Neste estudo, optou-se pela utilização da técnica de tissue microarray (TMA) para obtenção dos blocos da amostra. Foi utilizada uma agulha de crochê para preparação dos blocos receptores do array, variação de uma adaptação de baixo custo desenvolvida anteriormente por nossa equipe (GURGEL et al., 2012) . O TMA oferece resultados bastante confiáveis e reprodutíveis e as adaptações utilizadas possibilitaram cortes histológicos representativos das amostras. A imunohistoquímica, por outro lado, apresentou dificuldades, notadamente pela preservação irregular (período de fixação em formalina a 10%) dos espécimes cirúrgicos. A utilização do sistema PT Link™-Dako na recuperação antigênica foi vital para a imunomarcação dos epítopos e foi necessária a concentração máxima recomendada pelos fabricantes, dos anticorpos, para a marcação dos controles positivos e dos casos.
A comparação de expressão dos três marcadores revelou maior frequência de positividade e maior grau de expressão (escores mais altos) nas secções histológicas de tumor , em comparação às células da mucosa normal, para ambas células avaliadas, tanto as epiteliais quanto os mononucleares do estroma. Em algumas situações essas diferenças foram estatisticamente significantes, como nas células epiteliais tumorais coradas pela MMP-14 e nas células epiteliais tumorais e mononucleares do microambiente tumoral coradas pela TIMP-2. Em outras situações, observou-se uma tendência à maior expressão no tumor, como nos mononucleares para a MMP-2. Possivelmente, uma maior amostragem poderia revelar significância na diferença agora observada para a MMP-2. Em resumo, a expressão dos três biomarcadores foi nitidamente superior, neste estudo, nas amostras de tumor comparadas à mucosa colônica normal, tanto em células neoplásicas quanto em mononucleares.
Ao se avaliar as possíveis associações entre a imunoexpressão dos biomarcadores e as variáveis clínico-patológicas, verificou-se, nos mononucleares, que a alta expressão de MMP- 14 no tumor primário foi maior nos casos sem metástases linfonodais (p=0,0353). Em carcinomas de mama, Pellikainen et al. (2004) encontraram resultado semelhante. Considerando que a MMP-14 inicia a ativação de outras metaloproteinases como a MMP-2 (BERNARDO; FRIDMANI, 2003; TRUDEL et al., 2008), estes achados são inesperados e sugerem que, nos carcinomas colorretais (e alguns carcinomas de mama, como relatado), a MMP-14 participa principalmente da invasão local destes tumores, mais do que de sua disseminação aos linfonodos.
Nas células neoplásicas, neste estudo, não foi encontrada relação entre a expressão de MMP-2, de MMP-14 e do TIMP-2 com as demais variáveis clínico-patológicas. De maneira semelhante, alguns autores não evidenciaram correlação entre a expressão de várias MMPs (inclusive 2 e 14) e algumas destas variáveis em câncer colorretal (SCHWANDNER, et al., 2007) e outros tipos de câncer (MENESES-GARCIA et al., 2008). Contudo, Mrena e colaboradores observaram associação entre alta expressão de MMP-2, sexo masculino, maior grau de invasão local e maior estadiamento em carcinomas gástricos (MRENA et al., 2006).
Em outros estudos como o de Kikuchi et al. (2000), a expressão de MMP-14 foi mais freqüente nos carcinomas profundamente invasivos (p = 0,007) e em casos de invasão vascular (p= 0,02). A frequência de detecção de MMP-2 no estroma foi muito maior nos casos em que houve invasão vascular (42%) do que nos casos sem invasão (20%, p= 0,02). Eles verificaram ainda que a taxa de detecção de TIMP-2 no citoplasma da célula tumoral aumentou com a profundidade da invasão (p= 0,03) e que TIMP-2 no estroma foi encontrada mais freqüentemente em tumores com invasão linfática e metástase linfonodal (p<0,05). Ainda segundo esse estudo foram encontradas associações significantes entre a detecção de MMP-14 e MMP-2 (P <0,05), de MMP-14 e TIMP-2 (P <0,01), e da MMP-2 e TIMP- 2 (P <0,01) no citoplasma das células tumorais (KIKUCHI et al., 2000).
Já os resultados do estudo de Murashige et al. (1996) revelaram que os níveis de RNAm de MMP-2 foram maiores nos tumores colorretais primários do que nos tecidos normais adjacentes e que os níveis de RNAm para TIMP-2 e MMP-2 foram mais elevados nas metástases do que em tecidos normais colorretais. Os estudos de Mysliwiec e Ornstein. (2002) assim como o de Murashige et al. ( 1996) mostraram que os níveis de RNAm de MMP-2 foram significativamente elevados em tumores (em comparação com o tecido normal) .
Em relação à MMP-2, neste estudo, foi encontrado que a imunoexpressão de MMP-2 nas células neoplásicas foi negativa em todos os casos tanto nos tumores primários quanto nos metastáticos. Isso se deve possivelmente a uma menor concentração da enzima nas células neoplásicas em relação aos mononucleares associado à problemas de fixação da amostra. Quanto aos mononucleares, a positividade em 29% dos tumores primários e 50% das metástases em linfonodos sugere maior concentração desta MMP nestas células, em relação às células neoplásicas. A observação de que os mononucleares coram-se muito mais que as células neoplásicas mostra claramente a importância do microambiente tumoral no processo de invasão local e progressão tumoral do câncer.
A maior positividade de expressão de MMP-2 em células do estroma em relação às células neoplásicas tem sido descrito por outros autores, em carcinomas colorretais (SCHWANDNER et al., 2007) e de outros órgãos (PELLIKAINEN et al., 2004; TÊTU et al., 2006; TRUDEL et al., 2008). Schwandner et al. (2007) mostraram que a MMP-2 foi localizada por imunocoloração no citoplasma de células de tumor e no estroma. A imunoreatividade de MMP-2 em células estromais foi positiva em 72 de 94 casos (77%), na maior parte próximo às células tumorais, enquanto nas células tumorais foi observada em apenas 33 (35%) dos casos. A maior freqüência de positividade nos macrófagos em linfonodos, comparados aos do tumor primário, por nós observada, foi também descrita no relato de Wang et al. (2008) para o câncer gástrico. Relatos referentes ao câncer colorretal, nesta comparação, não foram evidenciados neste levantamento bibliográfico.
Em outros estudos como o de Hilska et al. (2007) foi encontrado que concentrações teciduais de MMP-2 estão aumentados em comparação com o tecido intestinal normal. Segundo Kim et al. (2006), em tumores do cólon e reto, níveis de MMP-2 foram maiores do que na mucosa normal correspondente.
Quanto à imunoexpressão de MMP-14 neste estudo, nas células neoplásicas, observou-se positividade na totalidade dos tumores primários e quase todos os casos (exceto um caso negativo) nos metastáticos. Nos mononucleares a imunoexpressão também foi predominantemente positiva, tanto nos tumores primários quanto nos metastáticos. Grande número de casos apresentou escores 2 e 3 nos dois tipos celulares e nos dois sítios anatômicos. Considerada a ativadora primordial de várias MMPs, inclusive de MMP-2, a MMP-14 tem expressão em geral elevada em vários tipos de câncer, cujo aumento está diretamente associado à elevação da expressão de MMP-2 e à diminuição dos inibidores tissulares de MMPs como TIMP-2 (ORNSTEIN; COHN, 2002; TÊTU et al., 2006; SATO; TAKINO, 2010; AL-RAAWIL et al., 2011).
Segundo Asano et al. (2008) em comparação com a mucosa normal, os tecidos com câncer geralmente apresentam níveis mais elevados de expressão de MMPs. Em seu relato, diferenças altamente significativas foram confirmados para a MMP-14 (P <0,01, Mann- Whitney U.) O estudo de Schwandner et al. (2007) mostrou que a MMP-14 foi localizada no citoplasma de células tumorais e não foi expressa no estroma e nos tecidos normais. A expressão de MMP-14 foi positiva em cerca de metade dos casos. A expressão de MMP-14 foi correlacionada com a expressão epitelial de MMP-2 (p= 0,036) e com a expressão de TIMP-2 de (p=0.002) (SCHWANDNER et al., 2007).
Quanto à imunoexpressão de TIMP-2 nesta amostra, nas células neoplásicas, foi observado que nos tumores primários predominou a positividade em 2/3 dos casos. Nos linfonodos a imunoexpressão foi positiva em todos os casos . A imunoexpressão de TIMP-2 nos mononucleares foi predominantemente positiva nos tumores primários e positiva em todos os casos, nos metastáticos. Em outros estudos como o de Baker et al. (2003) foi encontrado que níveis teciduais de TIMP-2 na mucosa normal foram maiores do que as observadas no tecido tumoral. O estudo de Kim et al., (2006) mostrou resultados semelhantes, pois a expressão de TIMP-2 em tecidos de cancer colorretal foi significativamente menor do que na correspondente mucosa normal (p = 0,0008) .
Os resultados são controversos: segundo o estudo realizado por Asano et al. (2008), as expressões de TIMP-1 ,TIMP-2, TIMP-3 E TIMP-4 em tecidos cancerosos foram quase nos níveis equivalentes da mucosa colônica normal. A expressão de TIMP-2 nos dois tipos celulares também é descrita na literatura, em câncer colorretal e de outros sítios (KIKUCHI et al., 2000; TÊTU et al., 2006), principalmente em células do estroma (KIKUCHI et al., 2000; TRUEDEL et al., 2008). O papel de TIMP-2 em sua relação com as MMPs é também considerado, por alguns, controverso. TIMP-2 forma um complexo ternário com MMP-14 e MMP-2 e é um potente inibidor de ambas, mas ao mesmo tempo, altos níveis de TIMP-2 se correlaciona positivamente com prognóstico desfavorável em pacientes com câncer (BERNARDO; FRIDMANI, 2003; STRONGIN, 2010).
Em relação aos 3 imunomarcadores não houve diferença na expressão de MMPs e TIMP-2 entre os carcinomas de colo direito e esquerdo, ou seja, estes biomarcadores participam da carcinogênese de ambas as localizações de carcinoma colorretal, sem predominar em algum deles. A freqüente expressão de MMP-2 e sobretudo MMP-14 e TIMP-2, encontrada indistintamente nos carcinomas de colo direito ou esquerdo sugere que estas enzimas participam de forma importante na progressão tumoral do carcinoma colorretal, mas que não participam diferencialmente entre os carcinomas de ambas regiões anatômicas intestinais (direita mais que esquerda ou vice-versa). Não foram encontradas publicações relativas aos achados encontrados, na literatura pesquisada.
Considerações Finais
MMP-14, MMP-2 e TIMP-2 estão frequentemente expressos em carcinomas colorretais, em suas sedes primária e principalmente nas metástases linfonodais, o que sugere participação decisiva destas proteases na invasão local e progressão tumoral destes
carcinomas. A preponderância de imunomarcação destes biomarcadores em mononucleares, principalmente macrófagos, em relação a imunomarcação das células neoplásicas, reforça a importância do microambiente tumoral no desenvolvimento das neoplasias. Tendo em vista a baixa imunomarcação de MMP-2 nas amostras de tecido analisadas é sugerido uma reavaliação deste imunomarcador utilizando-se anticorpos monoclonais de outros fabricantes. É recomendado para próximos trabalhos a utilização de tecidos com melhor fixação e que estejam bem conservados a fim de se evitar perdas de um grande número de casos pelos critérios de exclusão. O estudo da expressão das Metaloproteinases e de seus inibidores no câncer colorretal comparando-se a expressão dos mesmos em cada região anatômica do colo representa um assunto novo na oncologia e por isso é sugerido e incentivado a realização de outros trabalhos que avaliem a expressão de outras MMPs e TIMPs no câncer colorretal.
6 CONCLUSÕES
1. MMP-14 e TIMP-2 estão expressos frequentemente em carcinomas colorretais primários e nas respectivas metástases linfonodais, o que sugere participação destas proteases na invasão local e na progressão tumoral destes carcinomas. 2. A imunoexpressão semelhante em freqüência e intensidade de MMP-14, MMP-2 e
TIMP-2, nos carcinomas colorretais de localização direita ou esquerda, sugere que estas enzimas não estão vinculadas de forma específica ao desenvolvimento dos cânceres intestinais, em relação à lateralidade da localização anatômica dos mesmos.
3. A imunomarcação mais intensa de MMP-14 em tumores primários sem metástases linfonodais sugere que esta enzima participa de maneira predominante na invasão tumoral local colônica e em menor grau da progressão tumoral-linfonodal.
4. A imunomarcação intensa predominante de MMP-14, MMP-2 e TIMP-2 em mononucleares, a maioria dos quais representada por macrófagos (TAMs), em relação à expressão destes biomarcadores nas células neoplásicas, reforça a importância do microambiente tumoral para o desenvolvimento das neoplasias.
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