MARCELA DE OLIVEIRA PINHEIRO
O EFEITO DA MELATONINA NO CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES
MURINOS PROVENIENTES DE MODELOS EXPERIMENTAIS DE
SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
SÃO PAULO 2020
MARCELA DE OLIVEIRA PINHEIRO
O EFEITO DA MELATONINA NO CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES
MURINOS PROVENIENTES DE MODELOS EXPERIMENTAIS DE
SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Edson Guimarães Lo Turco
SÃO PAULO 2020
Pinheiro, Marcela de Oliveira.
O efeito da melatonina no cultivo in vitro de embriões murinos provenientes de modelos experimentais de síndrome dos ovários policísticos / Marcela de Oliveira Pinheiro. – São Paulo, 2020.
xvii, 37f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Medicina (Urologia).
Título em inglês: The effect of melatonin on in vitro culture of murine embryos from experimental models of polycystic ovary syndrome
1.síndrome do ovário policístico 2.melatonina 3.desenvolvimento embrionário 4.camundongos
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM UROLOGIA
Chefe do Departamento: Prof. Dr. José Carlos Costa Baptista Silva
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MARCELA DE OLIVEIRA PINHEIRO
O EFEITO DA MELATONINA NO CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES
MURINOS PROVENIENTES DE MODELOS EXPERIMENTAIS DE
SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS
Presidente da banca:
Prof. Dr. Edson Guimarães Lo Turco
Banca examinadora:
Profª. Drª. Daniela Paes de Almeida Braga Mattar Profª. Drª. Paula Intasqui Lopes
Profª. Drª. Sylvia Sanches Cortezzi
Suplente:
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“As nuvens mudam sempre de posição, mas são sempre nuvens no céu. Assim devemos ser todo dia, mutantes, porém leais com o que pensamos e sonhamos; lembre-se, tudo se desmancha no ar, menos os pensamentos”.
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Aos meus queridos pais, que acreditaram e me apoiaram durante essa caminhada.
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Agradecimentos
Dedico este trabalho aos meus pais, Claudia e Reinaldo, que sempre me apoiaram em minhas decisões e fizeram o possível para me dar boas instrução e educação. Aos meus avós maternos, Vilma e Vanildo, que não estão mais entre nós, mas que ajudaram a mim e meus pais em momentos de dificuldades e graças a eles, pude seguir a profissão que escolhi. Aos meus tios, Cátia e Wagner, que sempre me ajudaram e acreditaram no meu potencial.
Agradeço a Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e ao Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME), onde este trabalho foi realizado, e ao meu orientador Prof. Dr. Edson Guimarães Lo Turco, por ter confiado em mim para realizar esse trabalho, sempre me auxiliando quando necessário.
Aos amigos que adquiri nesses 2 anos no Centro de Pesquisa em Urologia, Gabrielle, Dóris, Luana, Karla, Ana, Laura, Valter, por toda troca de conhecimento, ajuda nos experimentos, horas do almoço e happy-hours. Com certeza fizeram dos meus dias dentro do laboratório os melhores.
Aos meus amigos de Santos, Ana Vitória, Stephanie, Tuanny, Natasha, Mariana, Debany, Arthur, Julianna e tantos outros, por ouvir meus medos e receios sobre meu trabalho e meu potencial, sempre me proporcionando momentos de risada, divertimento e até lágrimas. Minha vida não seria a mesma sem vocês.
Aos professores do programa de pós-graduação em Urologia e do Departamento de Histologia, onde pude fazer uma pequena parte do meu projeto, sem a estrutura oferecida, não seria possível a realização do projeto.
viii
Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, participaram da realização do meu trabalho, espero que um dia eu possa ter o mesmo impacto na vida de vocês como vocês tiveram na minha. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida (nº do processo: 133510/2018-2).
ix Sumário Dedicatória...vi Agradecimentos...vii Lista de figuras...x Lista de quadros...xi Lista de tabelas...xii
Lista de siglas e abreviaturas...xiii
Resumo...xv Abstract...xvii 1. INTRODUÇÃO...1 2. HIPÓTESES...8 3. OBJETIVO...9 4. MÉTODOS...10 4.1 Delineamento experimental...10 4.2 Indução à SOP...11 4.3 Estimulação Ovariana...11 4.4 Coleta de zigotos...12
4.5 Comprovação do modelo de SOP...12
4.6 Cultivo embrionário...13
4.6.1 Diluição da melatonina...13
4.7 Análise morfológica dos embriões...14
4.8 Análise de detecção de apoptose pelo teste TUNEL...16
4.9 Análise estatística...17
5. RESULTADOS...18
5.1 Avaliação das taxas de clivagem, mórula e blastocisto...18
5.2 Classificação morfológica dos blastocistos...21
5.3 Teste TUNEL nos blastocistos...23
6. DISCUSSÃO GERAL...25
6.1 Taxa de blastocisto e qualidade embrionária...25
6.2 TUNEL...28
7. CONCLUSÃO...30
x
Lista de figuras
Figura 1. Exemplo de ovários normais e ovários policísticos...2 Figura 2. Síntese da melatonina...4 Figura 3. Fluxograma do delineamento experimental...10 Figura 4. Corte histológico de ovários dos camundongos utilizados no experimento
em microscópio óptico em aumento de 40x...13
Figura 5. Gráfico de barras representando os dados da clivagem dos embriões em
D2, de acordo com o teste Qui-Quadrado. Taxa expressa em porcentagem. *** p < 0,0001...18
Figura 6. Gráfico de barras representando os dados de taxa de mórula dos embriões
em D4, de acordo com o teste Qui-Quadrado. Taxa expressa em porcentagem. *** p < 0,0001...19
Figura 7. Gráfico de barras representando os dados de taxa de blastocisto dos
embriões em D5, de acordo com o teste Qui-Quadrado. Taxa expressa em porcentagem. *** p < 0,0001...20
Figura 8. Micrografia em microscópio óptico invertido em aumento de 100x do cultivo
do experimento de desenvolvimento embrionário no estágio de blastocisto...23
Figura 9. Micrografia em microscópio invertido de fluorescência em aumento de 100x
xi
Lista de quadros
Tabela 1: Critério de classificação para estágio de blastocisto...15 Tabela 2: Critério de classificação de blastocisto pela SART...15
xii
Lista de tabelas
Tabela 1. Dados descritivos do índice de qualidade da classificação morfológica dos
blastocistos. Comparação por GLM com média ± desvio padrão, intervalo de confiança de 95% e valor de p. Foram incluídos os valores de tamanho de efeito (Eta square) e poder observado...21
Tabela 2. Dados descritivos da classificação morfológica dos blastocistos em relação
a blastocele, MCI e TE. Comparação por Kruskal Wallis com mediana, intervalo interquartil, quartil 1, quartil 3 e valor de p...22
Tabela 3. Dados descritivos do teste TUNEL em blastocistos. Os grupos foram
comparados por GLM. Além de média ± desvio padrão, intervalo de confiança 95% e valor de p. Foram incluídos os valores de tamanho de efeito (Eta square) e poder observado...23
xiii
Lista de siglas e abreviatura
AA-NAT Arilakilamina N-acetiltransferase
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
BAX Bcl-2 associated protein X
Bcl-2 B-cell lymphoma protein 2
BSA Bovine sérum albumin
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
CSCM-C Continuous Single Culture Medium Complete
D2 Dia 2
D4 Dia 4
D5 Dia 5
DAG Diaceilglicerol
DAPI 4’ 6-diamidino-2-fenilildol dihidrocloreto
DNA Ácido desoxirribonucleico
ECG Gonadotrofina coriônica equina
FITC Isotiocianato de fluoresceína
GLM General Linear Model
GPMc Monofosfato cíclico de guanosina
GSH-Px Glutationa peroxidase
GSH-Rd Glutationa redutase
HDL Lipoproteína de alta densidade
HEPES Hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid HIOMT Hidroxi-indol-O-metiltransferase
IP3 Fosfatidil inositol-3
LDL Lipoproteína de baixa densidade
MCI Massa celular interna
NA Noradrenalina
NOS Espécie reativa de nitrogênio
NPV Núcleo paraventricular
NSQ Núcleo supraquiasmático
PBS Phosphate buffered saline
xiv
PMSG Soro gonadotrófico de égua grávida
ROS Espécie reativa de oxigênio
SART Society for Assisted Reproductive Technology
SOD Superóxido dismutase
SOP Síndrome do ovário polícistico
TE Trofectoderma
TNF-α Fator de necrose tumoral α
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Resumo
Introdução: A síndrome do ovário policístico é marcada principalmente pelo aumento
da produção de andrógenos no organismo. Ocorrem alterações no eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e adrenal, responsáveis por alterar os níveis de cortisol e melatonina. A melatonina é conhecida por ser o hormônio do sono. Entretanto, é responsável por vários outros papéis importantes no organismo, agindo como antioxidante, antitumoral, anti-inflamatório e imunomodulador. Na medicina reprodutiva tem sido estudada para tratamento oral, inclusive para SOP, e na suplementação in vitro de gametas e embriões. Objetivo: Analisar o efeito da suplementação do meio de cultura embrionário com melatonina no desenvolvimento e na qualidade de embriões provenientes de modelos experimentais murinos com e sem SOP. Métodos: Este estudo utilizou camundongos da linhagem C57BL/6J, divididos em 3 grupos: Grupo SOP (20µL de cipionato de testosterona), Grupo placebo (20µL de óleo de amendoim) e Grupo controle. Os embriões obtidos em cada grupo foram divididos e cultivados em meio CSCM, suplementado ou não com melatonina. Ao atingir o estágio de blastocisto, foi avaliado: (i) taxa de clivagem, mórula e blastocisto; (ii) classificação morfológica dos blastocistos; (iii) fragmentação de DNA em blastocistos por TUNEL. Os dados foram comparados com o auxílio do programa SPSS 18 e utilizou-se o teste de ANOVA com posthoc de Bonferroni no modelo linear generalizado (GLM) com um alpha de 5%. Resultados: Foi observado que a taxa de blastocisto foi inferior no grupo SOP (mel: 12,6%, s/mel: 14,17%) em relação aos grupos placebo e controle (plac mel: 53,71%, plac s/mel: 40,99%, contr mel: 78,02%, contr s/mel: 69,33%), no qual a suplementação com melatonina não obteve o efeito de melhora no desenvolvimento embrionário. Com relação a classificação morfológica, não houve diferença estatística entre os grupos. No teste de fragmentação apoptótica, o grupo SOP apresentou maior número de células apoptóticas (5,9±1,41) em comparação ao grupo sem suplementação (4,6±0,94). O grupo placebo e controle suplementados com melatonina (plac mel:3,7±0,3, contr mel: 4,8±0,61) apresentaram menor número de células apoptóticas em comparação aos grupos não suplementados (plac s/mel: 4,0±0,43, contr s/mel: 4,9±0,79). Conclusão: A suplementação de melatonina in vitro não teve impacto no desenvolvimento embrionário. Entretanto, ela pode ter influência em relação a apoptose.
xvi
Palavras-chave: síndrome do ovário policístico, melatonina, desenvolvimento
xvii
Abstract
Background: Polycystic ovary syndrome mainly marked by increased production of
androgens in the body. Changes occur in the hypothalamus-pituitary-gonadal and adrenal axis, responsible for altering the levels of cortisol and melatonin. Melatonin known to be the sleep hormone. However, it is responsible for several other important roles in the body, acting as an antioxidant, anti-tumor, anti-inflammatory and immunomodulator. In reproductive medicine, it been studied for oral treatment, including PCOS, and in vitro supplementation of gametes and embryos. Objective: Analyze the effect of embryo culture medium with melatonin supplementation on the development and quality of embryos from experimental murine models with and without PCOS. Methods: This work used C57BL/6J mice strain divided into 3 groups: PCOS group (20µL of testosterone cypionate), placebo group (20µL of peanut oil) and control group. The embryos obtained in each group divided and cultured in CSCM medium with or without melatonin supplementation. Upon reaching the blastocyst stage, was evaluate: (i) cleavage, morula and blastocyst rate; (ii) morphological assessment of blastocysts; (iii) DNA fragmentation in blastocysts by TUNEL. The data were compared with the aid of the SPSS 18 program and the ANOVA test with Bonferroni posthoc was used in the generalized linear model (GLM) with an alpha of 5%. Results: It observed that blastocyst rate was lower in the PCOS group (mel: 12,60%, w/mel: 14,17%) compared to placebo and control groups (plac mel: 53,71%, plac w/mel: 40,99%, contr mel: 78,02%, contr w/mel: 69,33%), in which melatonin supplementation did not have the effect of improving embryonic development. Regarding the morphological assessment, there was no statistical difference between the groups. In the apoptotic fragmentation test, the PCOS group presented a higher number of apoptotic cells (5,9±1,41) compared to the group without supplementation (4,6±0,94). The placebo and control group supplemented with melatonin (plac mel:3,7±0,3, contr mel: 4,8±0,61) presented a lower number of apoptotic cells compared to the non-supplemented groups (plac w/mel: 4,0±0,43, contr w/mel: 4,9±0,79). Conclusion: In vitro melatonin supplementation had no impact on embryonic development. However, it can have an influence on apoptosis.
1
1 INTRODUÇÃO
A infertilidade é uma doença definida como “incapacidade do casal de obter gravidez após um ano de relações sexuais regulares sem uso de contracepção” (WHO, 2004). Sabe-se que ambos os gêneros são igualmente responsáveis pelas causas de infertilidade, sendo as principais o fator masculino, disfunção ovulatória ou fator tubário (Kakarla, Bradshaw, 2008). A principal disfunção ovulatória é a síndrome dos ovários policísticos (SOP), caracterizada por um desequilíbrio endócrino e é considerada o problema mais frequente em mulheres em idade reprodutiva (Ehrmann, 2005). Essa síndrome promove o aumento da produção de andrógenos no organismo e, para ser diagnosticada, é necessária a exclusão de outros fatores que causam irregularidade menstrual e hiperandrogenismo, além de ser necessária a presença de pelo menos mais dois dos seguintes critérios: oligo e/ou anovulação, sinais clínicos e/ou bioquímicos de hiperandrogenismo e morfologia policística dos ovários (Figura 1) (The Rotterdam ESHRE/ASRM-sponsored PCOS consensus workshop group, 2012). Além da irregularidade menstrual e dos cistos ovarianos, o hiperandrogenismo pode se manifestar de outras formas, apresentando sintomas como hirsutismo, acne, seborreia, alopecia e obesidade (Moura et al., 2011). Por ser uma disfunção endócrina, há também distúrbios bioquímicos relacionadas à SOP como resistência insulínica, intolerância à glicose, dislipidemia, marcada principalmente pelo aumento de LDL e triacilglicerol e diminuição de HDL (Dunaif, 2006), além de aumentar a probabilidade de hipertensão, doenças cardiovasculares e complicações psicológicas, como depressão e estresse social (Galazis et al., 2013; Gao et al., 2013).
2
Fonte: Adaptado de Inácio (2015).
Figura 1. Exemplo de ovários normais e ovários policísticos.
A fisiopatologia da SOP ainda não está totalmente esclarecida, diversos estudos mostram que esse distúrbio pode ser de caráter multifatorial e que possivelmente há uma contribuição genética para seu desenvolvimento (Huang et al., 2018). Além disso, foi observado nessas mulheres um estado pró-oxidante intrínseco, resultado de um desequilíbrio entre o excesso de substâncias oxidantes na presença de poucos antioxidantes, onde pode haver um papel adicional em determinar, manter e piorar as manifestações observadas nas mulheres com essa condição (Tagliaferri et al., 2017). Também foi observado uma elevação em fatores inflamatórios como fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucinas 18 e 6, onde a SOP pode estar também associada com um processo inflamatório (Dawood et al., 2018).
Como resultado das alterações endócrinas e metabólicas, há alterações no eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e adrenal que resultam em uma maior circulação de andrógenos em seu organismo, similar a fase folicular inicial (Ferreira, Motta, 2017) e uma alteração nos níveis de cortisol e melatonina, levando a distúrbios do sono (Fernandez et al., 2018). Ocorre deficiência na retirada de estrógeno e progesterona que associado com as alterações no metabolismo da glicose, moléculas de adesão, citocinas, cascata inflamatória e a condição pró-oxidativa, leva a um desequilíbrio na função uterina que pode causar falha de implantação com consequente infertilidade e aumento de chance de desenvolver câncer endometrial (Ferreira, Motta, 2017).
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A melatonina é o principal hormônio produzido e secretado pela glândula pineal, uma pequena glândula que se desenvolve a partir do diencéfalo, por trás do terceiro ventrículo (Franklin, Epstein, Amnon Brzezinski, 1997). Sua produção não se limita apenas à glândula pineal, pois sua síntese pode ocorrer na retina, ossos, pele, intestino, plaquetas, bile, timo, baço, coração, músculo esquelético, fígado, estômago, placenta, testículos, ovários, córtex cerebral e corpo estriado (Stefulj et al., 2001; Sanchez-Hidalgo et al., 2009; Acuña-Castroviejo et al., 2014), essa produção é importante para ação parácrina, autócrina e intrácrina na regulação do estresse oxidativo (Luchetti et al., 2010) e na modulação imunológica (Carrillo-Vico et al. 2004). É um hormônio do tipo indolamina, conhecido por ser o hormônio do sono, onde é responsável pela regulação do ritmo circadiano, variações sazonais, ciclo claro/escuro e redução da temperatura corporal (Arendt, Skene, 2005), sendo o responsável pela indução do sono, visto que a melatonina se liga aos receptores de vasos periféricos, gerando vasodilatação (Van der Halm-van Mil et al., 2003), e aos receptores do centro do sono hipotalâmico (Van Someren, 2000). A melatonina é um hormônio lipossolúvel capaz de atravessar membranas plasmáticas e a barreira hematoencefálica, portanto acessa facilmente diversos fluídos, tecidos e compartimentos celulares como por exemplo saliva, urina, folículo pré-ovulatório, sêmen, fluído amniótico, leite e também no cérebro, onde modula sua atividade (Claustrat, Brun, Chazot, 2005).
Sua síntese é controlada pelo núcleo supraquiasmático (NSQ) hipotalâmico, que identifica a variação do ciclo claro/escuro através das células ganglionares da retina (Canteras et al., 2011). O NSQ junto ao núcleo paraventricular se conecta aos gânglios cervicais superiores, onde em períodos noturnos as fibras simpáticas pós-ganglionares liberam noradrenalina que se ligam a receptores β-adrenérgicos presentes na glândula pineal. A partir do triptofano ocorre diversas reações enzimáticas, onde é convertido em 5-hidroxitriptofano e, posteriormente, em serotonina. Esta, por sua vez, por meio da liberação de noradrenalina que resulta na estimulação da expressão gênica de arilakilamina N-acetiltransferase (AA-NAT) e um aumento de adenosina monofosfato cíclico (AMPc), é acetilada em N-acetilserotonina e essa é metilada pela hidroxi-indol-O-metiltransferase (HIOMT), formando a melatonina (Figura 2) (Dubocovich, et al, 2003; Macchi, Bruce, 2004; Claustrat, Brun, Chazot, 2005; Sousa, Cruz-Machado, Tamura, 2008).
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Fonte: Adaptado de Souza, Cruz-Machado, Tamura (2008). Figura 2. Síntese da melatonina.
Após produzida e secretada, a melatonina não é estocada, visto que 70% da melatonina circulante se liga a hemoglobina (Morin et al., 1997), onde é convertida em 6-hidroximelatonina e metabolizada no fígado pela isoforma do citocromo P450, onde se une à 6-sulfatoximelatonina para ser excretada pelos rins (Reiter, 2003; Ma et al., 2005).
Além da indução do sono, a melatonina tem diversos papéis no organismo, é considerada um antioxidante muito importante, já que regula pró-oxidantes envolvidos na síntese do óxido nítrico e lipoxigenases (Hardeland, Fuhrberg, 1996), combate diretamente os radicais livres e estimula a transcrição de enzimas antioxidantes principalmente superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e glutationa redutase (GSH-Rd), além de proteger lipídios, proteínas e DNA de danos oxidativos (Reiter et al., 1998; Galano, Tan, Reiter, 2013; Garcia et al., 2014; Galano et al., 2015). Também possui efeitos imunomoduladores, agindo sobre linfócitos, citocinas, entre outros (Guerrero, Reiter, 2002); efeito antitumoral, inibindo mitose e suprimindo a recaptação do ácido linoleico e regulando receptores de estrogênio (Blask, Sauer, Dauchy, 2002), e efeito anti-inflamatório, por meio da redução de prostaglandinas e regulação da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) (Mayo et al., 2005).
NSQ: Núcleo Supraquiamático NPV: Núcleo Paraventricular NA: Noradrenalina
AA-NAT: Arilakilamina N-acetiltransferase HIOMT: Hidroxi-indol-O-metiltransferase
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Os mecanismos de ação da melatonina podem ser não mediados por receptores, estimulando transcrição e ativação de enzimas antioxidantes; e mediadas por receptores. Como citado anteriormente, a melatonina tem características lipossolúveis, o que a torna capaz de atravessar membranas e interagir diretamente com moléculas intracelulares, não necessitando a ligação com receptores (Cipolla-Neto, Amaral, 2018). Quando ligada a um receptor, pode gerar os efeitos imediato, prospectivo, cronobiótico, sazonal e transgeracional, sendo os efeitos imediatos os responsáveis pela ação antioxidante, além de regular mensageiros e canais de potássio e cálcio (Amaral, Cipolla-Neto, 2018).
Estudos sugerem que a melatonina tem um papel fundamental na fisiologia ovariana, auxiliando na ovulação, desenvolvimento folicular, função lútea e maturação oocitária, além da sua deficiência estar relacionada com a fisiopatologia da SOP (Cagnacci, Volpe, 2002).
Existem três tipos de receptores para melatonina, os de maior afinidade, receptor MT1 e MT2, são acoplados a proteína G. O MT1 com capacidade de reduzir a produção de AMPc, ativação da fosfolipase C, aumento a produção de diacilglicerol (DAG) e fosfatidil inositol-3 (IP3), que consequentemente promove o aumento da concentração de cálcio e atividade da proteína quinase-C (PKC) (Dubocovich, Markowska, 2005), ativa os canais de potássio para inibição de disparos neuronais no NSQ, modula fosfolipase A2 e canais iônicos específicos para MT1 acoplado a proteína G, estimula células não-neuronais pela proteína kinase ativada por mitógenos, além de gerar vasoconstrição (McArthur, Hunt, Gillette, 1997; Slanar, Pelisek, Vanecek, 2000, Witt-Enderby et al., 2000).
O receptor MT2, quando ativado, também inibe a adenilil ciclase, diminui as concentrações intracelulares de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e atividade da PKC no NSQ (Hunt et al., 2001), aumenta os fosfoinositídeos (Boutin et al., 2005), regula a contratibilidade do útero e, ao contrário do MT1, gera vasodilatação (Doolen et al., 1998; Sharkey et al., 2009).
O receptor MT3 faz parte da família de enzimas quinona redutase, com função de proteger o organismo contra o estresse oxidativo pela prevenção das reações de transferência de elétrons das quinonas (Pendi-Perumal et al., 2006).
A melatonina tem sido utilizada como medicamento, indicado principalmente para o tratamento de diversos distúrbios do sono. Além disso, é utilizado como um
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complemento no tratamento de outras doenças, inclusive da SOP (Altun, Ugur-Altun, 2007; Sánchez-Barceló et al., 2010; Saha, Kaura, Saha, 2012).
Na medicina reprodutiva, pesquisas realizadas em diversos mamíferos encontraram efeitos positivos da melatonina em diversos momentos do tratamento. O tratamento direto na paciente pode gerar redução do envelhecimento ovariano, melhora taxa de fertilização e gravidez, melhora produção hormonal, reduz a atividade das espécies reativas de nitrogênio (NOS) e espécies reativas de oxigênio (ROS) e protege o feto e a placenta do estresse oxidativo (Reiter et al., 2009; Loren et al., 2017).
No tratamento in vitro dos gametas, a melatonina tem ação tanto sobre espermatozoide quanto sobre os oócitos, em espermatozoides, pode apresentar diminuição da produção de ROS e fragmentação de DNA, regulação de enzimas antioxidantes, proteção contra danos produzido por metais pesados, melhora da fertilização, diminuição de oxido nítrico intracelular e aumento da motilidade e viabilidade. Em oócitos sua ação pode reduzir danos gerados por ROS em microtúbulos e cromossomos, pode agir na regulação de enzimas antioxidantes, diminuição da concentração de ROS, inibição da transcrição de genes relacionados com apoptose, prevenção de danos ao DNA e melhora na maturação in vitro (Loren et al., 2017).
No cultivo in vitro de embriões, a melatonina pode gerar aumento na taxa de fertilização e na taxa de clivagem, e consequentemente na produção de blastocistos, melhora do desenvolvimento embrionário e diminuição da fragmentação de DNA nos blastômeros (Papis et al., 2007; Rodrigues-Osorio et al., 2007; Tian et al., 2010). Esses resultados são consequência do efeito direto e indireto da melatonina como antioxidante, já que existem estudos que mostram que blastocistos tem o receptor MT1 em sua membrana, além de estimular a expressão de genes antioxidantes e de genes anti-apoptóticos (Sampaio et al., 2012; Wang et al., 2013; Dehghani-Mohammadabadi et al., 2014).
Tendo em vista que a literatura mostra que o tratamento oral com melatonina pode ajudar no tratamento de mulheres com SOP (Pacchiarotti et al., 2016), a suplementação do meio de cultura embrionário com melatonina poderia trazer diversos benefícios aos embriões cultivados in vitro provenientes de pacientes com síndrome dos ovários policísticos, aumentando sua qualidade e consequentemente
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as chances de se ter uma bebê em casa para casais que procuram tratamentos de reprodução assistida.
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2 HIPÓTESES
A suplementação de melatonina no meio de cultura embrionário tem efeito sobre o desenvolvimento embrionário, bem como em sua qualidade morfológica e de DNA.
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3 OBJETIVO
Analisar o efeito da suplementação do meio de cultura embrionário com melatonina no desenvolvimento e na qualidade de embriões provenientes de modelos experimentais murinos com e sem SOP.
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4 MÉTODOS
4.1 Delineamento experimental
Esse estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) com o número de protocolo 9434210218.
Foram utilizados camundongos fêmeas e machos C57BL/6, sendo 18 fêmeas de 6 a 10 semanas e 12 machos de 12 a 18 semanas, que foram mantidos no Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) da UNIFESP. Os animais foram colocados para acasalar e, após o nascimento da ninhada, foi realizada sexagem e os filhotes fêmeas foram induzidas à SOP. Foram utilizados 90 recém-nascidos, divididos em 15 camundongos por grupo.
Todos os animais foram mantidos a 21ºC (±2ºC), em um ciclo claro/escuro de 12 horas e acesso ad libitum à ração e água.
A escolha da linhagem C57BL/6J para produção de embriões foi baseada na experiência prévia do grupo e em estudos relacionados a técnicas de fertilização in vitro que utilizaram a mesma linhagem (Bath, 2003; Kohaya, et al., 2013; Takeo, Nakagata, 2015)
Foram utilizados 316 blastocistos produzidos na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e foram divididos em 6 grupos (Figura 3): (1) grupo com suplementação de melatonina, com SOP (Grupo SOP mel); (2) grupo sem suplementação de melatonina, com SOP (Grupo SOP s/ mel); (3) grupo com suplementação de melatonina, placebo (Grupo Plac mel); (4) grupo sem suplementação de melatonina, placebo (Grupo Plac s/ mel); (5) grupo com suplementação de melatonina, sem SOP (Grupo Contr mel); (6) grupo sem suplementação de melatonina, sem SOP (Contr s/ mel). O desenvolvimento morfológico embrionário foi acompanhado até o estágio de blastocisto, neste estágio os embriões foram coletados e submetidos aos testes de Terminal deoxynucleotideyl Transferase dUTP Nick end Labeling (TUNEL). Os grupos foram comparados em relação ao efeito da melatonina no desenvolvimento embrionário tanto em condições placebo, com e sem SOP, e com relação ao efeito da melatonina.
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Figura 3. Fluxograma do delineamento experimental.
4.2 Indução à SOP
Para induzir os camundongos fêmeas a desenvolverem SOP, foi injetado 20 µg de cipionato de testosterona na região dorsal de recém-nascidos nos dias 1 e 2 após o nascimento (Nohara et al., 2011). Para o placebo, foi injetado 20 µL de óleo de amendoim durante o mesmo período e para o grupo sem SOP não foi administrado nenhuma substância. O objetivo do grupo placebo é observar se a manipulação em camundongos recém-nascido poderia causar algum estresse que atrapalhasse a fertilidade dos mesmos no futuro. O cipionato de testosterona é diluído em óleo de amendoim, por esse motivo o mesmo foi escolhido para ser administrado no placebo.
4.3 Estimulação ovariana
Uma vez em idade reprodutiva, de 28 a 42 dias de idade, as fêmeas passaram por um protocolo de superovulação, para que haja um maior número de embriões durante a coleta. Em cada fêmea foi administrada por via intraperitoneal, 5UI de soro gonadotrófico de égua grávida (PMSG) (Folligon® 5000 UI, MSD Saúde Animal, São Paulo, Brasil). De 42 a 48 horas depois, foi administrado 5UI de gonadotrofina coriônica equina (ECG) (Chorulon® 5000 UI, MSD Saúde Animal, São Paulo, Brasil) para induzir a ovulação. Em seguida, as fêmeas foram colocadas para casalar com machos adultos férteis de 12 a 18 semanas de idade. Este protocolo de estimulação ovariana foi baseado tanto na experiência prévia do grupo quanto na experiência dos
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veterinários do CEDEME, assim como em outros estudos publicados (Combelles, Albertini, 2003; Takeo, Nakagata, 2015)
4.4 Coleta dos zigotos
Após 18 a 24 horas do coito, as fêmeas foram sedadas utilizando uma solução de 20% isoflurano e 80% propileno glicol e eutanasiádas por deslocamento cervical. OS animais foram então posicionados ventralmente e foi feita uma incisão abdominal, atravessando a pele e a cama peritoneal para exposição dos órgãos. Assim que o trato reprodutivo foi localizado, as tubas foram coletadas e imediatamente inseridas em meio HTF modificado com HEPES (Irvine Scientific, Califórnia, EUA) em uma placa de petri de 35mm. Cada tuba uterina foi transferida para uma nova placa de petri de 90mm contendo gotas de 200µL de meio HTF modificado com HEPES, onde foi realizado a ressecção e limpeza das tubas uterinas com o auxílio de um estereomicroscópio para a coleta dos zigotos. Os zigotos encontrados nas tubas foram transferidos para gotas de 50µL de meio HTF modificado com HEPES e 0,08% de hialuronidase, contidas na mesma placa, para retirada das células do cumulus. Os zigotos foram lavados em novas gotas de 50µL de meio HTF modificado com HEPES e então transferidos para uma placa de 60mm contendo 5 gotas de 100µL de meio CSCM-CTM (Irvine) cobertas com aproximadamente 8mL de óleo mineral (Irvine).
4.5 Comprovação do modelo de SOP
Foi realizado o corte histológico dos ovários (Figura 4) durante o experimento piloto. Os ovários foram coletados logo após a eutanásia dos camundongos fêmeas e fixados em 10% formalina neutra tamponada durante a noite. Os ovários foram desidratados em séries graduados de etanol, clareadas com xileno e embebidos em parafina. Foram seccionadas em séries de 4 µm. Os cortes foram colocados em lâminas identificadas e coradas com hematoxilina e eosina. Foram analisadas em microscópio óptico em aumento de 40x para quantificar o número de folículos por ovário.
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Figura 4. Corte histológico de ovários dos camundongos utilizados no experimento em microscópio óptico em aumento de 40x.
4.6 Cultivo embrionário
Os embriões foram cultivados em gotas de 100µL de meio de cultura contínuo CSCM-CTM (Spectrun, São Paulo, Brasil) coberto com aproximadamente 8mL de óleo mineral com e sem suplementação de 10-6 mol/L de melatonina e mantidos em incubadoras a 37º C, 6 % de CO2 e 90 % de umidade por 96 horas até atingirem o estágio de blastocisto (D5). Em cada gota foram transferidos cerca de 15 zigotos.
4.6.1 Diluição da melatonina
Foi utilizado a Melatonina (M5250, Sigma-Aldrich, Missouri, EUA) com peso molecular de 232,28g/mol com solubilidade em etanol. Para chegar a concentração de 10-6 mol/L de melatonina, foram necessárias 3 diluições totais:
SOP
Controle
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1. Solução mãe1 (10-3 mol/L): foi pesado 0,0023228g e diluído em 200µL de etanol. Essa mistura foi homogeneizada e completada com 9800µL de meio de cultura CSCM-CTM.
2. Solução mãe2 (10-5 mol/L): foi coletado 20µL da solução mãe1 e completado com 1980µL de meio de cultura CSCM-CTM. Foram aliquotados 300µL em microtubos e congelados protegidos contra a luz.
3. Solução de uso (10-6 mol/L): pipetar 200µL da solução mãe2 e completar com 1800µL de meio de cultura CSCM-CTM.
4.7 Análise morfológica dos embriões
A análise morfológica dos embriões foi feita em estágio de clivagem (24 horas de cultivo), estágio de mórula (72 horas de cultivo) e em estágio de blastocisto (96 horas de cultivo) em microscópio óptico invertido (Olympus IX 81 Inverted Fluorescence Automated Live Cell Microscope) e suas fotos foram tiradas utilizando uma câmera (Olympus XM10) acoplada a esse microscópio, utilizando um aumento de 100x.
Para embriões em estágio de blastocisto, foi adotado o critério de Gardner et al. (2000), onde se leva em consideração o grau de expansão da blastocele, da massa celular interna (MCI) e do trofectoderma (TE), representado pela Tabela 1.
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Quadro 1: Critério de classificação para estágio de blastocisto.
Blastocele Estágio de desenvolvimento do blastocisto 1 Cavidade da blastocele menor que a metade do volume do embrião 2 Cavidade da blastocele maior que a metade do volume do embrião 3 Blastocisto completo, a cavidade preenche totalmente o embrião
4 Blastocisto expandido, cavidade maior que o embrião afinamento da zona pelúcida 5 Embrião em hatching
6 Embrião eclodido
Grau de MCI Qualidade da massa celular interna A Muitas células bem agrupadas
B Várias células pouco agrupadas C Poucas células
Grau de TE Qualidade do trofectoderma A Muitas células, formando uma camada coesa
B Poucas células, formando um epitélio frouxo C Poucas células grandes
Fonte: Gardner et al., 2000.
Seguindo a classificação, os blastocistos foram novamente classificados utilizando o critério da Society for Assisted Reproductive Technology (SART) (Heitmann et al., 2013), sendo classificados apenas em bons, regulares ou ruins (Tabela 2). As variáveis categóricas desta análise foram transformadas em variáveis numéricas a fim de facilitar a análise estatística. Também foi criada uma variável “índice de qualidade” que representa a somatória das variáveis expansão da blastocele, MCI e TE descritas na Tabela 1.
Quadro 2: Critério de classificação de blastocisto pela SART.
Classificação SART Classificação de MCI e TE por Gardner et al. (2000)
Bom (3) AA e AB
Regular (2) BB, BC e BA
Ruim (1) CC e CB
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4.8 Análise de detecção de apoptose pelo teste TUNEL
A análise de fragmentação de DNA foi feita pela técnica de TUNEL, e foi realizada nos embriões em estágio de blastocistos, utilizando o In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche, Brasiléia, Suiça).
Este protocolo pode ser dividido em 8 etapas.
1. Os embriões foram lavados numa placa de coloração contendo aproximadamente 1 mL de PBS-BSA.
2. Os embriões foram transferidos para uma nova placa de coloração contendo 750 µL de 5 % de paraformaldeído para sua fixação e foram mantidos nessa solução por 30 minutos.
3. Os embriões foram lavados novamente em 3 gotas de 30 µL de PBS-BSA e mantidos em cada gota por 5 minutos.
4. Etapa de permeabilização: os embriões foram transferidos da placa de lavagem para uma placa de coloração contendo 750 µL de 0,1 % de Triton X em 0,1 % de citrato de sódio. Eles foram mantidos nessa solução de permeabilização de 2 a 5 minutos.
5. Novamente, os embriões foram lavados em 3 gotas de 30 µL de PBS-BSA e mantidos por 5 minutos em cada gota.
6. Os embriões foram transferidos da placa de lavagem para uma placa de coloração contendo uma gota de 20 µL da solução TUNEL. Essa placa foi colocada em uma incubadora a 37º C por 45 minutos.
7. Após esse tempo, os embriões foram lavados novamente, como diz a etapa 5. 8. Um pequeno volume de Vectashield™DAPI (Vector Laboratories, Califórnia, EUA)
foi colocado em uma lâmina junto a uma pequena gota de PBS-BSA. Os embriões foram transferidos da placa de lavagem para a lâmina, que foi coberta por uma lamínula e vedada com esmalte.
A lâmina foi analisada através de fotos tiradas com uma câmera (Olympus DP71) acoplada a um microscópio de epifluorescência (Olympus BX51), com auxílio do software Komet version 6. A emissão do azul fluorescente DAPI (comprimento de onda de 350/470nm) foi utilizada para corar os núcleos de todas as células embrionárias, enquanto que a emissão do verde fluorescente FITC (comprimento de onda de 490/525nm) foi utilizada para corar apenas as células que estão em apoptose. Foram contados para análise dos dados, com o auxílio do software ImageJ Java
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1.8.0_172, o número de células em apoptose, número de células totais e a razão células apoptóticas/células totais para cada blastocisto corado.
4.9 Análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 18.0. Primeiramente as variáveis contínuas foram testadas quanto a sua normalidade e, quando não apresentaram distribuição normal, foram padronizadas por z-score. As variáveis contínuas foram comparadas entre os grupos utilizando o teste ANOVA com posthoc Bonferroni no modelo linear generalizado (GLM), incluindo os dados do teste TUNEL e da classificação de índice de qualidade da morfológica dos blastocistos. A comparação dos grupos em relação as variáveis blastocele, MCI e TE foram comparadas pelo teste não paramétrico de Kruskal Wallis. Para comparação dos grupos com relação a taxas (clivagem, mórula e blastocisto) foi realizada utilizando o Teste Qui-Quadrado (Pearson’s Chi Square Test and Fisher’s Exacr Probability). Foi considerada diferença estatística quando p < 0,05.
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5 RESULTADOS
5.1 Avaliação das taxas de clivagem, mórula e blastocisto
O experimento foi dividido em 8 repetições por grupo e resultaram em um total de 1645 células coletadas (zigoto e oócito), 749 clivaram em D2 e 316 conseguiram chegar ao estágio de blastocisto em D5. Em relação a taxa de clivagem dos embriões em D2, o grupo controle melatonina (contr mel) apresentou uma taxa de clivagem (74,59%) significantemente maior (p = 0,0001) em relação aos outros grupos SOP melatonina (SOP mel), SOP sem melatonina (SOP s/ mel), placebo melatonina (plac mel), placebo sem melatonina (plac s/ mel) e controle sem melatonina (contr s/ mel), que obtiveram respectivamente: 31,13%, 30,93%, 56,09%, 53,49% e 65,79% (Figura 5).
Figura 5. Gráfico de barras representando os dados da clivagem dos embriões em D2, de acordo com o teste Qui-Quadrado. Taxa expressa em porcentagem. *** p < 0,0001.
408 127 31,13 388 120 30,93 312 175 56,09 301 161 53,49 122 91 74,59 114 75 65,79 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
N total zigoto/oócito N embriões clivados Taxa de clivagem %
SOP mel SOP s/ mel Plac mel Plac s/ mel Contr mel Contr s/ mel
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Em relação a taxa de mórula em D4, o controle sem melatonina apresentou uma taxa de mórula (61,33%) significantemente superior (p = 0,0001) aos outros grupos. Os grupos SOP melatonina, SOP sem melatonina, placebo melatonina, placebo sem melatonina e controle melatonina obtiveram respectivamente: 14,96%, 14,17%, 40,57%, 39,13% e 54,94% (Figura 6).
Figura 6. Gráfico de barras representando os dados de taxa de mórula dos embriões em D4, de acordo com o teste Qui-Quadrado. Taxa expressa em porcentagem. *** p < 0,0001.
127 19 14,96 120 17 14,17 175 71 40,57 161 63 39,13 91 50 54,94 75 46 61,33 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
N embriões clivados N mórula Taxa de mórulas %
SOP mel SOP s/ mel Plac mel Plac s/ mel Contr mel Contr s/ mel ***
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Em relação a taxa de blastocisto em D5 (Figura 7) o grupo controle melatonina apresentou uma taxa de blastocisto de 78,02%, significativamente superior (p = 0,0001) quando comprado aos grupos SOP melatonina, SOP sem melatonina, placebo melatonina, placebo sem melatonina, controle sem melatonina, que obtiveram respectivamente 12,60%, 14,17%, 53,21%, 40,99% e 69,33%.
Figura 7. Gráfico de barras representando os dados de taxa de blastocisto dos embriões em D5, de acordo com o teste Qui-Quadrado. Taxa expressa em porcentagem. *** p < 0,0001.
127 16 12,60 120 17 14,17 175 94 53,71 161 66 40,99 91 71 78,02 75 52 69,33 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
N embriões clivados N blastocisto Taxa de blastocistos %
SOP mel SOP s/ mel Plac mel Plac s/ mel Contr mel Contr s/mel
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5.2 Classificação morfológica dos blastocistos
Foram utilizados 316 blastocistos nesta análise. Para a variável índice de qualidade foi realizado o teste GLM onde mostrou resultado estatisticamente significante (p = 0,014), representado pela tabela 3.
Tabela 1. Dados descritivos do índice de qualidade da classificação morfológica dos blastocistos. Comparação por GLM com média ± desvio padrão, intervalo de confiança de 95% e valor de p. Foram incluídos os valores de tamanho de efeito (Eta square) e poder observado.
Variável Dados descritivos Grupos de estudo SOP mel (n=16) SOP s/ mel (n=17) Placebo mel (n=94) Placebo s/ mel (n=66) Controle mel (n=71) Controle s/ mel (n=52) Índice de qualidade p = 0,014 Eta Square: 0,045 Poder: 85% Média ± DSV 7,3±1,66a 7,5±1,50a 13,2± 0,90b 14,3± 1,21b 14,2± 1,17b 13,7± 1,42b IC 95% 3,77-10,85 4,35-10,71 11,38-14,95 11,86-16,68 11,89-16,56 10,83-16,55
a, b representam a diferença estatisticamente significativa entre os grupos.
Foi realizado posthoc de Bonferroni que mostrou diferença entre os grupos SOP melatonina (mel) e placebo mel (p = 0,021), SOP mel e placebo sem mel (p = 0,008), SOP mel e controle mel (p = 0,008), SOP mel e controle sem mel (p = 0,008), SOP sem mel e placebo mel (p = 0,022), SOP sem mel e placebo sem mel (p = 0,008), SOP sem mel e controle mel (p = 0,008) e SOP sem mel e controle sem mel (p = 0,018).
Para as demais variáveis da classificação morfológica (blastocele, MCI e TE), foi realizado o teste não paramétrico de Kruskal Wallis, onde apresentou resultado significativo para as variáveis blastocele (p = 0,020) e TE (p = 0,045) (Tabela 2).
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Tabela 2. Dados descritivos da classificação morfológica dos blastocistos em relação a blastocele, MCI e TE. Comparação por Kruskal Wallis com mediana, intervalo interquartil, quartil 1, quartil 3 e valor de p. Variáveis CM Dados descritivos Grupos de estudo SOP mel (n=16) SOP s/ mel (n=17) Placebo mel (n=94) Placebo s/ mel (n=66) Controle mel (n=71) Controle s/ mel (n=52) Blastocele p = 0,020 Mediana 3,00 4,00 4,00 5,00 5,00 4,00 Intervalo interquartil 2,75 2,00 4,00 3,00 1,00 1,75 Quartil 1 2,25 2,50 4,00 4,00 4,00 3,25 Quartil 3 5,00 4,50 5,00 5,00 5,00 5,00 MCI p = 0,063 Mediana 1,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 Intervalo interquartil 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Quartil 1 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Quartil 3 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 TE p = 0,045 Mediana 1,00 1,00 2,00 2,00 2,00 2,00 Intervalo interquartil 1,00 0,50 1,00 1,00 1,00 1,00 Quartil 1 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Quartil 3 2,00 1,50 2,00 2,00 2,00 2,00
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Figura 8. Micrografia em microscópio óptico invertido em aumento de 100x do cultivo do experimento de desenvolvimento embrionário no estágio de blastocisto. A(I) SOP com melatonina; A(II) SOP sem melatonina; B(I) placebo com melatonina; B(II) placebo sem melatonina; C(I) controle com melatonina; C(II) controle sem melatonina
A(I) A(II)
B(I) B(II)
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5.3 Teste TUNEL nos blastocistos
Um total de 142 blastocistos foram corados para análise de detecção de fragmentação apoptótica. Foi realizado o teste GLM multivariado levando em consideração as variáveis número de células totais (T), número de células apoptóticas (A) e a razão células apoptóticas/totais (A/T), representado na tabela 4. As variáveis que apresentaram resultados estatisticamente significantes foram a variável T e a razão A/T, ambos com p = 0,0001 (Tabela 3).
Tabela 3. Dados descritivos do teste TUNEL em blastocistos. Os grupos foram comparados por GLM. Além de média ± desvio padrão, intervalo de confiança 95% e valor de p. Foram incluídos os valores de tamanho de efeito (Eta square) e poder observado.
Variáveis TUNEL Dados descritivos Grupos de estudo SOP mel (n=11) SOP s/ mel (n=13) Placebo mel (n=33) Placebo s/ mel (n=32) Controle mel (n=31) Controle s/ mel (n=22) Número total de células (T) p = 0,0001 Eta Square: 0,32 Poder: 100% Média ± DSV 40,4± 5,81a 37,7± 3,36c 59,2± 3,60de 63,2± 3,86bde 78,4± 2,81bdf 58,5± 3,04de IC 95% 27,50-53,40 30,36-45,02 51,91-66,58 55,28-71,04 72,14-84,19 52,19-64,81 Número total de células apoptóticas (A) p = 0,359 Eta Square: 0,039 Poder: 38% Média ± DSV 5,9±1,41 4,6±0,94 3,7±0,39 4,0±0,43 4,8±0,61 4,9±0,79 IC 95% 2,77-9,05 2,56-6,67 2,93-4,53 3,12-4,88 3,53-6,01 3,21-6,51 % Razão A/T p = 0,0001 Eta Square: 0,20 Poder: 100% Média ± DSV 16,5± 3,61a 11,9±2,14 6,6±0,76 b 7,1±0,85b 6,2±0,78b 8,4±1,33b IC 95% 8,48-24,61 7,26-16,59 5,01-8,14 5,33-8,79 4,60-7,78 5,59-11,14
a, b / c,d / e,f representam a diferença estatisticamente significativa entre os grupos.
Foi realizado posthoc de Bonferroni que mostrou diferença na variável T entre os grupos SOP melatonina e placebo sem melatonina (p = 0,008), SOP melatonina e controle melatonina (p < 0,0001), SOP sem melatonina e placebo melatonina (p =
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0,007), SOP sem melatonina e placebo sem melatonina (p = 0,001), SOP sem melatonina e controle melatonina (p < 0,0001), SOP sem melatonina e controle sem melatonina (p = 0,022), placebo melatonina e controle melatonina (p = 0,001), placebo sem melatonina e controle melatonina (p = 0,018) e controle melatonina e controle sem melatonina (p = 0,002). Por fim, a variável razão A/T obteve diferença entre os grupos SOP melatonina e placebo melatonina (p < 0,0001), SOP melatonina e placebo sem melatonina (p < 0,0001), SOP melatonina e controle melatonina (o < 0,0001) e SOP melatonina e controle sem melatonina (p = 0,005).
Figura 9. Micrografia em microscópio invertido de fluorescência em aumento de 100x de embriões submetidos à técnica de TUNEL. As células coradas em azul representam todas as células do blastocisto corado pelo DAPI e as células em verde representam as células apoptóticas corados pelo FITC. A(I) SOP com melatonina DAPI; A(II) SOP com melatonina FITC; B(I) SOP sem melatonina DAPI; B(II) SOP sem melatonina FITC; C(I) placebo com melatonina DAPI; C(II) placebo com melatonina FITC; D(I) placebo sem melatonina DAPI; D(II) placebo sem melatonina FITC; E(I) controle com melatonina DAPI; E(II) controle com melatonina FITC; F(I) controle sem melatonina DAPI; F(II) controle sem melatonina FITC.
A(I) A(II) B(I) B(II)
C(I) C(II) D(I) D(II)
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6 DISCUSSÃO GERAL
Considerando os achados nesse trabalho, a melatonina não teve efeito no cultivo embrionário para estes grupos, porém ficou claro que a qualidade embrionária do grupo SOP foi inferior ao grupo placebo e controle.
A piora da qualidade embrionária observada no grupo SOP ocorreu a partir do início do desenvolvimento, onde se teve um atraso desde o momento da clivagem que persistiu até estágio de blastocisto, na avaliação morfológica e TUNEL. Entretanto, o TUNEL não demonstrou diferença estatística no número de células apoptóticas, porém apresentou um menor número de células totais nos blastocistos. Além disso, foi observado que o grupo placebo também tem uma menor taxa de clivagem, mórula e blastocisto se comparado ao grupo controle, mostrando que mesmo os camundongos não sofrendo indução à SOP quando recém-nascidos, somente o fato de sofrer algum estresse nessa fase, pode ter afetado de alguma forma a fertilidade desses camundongos. O grupo controle suplementado com melatonina teve melhora em todos os parâmetros analisados em comparação aos demais grupos.
6.1 Taxa de blastocisto e qualidade embrionária
Sabe-se que mulheres com SOP apresentam pior qualidade oocitária e, consequentemente, pior qualidade embrionária, assim como um desenvolvimento embrionário mais tardio em comparação a mulheres sem SOP. Essa característica foi observada em nosso experimento, tanto em relação ao desenvolvimento quanto em relação a qualidade dos embriões de camundongos induzidos à SOP, corroborando com o que é reportado na literatura (Sundvall et al., 2015, Zhang et al., 2019). Um dos motivos relacionados a essa piora na qualidade oocitária e embrionária pode estar ligado à menor concentração intrafolicular de melatonina em comparação a mulheres sem SOP (Tamura et al., 2009).
Por conta dessa menor concentração de melatonina no ambiente intrafolicular, há um desequilíbrio entre as concentrações de substâncias oxidantes e antioxidantes, levando esse ambiente a um estresse oxidativo, que também é um dos motivos de ocorrer a perda de qualidade oocitária (Tagliaferri et al., 2017), junto com o fato do cultivo in vitro em si causar mais estresse oxidativo comparado ao ambiente in vivo
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em condições normais (Choi et al., 2008). Essa produção excessiva de ROS em ambos os casos possuem efeito deletério ao embrião, no qual reage com os lipídeos presentes em sua membrana, causando danos em moléculas celulares, resultando em perda da integridade da membrana, mudanças estruturais ou funcionais em proteínas e danos ao DNA (Tamura et al., 2012).
A melhora na taxa de clivagem e blastocisto era esperada por conta das diversas propriedades apresentadas pela melatonina, nesse caso, ocorre em parte pela característica que a melatonina tem de diminuir a expressão de genes pró-apoptóticos (BAX e caspase-3) e de induzir a expressão de genes anti-pró-apoptóticos (Bcl-2), além de aumentar a concentração intracelular do antioxidante glutationa e reduzir a produção de ROS. Essas características além de melhorar o desenvolvimento e qualidade embrionária, também diminuem o grau de apoptose em blastocistos (Reiter et al., 2009; Gao et al., 2012; Mohseni et al., 2012; Wang et al., 2013).
Nosso estudo revelou que a suplementação do meio de cultivo com melatonina não obteve resultado estatisticamente significativo no grupo SOP em relação a qualidade e desenvolvimento embrionário, no qual apresentou uma porcentagem menor na taxa de blastocisto em comparação ao grupo SOP sem suplementação. Em relação ao grupo controle e placebo que foram suplementados com melatonina, ambos apresentaram uma maior porcentagem em relação a taxa de clivagem e blastocistos em comparação aos mesmos grupos que não foram suplementados. A taxa de mórula no caso do grupo controle foi menor no grupo suplementado com melatonina pelo fato da maioria dos embriões já estarem em estágio de blastocisto em D4. Em relação a qualidade embrionária, apenas o grupo controle obteve uma pequena melhora com a suplementação de melatonina, que não apresentou diferença estatisticamente significante quando comparado com o grupo controle sem melatonina.
Os resultados encontrados em relação ao grupo SOP não corresponderam com o reportado na literatura (Ishizuka et al., 2000; Wang et al., 2013; Dehghani-Mohammadabadi et al., 2014). Um dos fatores limitantes para esse resultado pode estar relacionado com a concentração de melatonina suplementada no meio de cultivo. A concentração de escolha de 10-6 mol/L foi relatada como eficiente em camundongos em condições normais (Ishizuka et al., 2000). A melatonina em concentrações altas (10-3 mol/L) em condição sem SOP pode interferir no
28
desenvolvimento embrionário, com diminuição na taxa de blastocisto e no número de blastômeros (Wang et al., 2013), o que pode indicar que em condição com SOP a concentração escolhida seja alta e exista a necessidade da diminuição dessa concentração no meio de cultivo para que ocorra resultados positivos.
6.2 TUNEL
O teste de TUNEL é normalmente utilizado para identificar a presença de fragmentação de DNA resultante da cascata de sinalização da apoptose (Penaloza et al., 2006). A apoptose, também conhecida como morte programada, é importante para o desenvolvimento embrionário, uma vez que é responsável pela eliminação de celular anormais, garantindo um bom desenvolvimento embrionário (Zakeri et al., 2015). Para que a apoptose aconteça, ocorre a ativação e regulação de diversos fatores incluindo p53, BAX, Bcl-2, TNF-α e caspase-3 (Salakou et al., 2007; Cardaci et al., 2008). No entanto, em condições que ocorram um aumento do estresse oxidativo, como a SOP ou o próprio cultivo in vitro, pode gerar um aumento da apoptose, o que resulta em uma alta fragmentação de DNA e, consequentemente, um desenvolvimento embrionário lento ou até mesmo a parada do desenvolvimento (Nánássy et al., 2008; Choi et al, 2008).
Como citado anteriormente, a melatonina é capaz de regular a Bcl-2, um gene antiapoptóticos, e diminuir expressão gênica de BAX e caspase-3, que são genes pró-apoptóticos, o que é de extrema importância para a diminuição do grau de apoptose em blastocistos e, consequentemente, a melhora do desenvolvimento e viabilidade embrionária (Reiter et al., 2009; Gao et al., 2012; Mohseni et al., 2012; Wang et al., 2013).
Ao contrário do esperado, o grupo SOP com suplementação de melatonina não respondeu tão bem ao tratamento, apesar de apresentar um maior número de células totais, apresentou também um maior número de células apoptóticas em comparação ao grupo SOP sem suplementação. No entanto, o grupo SOP em ambas condições de cultivo, apresentou um menor número de células totais e maior relação entre células apoptóticas e totais em comparação aos grupos placebo e controle, também em ambas condições de cultivo.
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O grupo placebo que não recebeu suplementação com melatonina obteve um maior número de células totais, porém um maior número de células apoptóticas em comparação ao grupo placebo que recebeu a suplementação.
O grupo com melhor resposta a suplementação de melatonina, o grupo controle, obteve um maior número de células totais e um menor número de células apoptóticas em comparação ao grupo controle sem suplementação.
O aumento na quantidade de blastômeros era esperado em todos os grupos que foram suplementados com melatonina, corroborando com o que já foi reportado na literatura (Choi et al., 2008; Wang et al., 2013; Dehghani-Mohammadabadi et al., 2014). O fato do grupo SOP que recebeu a suplementação de melatonina ter um maior número de células apoptóticas também ocorre provavelmente pela concentração de melatonina escolhida (Ishizuka et al., 2000) que apenas surtiu efeito em relação ao grupo controle, também sugerindo que para melhorar esse parâmetro seja necessário a adequação da concentração de melatonina.
O maior número de blastômeros associados com um menor número de células apoptóticas encontradas no grupo controle suplementado com melatonina se dá as propriedades já citadas da melatonina em regular genes anti-apoptóticos junto com a propriedade antioxidante da melatonina (Reiter et al., 2009; Gao et al., 2012; Mohseni et al., 2012; Wang et al., 2013), capaz de agir tanto diretamente nas ROS quanto em se ligar no receptor MT1 encontrados nas membranas dos blastocistos (Sampaio et al., 2012; Dehghani-Mohammadabadi et al., 2014), para estimular a expressão gênica dos genes em questão.
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7 CONCLUSÃO
O presente estudo permitiu concluir que a suplementação de melatonina no meio de cultivo embrionário não teve efeito positivo no grupo SOP em relação a taxa de blastocisto, classificação morfológica e fragmentação de DNA. Entretanto, o grupo SOP apresentou pior qualidade embrionária, quando comprado com os demais grupos. Em contrapartida, pudemos concluir também que, no grupo controle a suplementação de melatonina teve efeito positivo no desenvolvimento embrionário e fragmentação apoptótica.
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