Um dos efeitos iniciais do aumento da concentração de CO2 no ambiente é uma
elevação da fotossíntese em plantas de metabolismo C3 (SAGE e MCKOWN, 2006), o que
pode ocorrer associado com o aumento de crescimento (DAEPP et al., 2000; HIKOSAKA
et al., 2005; PÉREZ-LÓPEZ et al., 2012). No entanto, esse aumento da fotossíntese nas plantas C3 em resposta ao aumento de CO2 ambiental, pode ser afetado pelos efeitos de
fatores adversos como a deficiência mineral (POZO et al., 2007), estresse hídrico (ROBREDO et al., 2007) e salinidade (PÉREZ-LÓPEZ et al., 2012). O estresse salino pode afetar a fotossíntese por meio da restrição estomática (NETONDO et al., 2004) e efeitos metabólicos diretos (HASEGAWA et al., 200), causando inclusive danos oxidativos (DEMIRAL e TÜRKAN, 2004). Esses efeitos negativos do estresse salino podem ser atenuados, em parte, pela exposição das plantas ao elevado CO2 (PÉREZ-LOPÉZ et al., 2009;
PÉREZ-LOPÉZ et al., 2012).
Nesse estudo plântulas de cajueiro foram previamente crescidas sob condições de salinidade e em seguida expostas ao tratamento com elevado teor de CO2, visando avaliar a
interação desses fatores (salinidade x CO2) em respostas fisiológicas envolvendo a eficiência
fotossintética e a proteção oxidativa. A condutância estomática (gs) e a transpiração (E) das
plântulas foram reduzidas em cerca de 50% em resposta ao tratamento salino, enquanto o alto CO2 não afetou essas variáveis tanto na ausência quanto na presença do sal (Fig. 1A e B). A
restrição estomática imposta pela salinidade é atribuída aos efeitos osmótico/iônico (MUNNS e TESTER, 2008), enquanto as mudanças de abertura estomática em resposta ao elevado CO2
podem representar processos de aclimatação ao CO2 (AINSWORTH e ROGERS, 2007;
POZO et al., 2007).
Durante a aclimatação ao CO2 elevadoas plantas percebem e respondem ao aumento
da concentração externa de CO2 por meio de aumentos da fotossíntese e de reduções da
condutância estomática (AINSWORTH e ROGERS, 2007). No entanto, esse padrão de resposta pode variar amplamente em função da espécie vegetal (AINSWORTH e ROGERS, 2007), bem como das condições ambientais de crescimento a que estão expostas (MORGAN
et al. 2004; NOWAK et al. 2004; LEAKEY et al. 2006). Dessa forma, a não restrição estomática, em resposta ao alto CO2 observado nas plântulas de cajueiro, pode representar um
caráter dependente da espécie conforme tem sido observado para outras espécies (ELLSWORTH, 1999).
A assimilação de carbono em plantas C3 geralmente é estimulada em resposta a curtos
períodos de exposição ao aumento de CO2 ambiental (SIMMS, 2006). No entanto, a atividade
fotossintética pode ser reduzida em resposta a períodos longos (dias ou semanas) de exposição ao elevado teor de CO2 (DRAKE, 1997). Essa redução da fotossíntese, induzida pelo tempo
de exposição ao elevado CO2, tem sido atribuída a uma resposta de aclimatação que
comumente ocorre associada ao expressivo aumento do conteúdo de carboidratos foliar (CHENG et al., 1998). A fotossíntese nas plântulas de cajueiro foi reduzida pelo alto CO2 e
mais severamente ainda pela salinidade e pela combinação desses fatores, o que pode caracterizar um efeito aditivo sobre a restrição fotossintética (Fig. 1C).
Os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos com a aclimatação da fotossíntese ao alto CO2 ambiental ainda não são bem conhecidos (RAE et al., 2007). Alguns
estudos demonstram o envolvimento de carboidratos específicos na repressão da expressão de genes que codificam enzimas fotossintéticas, incluindo genes de subunidades da Rubisco (KRAPP et al., 1993), o que pode levar a reduções expressivas do conteúdo da Rubisco foliar (KRAPP et al., 1991) e na fotossíntese (IZUMI et al., 2012). O estresse salino pode induzir reduções significativas no conteúdo de Rubisco em folhas de plantas de cajueiro (FERREIRA-SILVA et al., 2010). Essa redução pode explicar, pelo menos em parte, a drástica redução da assimilação de carbono em resposta a salinidade isolada e em combinação com alto CO2 aqui observada nas plântulas de cajueiro.
As superproduções de carboidratos não estruturais em plantas expostas ao elevado CO2 podem causar redução da fotossíntese por mecanismos de retroalimentação (ARAYA et al., 2006; CENTRITO, 1999), iniciando um processo de aclimatação. Entretanto, altas concentrações de carboidratos também podem ser observadas em plantas com menores taxas fotossintéticas como reflexos da reduzida capacidade de metabolização e, consequente limitação no uso de fotoassimilados (STITT, 1991). Assim, os elevados níveis de carboidratos solúveis observados nas plântulas de cajueiro, em resposta ao alto CO2 podem ser atribuídos à
rápidos aumentos na atividade fotossintética, que no momento das avaliações já se encontravam reduzidas em resposta a aclimatação ou por uma limitada metabolização dos carboidratos, que proporcionou seu acúmulo mesmo com menores taxas de assimilação observadas em elevado CO2 (Fig.3A). Geissler et a l. (2009), atribuíram que o aumento do teor
e uma metabolização mais eficiente de carboidratos em resposta ao CO2 elevado pode
fornecer uma fonte de energia adicional, com potencial para ser utilizada em mecanismos celulares de tolerância a salinidade. Durante seu experimento o conteúdo de amido acumulou nos controles, mas não nos tratamentos salinos em alto CO2. Contrastantemente, o expressivo
teor de amido acumulado em folhas de cajueiro em alto CO2, inclusive combinado a
condições salinas (Fig. 3C), pode também ter desempenhado um papel na resistência à difusão do CO2 (EVANS et al., 2009).
Em condições de estresse salino, a assimilação do carbono tem se comportado totalmente dependente da condutância estomática, sendo esperado reduzidos valores de Ci (ASHRAF, 2004). Entretanto, neste experimento, as altas pressões externas de CO2 foi o fator
determinante às concentrações internas de CO2 e, independente da condutância estomática,
proporcionou uma elevada pressão de Ci mesmo em combinação com a salinidade. Esta ampla disponibilidade de CO2 que chegou às células do mesófilo não foi fixada na fase
carboxilativa, possivelmente por alguma limitação metabólica (SILVA et al., 2011). Em consistência, o aumento na relação A/Ci (Fig.1E), reforça a ideia que o alterado desempenho da Rubisco pode ser o principal fator às menores taxas fotossintéticas em condições de elevado CO2.
O aumento do conteúdo de proteínas solúveis em resposta ao CO2 elevado, aqui
observado (Fig. 5A), pode estar mais relacionado à degradação proteica do que ao aumento do conteúdo de Rubisco, uma vez que peptídeos com massa molecular superior a 3,0 kDa são detectáveis no método proposto por Bradford (1976). Além disso, também foram observados aumentos do conteúdo de proteína em folhas de cajueiro sob condições salinas na presença de CO2 ambiente. O estresse salino, em folhas de cajueiro, parece induzir o aumento de algumas
proteínas específicas e a redução do conteúdo de determinadas proteínas, incluindo a Rubisco (FERREIRA-SILVA et a., 2010).
Além de alterações da atividade de proteínas fotossintéticas, diversas mudanças na composição estrutural e na função do aparato fotossintético de plantas em resposta aos estresses abióticos são relatadas e demonstram envolvimento direto na eficiência da fotossíntese (BAKER, 2008). Estimativas no rendimento quântico, por meio de medidas de fluorescência da clorofila, tem se tornado uma ferramenta eficiente na análise de inibição ou danos do processo de transferência de elétrons do fotossistema II (PSII) (MASSACCI et al.
2008). O cultivo de plantas em altas concentrações de CO2 pode proporcionar um efeito
protetor ao PSII, refletido em aumentos da relação Fv/Fm (ARANJUELO et al., 2005). Por outro lado, o estresse salino parece afetar a eficiência do PSII na captação de luz, conforme reduções da relação Fv/Fm encontradas em plantas sob salinidade (AZEVEDO-NETO et al., 2011) Entretanto, nossos resultados mostram que os tratamentos de salinidade e alto CO, isolados ou combinados, não induziram diferenças significativas na eficiência máxima do
PSII (Tab. 1), sugerindo a ausência de danos e/ou alterações drásticas ao aparato fotossintético (BAKER e ROSENQVIST, 2004).
Plantas crescidas em ambiente salino apresentam valores de clorofila reduzidos consequentes da destruição da estrutura do cloroplasto, cuja enzima clorofilase degrada a clorofila (JAMIL et al., 2007) e embora estudos em condições de altos níveis de CO2 também
apresentem menores teores de clorofila devido a reduções do teor de nitrogênio (OOSTEN et al, 1995), houve um incremento de 20% no teor de clorofila quando avaliado o efeito isolado do CO2 elevado e, mesmo em condições salinas não foram observados decréscimos no
conteúdo de clorofila quando comparado ao controle (fig. 2A), podendo estar associado ao teor de nitrogênio total constante nos tratamentos. O teor de carotenóides também não foi afetado pelos tratamentos de salinidade e CO2, sugerindo a ausência de perturbações nos
sistemas de coleta de luz.
Decréscimos na fluorescência da clorofila podem refletir mecanismos de dissipações de energias fotoquímicas ou de perda de calor. O quenching fotoquímico (qP), ou coeficiente de extinção fotoquímica, representa a fração de energia dos fótons capturada pelos centros de reação do PSII abertos e dissipado via transporte de elétrons as reações fotoquímicas, refletindo o grau de oxidação da QA (BAKER, 2008). Plântulas de cajueiro expostas ao alto
CO2 e em condições combinadas da salinidade com CO2 elevado, apresentaram o qP
ligeiramente reduzido e, uma vez que o qP é menor nas plantas pode-se esperar que a suas ΦPSII e ETR sejam menores (Tab. 1) (DIAS e BRÜGGEMANN, 2010). Portanto, o fluxo de elétrons nas reações fotoquímicas podem ter sido em parte, desviado às dissipações térmicas, via ciclo das xantofilas, um componente da dissipação não fotoquímica representada pelo NPQ (IVANOV et al., 2008). O CO2 elevado proporcionou para esta variável, um pequeno
aumento em condições não salinas e foi 2,52 vezes superior durante a combinação dos fatores (Tab.1). ARANJUELO et al. (2008) observaram atenuação dos efeitos do estresse hídrico em altas pressões de CO2 por maiores níveis de NPQ associado a reduções na peroxidação de
lipídeos e na defesa antioxidativa. Embora, o aumento do NPQ seja benéfico por dissipar a energia em excesso da luz de modo a evitar foto danos ao aparelho fotossintético (DIETZ et al., 1985), ele pode funcionar como um indicativo que precede danos fotooxidativos.
Danos fotooxidativos podem ser formados por uma limitada capacidade na assimilação de CO2 e uma densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativa excedendo
seu requerimento (ARANJUELO et al., 2008). Consequentemente, a presença de carregadores de elétrons mais reduzidos podem gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) (FISHER et al.,2012). Essa limitada capacidade fotossintética foi apresentada pelas plantas
crescidas em alto CO2, salinidade e na combinação destes dois fatores, induzindo-nos a
sugerir que alterações oxidativas possam ter ocorrido em resposta a estes tratamentos. A geração de EROs pode ainda ser estimulada via fotorrespiração, fortemente induzida pela salinidade (CUSHMAN e BOHNERT, 1997). Para verificar esta hipótese foram avaliados parâmetros comumente utilizados na estimação de EROs como a peroxidação lipídica (TBARS) e o conteúdo de H2O2 (JALEEL et al., 2007). Além disso, por se tratar de um
experimento em condições salinas também adotamos a relação Na+/K+ como um indicador de que possíveis alterações oxidativas possam ter ocorrido em resposta a toxidade do Na+.
Apesar de o cajueiro ser conhecido por apresentar alta proteção oxidativa sob condições salinas (FERREIRA-SILVA, 2008), em nossos experimentos ele apresentou níveis de peroxidação lipídica (TBARS) induzidos nos tratamentos com menores taxas fotossintéticas. Contrastantemente, o conteúdo de H2O2 reduziu em resposta ao alto CO2,
aumentou pela salinidade, e reduziu novamente em condições combinadas dos fatores (Fig.4B). Mesmo em condições salinas, a relação Na+ /K+ apresentou valores inferiores a 1 (Fig. 4C), sugerindo uma possível homeostase iônica (MAATHUS e AMTMANN, 1999). Entretanto, foi capaz de desencadear alterações oxidativas, evidenciando, que os mecanismos de homeostase e toxidade iônica ainda não são totalmente compreendidos (SILVEIRA et al., 2009).
A desintoxicação as EROs é mediada por um sistema integrado de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos (MUNNS e TESTER, 2008). As enzimas dismutase do superóxido (SOD) e a peroxidase do ascorbato (APX) estão envolvidas na limpeza das EROs para minimizar os danos oxidativos (FOYER e NOCTOR, 2005). Estas enzimas atuam respectivamente em cadeia, rapidamente eliminando o superóxido produzido e posteriormente auxiliam na remoção do excesso de peróxido celular (ASSADA, 1999). A atividade destas enzimas foi divergente (Fig. 5A e B). Enquanto a atividade da SOD não diferiu significativamente nos tratamentos de salinidade e alto CO2, isolados ou combinados, a
atividade da APX apresentou tendência semelhante ao comportamento do H2O2. Em geral, o
status antioxidante da planta é conhecido por ser uma resposta ao estresse oxidativo (POLLE, 1996). Portanto, assim como observado em outras pesquisas, a redução nas atividades de enzimas antioxidantes poderia refletir uma redução do estresse oxidativo resultante do crescimento em ambientes com alto CO2 (PERÉZ- LOPEZ et al., 2009; SALAZAR-PARRA et al., 2010).
O metabolismo antioxidativo não enzimático envolve a participação de compostos orgânicos como os fenólicos e nitrogenados (PANG e WANG, 2008) que atuam na proteção
de macromoléculas, e na manutenção do turgor (BRAY et al., 2000). Representando estas classes, foram avaliadas as relações entre o conteúdo de flavonóides, antocianinas, aminoácidos solúveis totais e prolina com as alterações oxidativas, aqui observadas. Plantas crescidas em substrato salinizado apresentaram aumentos no teor destes metabólitos, sobretudo quando combinado ao alto CO2, exceto na concentração de prolina. As
concentrações de prolina reduziram, quando comparada dentro dos tratamentos salinos, pelo alto CO2. O fato do CO2 elevado, em combinação com a salinidade, ter estimulado maiores
acúmulos de aminoácidos, flavanóides e antocianinas, em relação ao tratamento salino isolado, pode ter sido uma resposta reforçada de proteção a tensões geradas pelo aumento da pressão de CO2 associado à salinidade. Tal possibilidade explicaria o aumento de TBARS em
alto CO2. Além disso, ARANJUELO et al. (2008) atribui que o efeito fotoprotetor ocasionado
pelo alto CO2, com maiores valores de NPQ, não envolve a participação do metabolismo
antioxidativo, podendo sua expressão ser um indicativo de alterações oxidativas.
Singularmente, o conteúdo de antocianinas sofreu acréscimo pelo alto CO2,
independente dos tratamentos salinos. A biossíntese de antocianinas é bem relacionada a altos níveis de açúcares, principalmente sacarose (TALLIS et al., 2009). Existe evidências entre uma ligação direta entre o CO2 elevado, aumento da relação C:N nas folhas e aumento da
atividade da fenilalanina amônia liase (PAL), enzima chave que catalisa o primeiro passo na biossintese de fenilpropanóides, com concomitante aumento de metabólitos secundários (MATROS et al., 2006).
Folhas de mudas de cajueiro crescidas em CO2 elevado não apresentaram alterações
significativas no conteúdo de prolina em relação ao controle. Entretanto, a salinidade induziu fortemente seu acúmulo e, quando combinado ao alto CO2 apresentou acúmulos bem mais
brandos. Ainda que não esteja evidente se a acumulação de prolina é um traço adaptativo útil ou simplesmente uma resposta induzida por uma lesão fisiológica (SILVEIRA et al., 2003), plantas de cajueiro incrementam o acúmulo de prolina conforme aumenta o nível de salinidade (FERREIRA-SILVA et al., 2010). O reduzido conteúdo de prolina, na combinação dos fatores, pode ter sido tanto uma consequência na redução de sua biossíntese, quanto pela sua degradação.
Ambos os processos, de síntese e degradação de prolina, são tidos como benéficos a plantas estressadas. Sua presença auxilia na manutenção do ajuste osmótico e na proteção contra danos oxidativos (OKUMA et al. 2004; PARK et al. 2006; MOLINARIET et al. 2007), enquanto que sua degradação pode fornecer equivalentes redutores necessários para o suporte de transporte de elétrons mitocondrial e a geração de ATP para a recuperação e
reparação dos danos induzidos pelo estresse (SZABADOS e SAVOURE, 2010). Entretanto, mudanças no metabolismo da prolina, por biossíntese ou degradação, podem ser indicativos da presença de condições estressantes, estando seu acúmulo e/ ou degradação uma resposta a atenuar estes danos. Notavelmente, em condições não salinas, o acúmulo de prolina em CO2
elevado foi similar ao controle, não sendo então, necessária sua biossíntese para atenuar prováveis danos ocasionados pelo alto CO2.
Diante destas informações, presumisse dizer, que apesar de poucas variáveis avaliadas quanto ao metabolismo oxidativo, inicialmente a salinidade induziu uma peroxidação lipídica, a qual o CO2 elevado não foi capaz de atenuar. E aparentemente o alto CO2 a estimulou, por
motivo ainda desconhecido e, associado a outras variáveis mencionadas, o cultivo de mudas de cajueiro em CO2 elevado tem, até este ponto, se revelado como um fator negativo a
fotossíntese e proteção oxidativa. No entanto, o comportamento destas plantas, nestas condições, apresentou uma tendência conflitante, sobretudo quando foi capaz de reduzir, consistentemente, o conteúdo de H2O2 em 32%, quando comparado em comum aos
tratamentos sob estresse salino.
Tal redução pode ser atribuída a menores condições fotorrespiratórias, visto que a atividade da enzima glicolato oxidase, primeira enzima comprometida com o ciclo do glicolato, aumentou pelo tratamento salino e posteriormente reduziu sua atividade em condições salinas com alto CO2 (Fig. 5 D). Ainda embasando esta proposição, o teor de
glioxilato, produto da reação catalisada pela GO, teve reduções, comparado ao controle, em torno de 23% nos tratamentos em CO2 elevado (Fig. 4D). O principal sítio de formação de
H2O2 está localizado nos peroxissomos, podendo este ser liberado na reação catalisada pela
GO (FOYER et al., 2009). Portanto menor atividade de GO pode ter proporcionado menor conteúdo de glioxilato e H2O2.
O conteúdo de NH3 também reduziu no cultivo em alto CO2, independente dos
tratamentos salinos (Fig. 6A). Por se estimar que a produção de amônia por fotorrespiração seja de uma ordem de magnitude maior que a assimilação primária, resultante da redução de nitrato (CHAVES et al., 1978) também pode ser correlacionada a atividade do ciclo do glicolato. Por sua vez, a amônia, liberada na reação catalisada pela glicina descarboxilase (GDC), é reincorporada a glutamina no cloroplasto, pela atividade da sintetase da glutamina plastídica (GS-2) (LEEGOOD et al., 1995).
Nestes experimentos, em CO2 elevado, foram observadas atividades de GS-2
fortemente expressadas, quando comparadas aos seus análogos pelo fator salino. Similarmente, o fator salino também reduziu a atividade desta enzima mostrando uma
interação positiva com as concentrações ambientes de CO2 (Fig. 6F). Teoricamente, eram
esperados menores atividade de GS-2, devido a redução da fotorrespiração pelo alto CO2
combinado com menores níveis de amônia. Entretanto, esta resposta não foi obsevada neste estudo e, possivelmente pela alta atividade da GS-2, os níveis de amônia podem ter decaído por estarem sendo assimilados à glutamina (Fig. 6A). Contudo, ainda resta uma objeção: O cultivo em CO2 elevado não teria sido uma ferramenta eficiente quanto à redução da atividade
fotorrespiratória? Visto que, estes valores elevados de GS-2 podem ser indicativos que a fotorrespiração esteve presente?
Tal observação contradiz a premissa de que cultivos de plantas C3 em CO2 elevado
tendem a reduzir a atividade fotorrespiratória, devido a maior disponibilidade de CO2 ao sítio
ativo da Rubisco e redução da sua atividade oxigenase (AINSWORTH e ROGERS, 2007). Em resposta ao efeito isolado da salinidade em CO2 ambiente a atividade da GS-2 foi reduzida
pela metade (Fig. 6F) e considerando que o estresse salino estimula a fotorrespiração (GEISSLER, 2009), e não a reduz, a atividade da GS-2 não pode ser utilizada como uma variável de avaliação da atividade fotorrespiratória.
Além disso, outra abordagem quanto ao papel desempenhado pela GS-2 em plantas crescidas em CO2 elevado tem despontado. Indiferentes alterações nos níveis de transcritos de
GS-2 foram observadas em Arabidopsis thaliana e tabaco crescidas com atmosfera com 3000 µ l l-1 de CO2, cuja fotorrespiração encontrava-se suprimida (BECKMANN et al., 1997;
MIGGE et al.,1997). Assim como, também foram observadas maiores atividades da GS-2 em
girassol exposto à crescente atmosfera de CO2 (LARIOS et al., 2004). Ressaltando a estreita
relação entre o metabolismo do carbono e do nitrogênio, estes autores sugeriram que o aumento da atividade desta enzima em alto CO2 é positivamente modulada pela assimilação
de CO2, através da formação de açúcares, e não por elevada fotorrespiração.
Larios et al. (2004) baseados em Koch (1996) explicam que genes fotossintéticos são tipicamente regulados por depleção de açúcares, enquanto que a abundância de açúcares aumenta a expressão de genes para o armazenamento e utilização de carbono. Assim, a assimilação de nitrato, que inclui a redução de nitrato e posterior assimilação de amônio, requer esqueletos de carbono derivados de açúcares para síntese de aminoácidos. Apesar de algumas pesquisas relatarem que o CO2 elevado inibe a assimilação do nitrato (BLOMM,
2010), o maior acúmulo no teor de carboidratos pode ter estimulado a utilização de nitrato através do reforço da expressão e atividade da NR e nitrito redutase e também da GS-2 (Fig. 6F). Posteriormente, em plantas aclimatadas, poderia ser alcançado um estágio onde o maior
acúmulo no teor de carboidratos fosse maior que a capacidade das plantas em adquirir nitrogênio, resultando numa alta relação C:N (BLOMM, 2010).
Em resposta a salinidade, plantas de arroz transformadas que superexpressão GS-2 apresentaram, em relação ao tipo selvagem, maior tolerância a 150 mM de NaCl e, tal tolerância ainda foi constante quando a fotorrespiração foi inibida na presença da hidrozida do ácido iso-nicotínico (HOSHIDA et al., 2000). Baseado nisto, e relacionando a algumas respostas já discutidas, a atividade da GS-2 pode atuar na atenuação do estresse salino nas plantas. Devido ao consumo do excedente da amônia fotorrespiratória produzida na primeira fase experimental (antes dos tratamentos em elevado CO2), ou por aumentar a eficiência da
planta ao nitrogênio, estimuladas pelo alto CO2.