Considerando os achados nesse trabalho, a melatonina não teve efeito no cultivo embrionário para estes grupos, porém ficou claro que a qualidade embrionária do grupo SOP foi inferior ao grupo placebo e controle.
A piora da qualidade embrionária observada no grupo SOP ocorreu a partir do início do desenvolvimento, onde se teve um atraso desde o momento da clivagem que persistiu até estágio de blastocisto, na avaliação morfológica e TUNEL. Entretanto, o TUNEL não demonstrou diferença estatística no número de células apoptóticas, porém apresentou um menor número de células totais nos blastocistos. Além disso, foi observado que o grupo placebo também tem uma menor taxa de clivagem, mórula e blastocisto se comparado ao grupo controle, mostrando que mesmo os camundongos não sofrendo indução à SOP quando recém-nascidos, somente o fato de sofrer algum estresse nessa fase, pode ter afetado de alguma forma a fertilidade desses camundongos. O grupo controle suplementado com melatonina teve melhora em todos os parâmetros analisados em comparação aos demais grupos.
6.1 Taxa de blastocisto e qualidade embrionária
Sabe-se que mulheres com SOP apresentam pior qualidade oocitária e, consequentemente, pior qualidade embrionária, assim como um desenvolvimento embrionário mais tardio em comparação a mulheres sem SOP. Essa característica foi observada em nosso experimento, tanto em relação ao desenvolvimento quanto em relação a qualidade dos embriões de camundongos induzidos à SOP, corroborando com o que é reportado na literatura (Sundvall et al., 2015, Zhang et al., 2019). Um dos motivos relacionados a essa piora na qualidade oocitária e embrionária pode estar ligado à menor concentração intrafolicular de melatonina em comparação a mulheres sem SOP (Tamura et al., 2009).
Por conta dessa menor concentração de melatonina no ambiente intrafolicular, há um desequilíbrio entre as concentrações de substâncias oxidantes e antioxidantes, levando esse ambiente a um estresse oxidativo, que também é um dos motivos de ocorrer a perda de qualidade oocitária (Tagliaferri et al., 2017), junto com o fato do cultivo in vitro em si causar mais estresse oxidativo comparado ao ambiente in vivo
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em condições normais (Choi et al., 2008). Essa produção excessiva de ROS em ambos os casos possuem efeito deletério ao embrião, no qual reage com os lipídeos presentes em sua membrana, causando danos em moléculas celulares, resultando em perda da integridade da membrana, mudanças estruturais ou funcionais em proteínas e danos ao DNA (Tamura et al., 2012).
A melhora na taxa de clivagem e blastocisto era esperada por conta das diversas propriedades apresentadas pela melatonina, nesse caso, ocorre em parte pela característica que a melatonina tem de diminuir a expressão de genes pró- apoptóticos (BAX e caspase-3) e de induzir a expressão de genes anti-apoptóticos (Bcl-2), além de aumentar a concentração intracelular do antioxidante glutationa e reduzir a produção de ROS. Essas características além de melhorar o desenvolvimento e qualidade embrionária, também diminuem o grau de apoptose em blastocistos (Reiter et al., 2009; Gao et al., 2012; Mohseni et al., 2012; Wang et al., 2013).
Nosso estudo revelou que a suplementação do meio de cultivo com melatonina não obteve resultado estatisticamente significativo no grupo SOP em relação a qualidade e desenvolvimento embrionário, no qual apresentou uma porcentagem menor na taxa de blastocisto em comparação ao grupo SOP sem suplementação. Em relação ao grupo controle e placebo que foram suplementados com melatonina, ambos apresentaram uma maior porcentagem em relação a taxa de clivagem e blastocistos em comparação aos mesmos grupos que não foram suplementados. A taxa de mórula no caso do grupo controle foi menor no grupo suplementado com melatonina pelo fato da maioria dos embriões já estarem em estágio de blastocisto em D4. Em relação a qualidade embrionária, apenas o grupo controle obteve uma pequena melhora com a suplementação de melatonina, que não apresentou diferença estatisticamente significante quando comparado com o grupo controle sem melatonina.
Os resultados encontrados em relação ao grupo SOP não corresponderam com o reportado na literatura (Ishizuka et al., 2000; Wang et al., 2013; Dehghani- Mohammadabadi et al., 2014). Um dos fatores limitantes para esse resultado pode estar relacionado com a concentração de melatonina suplementada no meio de cultivo. A concentração de escolha de 10-6 mol/L foi relatada como eficiente em camundongos em condições normais (Ishizuka et al., 2000). A melatonina em concentrações altas (10-3 mol/L) em condição sem SOP pode interferir no
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desenvolvimento embrionário, com diminuição na taxa de blastocisto e no número de blastômeros (Wang et al., 2013), o que pode indicar que em condição com SOP a concentração escolhida seja alta e exista a necessidade da diminuição dessa concentração no meio de cultivo para que ocorra resultados positivos.
6.2 TUNEL
O teste de TUNEL é normalmente utilizado para identificar a presença de fragmentação de DNA resultante da cascata de sinalização da apoptose (Penaloza et al., 2006). A apoptose, também conhecida como morte programada, é importante para o desenvolvimento embrionário, uma vez que é responsável pela eliminação de celular anormais, garantindo um bom desenvolvimento embrionário (Zakeri et al., 2015). Para que a apoptose aconteça, ocorre a ativação e regulação de diversos fatores incluindo p53, BAX, Bcl-2, TNF-α e caspase-3 (Salakou et al., 2007; Cardaci et al., 2008). No entanto, em condições que ocorram um aumento do estresse oxidativo, como a SOP ou o próprio cultivo in vitro, pode gerar um aumento da apoptose, o que resulta em uma alta fragmentação de DNA e, consequentemente, um desenvolvimento embrionário lento ou até mesmo a parada do desenvolvimento (Nánássy et al., 2008; Choi et al, 2008).
Como citado anteriormente, a melatonina é capaz de regular a Bcl-2, um gene antiapoptóticos, e diminuir expressão gênica de BAX e caspase-3, que são genes pró- apoptóticos, o que é de extrema importância para a diminuição do grau de apoptose em blastocistos e, consequentemente, a melhora do desenvolvimento e viabilidade embrionária (Reiter et al., 2009; Gao et al., 2012; Mohseni et al., 2012; Wang et al., 2013).
Ao contrário do esperado, o grupo SOP com suplementação de melatonina não respondeu tão bem ao tratamento, apesar de apresentar um maior número de células totais, apresentou também um maior número de células apoptóticas em comparação ao grupo SOP sem suplementação. No entanto, o grupo SOP em ambas condições de cultivo, apresentou um menor número de células totais e maior relação entre células apoptóticas e totais em comparação aos grupos placebo e controle, também em ambas condições de cultivo.
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O grupo placebo que não recebeu suplementação com melatonina obteve um maior número de células totais, porém um maior número de células apoptóticas em comparação ao grupo placebo que recebeu a suplementação.
O grupo com melhor resposta a suplementação de melatonina, o grupo controle, obteve um maior número de células totais e um menor número de células apoptóticas em comparação ao grupo controle sem suplementação.
O aumento na quantidade de blastômeros era esperado em todos os grupos que foram suplementados com melatonina, corroborando com o que já foi reportado na literatura (Choi et al., 2008; Wang et al., 2013; Dehghani-Mohammadabadi et al., 2014). O fato do grupo SOP que recebeu a suplementação de melatonina ter um maior número de células apoptóticas também ocorre provavelmente pela concentração de melatonina escolhida (Ishizuka et al., 2000) que apenas surtiu efeito em relação ao grupo controle, também sugerindo que para melhorar esse parâmetro seja necessário a adequação da concentração de melatonina.
O maior número de blastômeros associados com um menor número de células apoptóticas encontradas no grupo controle suplementado com melatonina se dá as propriedades já citadas da melatonina em regular genes anti-apoptóticos junto com a propriedade antioxidante da melatonina (Reiter et al., 2009; Gao et al., 2012; Mohseni et al., 2012; Wang et al., 2013), capaz de agir tanto diretamente nas ROS quanto em se ligar no receptor MT1 encontrados nas membranas dos blastocistos (Sampaio et al., 2012; Dehghani-Mohammadabadi et al., 2014), para estimular a expressão gênica dos genes em questão.
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