados a partir de células tronco murinas.
Como a deleção de Coup-tf2 não resultou no mesmo efeito de sua inativação por 4MNol, provavelmente os efeitos divergentes observados pelos dois métodos de modulação de COUP-TF2 deve-se ao fato de que o tratamento com 4MNol pode estar agindo em outras vias que induzem a mesoderme no processo de diferenciação, como por exemplo a via FGF (Kraushaar et al., 2012), resultando na modulação da formação desse folheto (Fig. 7B) que não é observada em nossos KOs (Fig. 23B). Um ponto interessante a ser ressaltado, é o efeito destas duas condições sobre a expressão de Coup-tf1. Nas células em que COUP-TF2 foi inibido pelo tratamento com 4MNol, observamos um aumento em Coup-tf1 (Fig. 6C), já discutido anteriormente. No entanto, nas células nocauteadas para Coup-tf2, não apresentaram diferença na expressão de Coup-tf1 quando comparadas com o tipo selvagem (Fig. 22A). Indicando novamente, que o tratamento com 4MNol possa regular outros genes, além de
Coup-tf2.
Uma hipótese que pode ser levantada com esses resultados é uma possível função de dominante negativo com o tratamento de 4MNol. A alteração na conformação de COUP-TF2 descrita por Le Guével et al. (2017), pode levar a uma ação repressora de COUP-COUP-TF2 em um repressor de Coup-tf1, o que resultaria no aumento de Coup-tf1 com o tratamento com 4MNol (Fig. 25). Uma via candidata para o controle desse mecanismo é a via FGF, que já foi mostrada por inibir a expressão de COUP-TF1 na formação de córtex cerebral de
