Os HAstV são apontados como o terceiro agente viral em importância clinica nos casos de GA no mundo, principalmente em crianças menores de cinco anos de idade (Gabbay et al., 2007a; Xavier et al., 2009; Ferreira et al., 2010; 2012a; 2012b; Jeong et al., 2011; 2012; Bosch et al., 2014). Entretanto, no Brasil, essa investigação não é realizada rotineiramente, principalmente devido à dificuldade de acesso ao diagnóstico, restritos aos centros de pesquisas onde maioria dos estudos são realizados com amostras de crianças hospitalizadas, o que dificulta o entendimento do papel desses vírus em outros ambientes, como creches e comunidades (Glass et al., 2013).
A dificuldade de genotipagem das cepas de HAstV isoladas, a grande frequência de co-infecção com outros vírus, como NoV e RVA são alguns fatores que subestimam a prevalência e o impacto das infecções por HAstV no país. No entanto, a relevância dos HAstV na saúde pública tem mudado desde a descoberta, nos últimos anos, dos novos HAstV isolados em humanos e que mostram similaridades genéticas com cepas isoladas em animais. Desde 2008, mais de 20 novos AstV foram descritos associados a doenças em animais. Neste contexto, a caracterização molecular destas cepas pode ser importante para o entendimento do papel dos HAstV no cenário de saúde pública, devido às evidências de que a transmissão de cepas de HAstV interespécies possa ocorrer (Kapoor et al., 2009; Jeong et al., 2012).
A escolha por um estudo retrospectivo se deu pela oportunidade de acesso ao banco de amostras do Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental (LVCA), IOC/FIOCRUZ, como parte do Programa da Secretaria de Vigilância da Saúde (SVS), do Ministério da Saúde (MS), visando à determinação da etiologia viral, como RV-A, NoV, HAstV e outras viroses associadas a GA. A disponibilidade de fichas epidemiológicas que geralmente fornecem informações importantes acerca dos casos, pode ajudar a definir o impacto dos HAstV nos surtos e em casos esporádicos de GA infantil. Para isso, este trabalho foi dividido em três estudo, o que possibilitou a observação de situações epidemiológicas distintas, como as infecções por HAstV em casos
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esporádicos e surtos em ambiente hospitalar, ambulatorial, creches e comunitário.
O artigo Surveillance of human astrovirus infection in Brazil: The first
report of a new MLB1 astrovirus abrangeu três importantes regiões da costa
brasileira: Nordeste (Alagoas, Bahia, Maranhão, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Sergipe), Sudeste (Rio de Janeiro, Minas Gerais e Espirito Santo) e Sul (Rio Grande do Sul e Santa Catarina) que apresentam consideráveis contrastes socioeconômico, cultural, localização geográfica, acesso à saúde pública, além dos fatores ambientais como saneamento básico e clima.
Neste estudo, foram avaliadas 2,913 amostras de fezes de crianças abaixo de cinco anos de idade com GA, atendidas em postos de saúde e hospitais públicos municipais e estaduais. Destas, 7.1% (206/ 2,913) foram positivas para HAstV pela técnica de RT-PCR, estando este percentual de acordo com a literatura que relata a frequência do HAstV nesta faixa etária, variando de 2% a 9%.(Dalton et al., 2002; Guix et al., 2002; Schnagl et al., 2002; Jakab et al., 2004; Nguyen et al., 2008; Papaventsis et al., 2008; Jeong et al., 2011; Malasao et al., 2012; Ouyang et al., 2012; Afrad et al., 2013; De Grazia et al., 2013; Bosch et al., 2014). No brasil, em um estudo realizado em São Paulo, a prevalência relatada foi de 28,2%, na mesma faixa etária do nosso estudo (Resque et al., 2007).
Considerando as diferentes regiões estudadas, o HAstV foi mais frequentemente detectado na região Sudeste (9,2%; 36/921), seguida da Sul (7.9%; 71/903) e Nordeste com (3.9%; 36/921); p < 0.001. Os primeiros estudos sobre a prevalência dos HAstV no Brasil conduzidos em diferentes estados, revelaram prevalências que variavam de 3 a 5% (Leite et al., 1991; Stewien et al., 1991; Silva et al., 2001), aparentemente menores que as relatadas neste estudo, provavelmente devido as técnicas inicialmente utilizadas para detecção dos HAstV, como a ME e o EIE. Essas duas técnicas têm sensibilidade similar, porém inferior às técnicas moleculares, como RT-PCR e RealTime-RT-RT-PCR, capazes de aumentar tanto a sensibilidade quanto a especificidade do diagnóstico destes vírus (La Cann et al., 2004; Victoria et al., 2007; Dai et al., 2010; Ferreira et al., 2012a).
O HAstV foi observado em todas as faixas etárias analisadas: 1-11 meses (6,7%), 12 a 24 meses (6,2%), 25 a 48 meses (8,7%) e 49 a 60 meses (11,9%),
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(p = 0.054) e estas observações corroboram outros estudos nos quais se observou uma maior prevalência em crianças menores de cinco anos (Lewis et al., 1989; Walter & Mitchell, 2003; Gallimore et al., 2005; Xavier et al., 2009). Estudos de soroprevalência em vários grupos etários demonstraram que esta é a faixa etária mais propensa à infecção pelos HAstV, o que não se observa na idade adulta, onde a maioria dos indivíduos apresentam anticorpos contra os clássicos e os novos HAstV (Kriston et al., 1996; Walter & Mitchell et al., 2003; Burbelo et al., 2011). Este fato indica que o contato com o vírus ocorre em algum momento da vida, principalmente durante os primeiros anos de vida (Bosch et al., 2014).
Os sintomas associados a infecções por HAstV, geralmente são brandos e auto-limitados (Mustafa et al., 2000). Esses quadros podem ser agravados levando o paciente à hospitalização, como nos observados em indivíduos com baixa imunidade ou subnutridos (Mustafa et al., 2000; Giordano et al., 2004; Bosch et al., 2014). Febre e vômitos são sintomas comuns nas infecções por HAstV e também foram observados em nosso estudo, porém mucos nas fezes foi significativamente associado à presença do HAstV, principalmente em crianças menores de um ano (p=0.012). Victoria e Col (2007) também relataram essa associação em um estudo realizado com crianças hospitalizadas no Rio de Janeiro.
Durante os sete anos deste estudo, observamos uma tendência de maior prevalência dos HAstV nos meses correspondentes ao período da primavera, apresentando similaridade com os resultados obtidos em um estudo realizado por um período de mais de cinco anos na cidade de Melbourne na Austrália e em outro estudo realizado na região centro-oeste do Brasil, onde os HAstVs foram detectados no período de outubro a dezembro de 1998, que corresponde à primavera e ao início do verão naquela região (Mustafa et al., 2000; Cardoso et al., 2002). Estudos realizados no Brasil revelaram que os HAstV foram detectados em todos os meses do ano, sendo observado uma maior prevalência nos meses mais quentes do ano (Cardoso et al., 2002; Gabbay et al., 2007b; Victoria et al., 2007), confirmando que a sazonalidade dos HAstV é controvérsia dependendo do clima e região estudada.
As amostras positivas foram sequenciadas e a análise filogenética da ORF2, que é a região utilizada para classificação dos HAstV por ser a região
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mais variável do genoma do vírus (Méndez & Arias, 2013), demonstrou que o genótipo circulante prevalente nas três regiões estudadas foi o HAstV-1, reforçando dados de diversos trabalhos realizados em diferentes países que relatam esse genótipo como o dominante (Mustafa et al., 2000; Silva et al., 2001; Cardoso et al., 2002; Dalton et al., 2002; Guix et al., 2002; Espul et al., 2004; Victoria et al., 2007; Afrad et al., 2013; Aragão et al., 2013). Na região Sul, este genótipo foi detectado em 97% das amostras positivas. Até o momento, são raros os relatos dos HAstV no Brasil, e na região Sul, esta é a primeira investigação sobre a frequência e distribuição dos genótipos dos HAstV nesta importante região brasileira. Outros genótipos também puderam ser observados, como os HAstV-2, HAstV-3 e HAstV-6 no Nordeste; HAstV-2, HAstV-4 e HAstV-8 no Sudeste e o genótipo HAstV-8 no Sul do Brasil.
As cepas brasileiras apresentaram alta identidade quando comparadas com cepas descritas em países de diferentes continentes disponíveis no GenBank, sinalizando que as introduções dessas cepas ocorrem de forma continua dependendo da região ou período estudado.
Até 2008, os HAstVs associados às infecções em humanos eram restritos aos clássicos HAstV1-8, já bem estabelecidos. Recentemente, devido às técnicas moleculares mais eficientes e acessíveis, novos HAstV vêm sendo identificados em fezes humanas apresentando características genéticas diferentes dos HAstV conhecidos, ampliando o conhecimento desta família de vírus. Esses novos vírus, denominados HAstV-MLB, HAstV-VA/HMO, apresentam similaridades genéticas com cepas de isolados em animais o que indica um possível potencial zoonótico, além de terem sido associados a doenças não entéricas, sinalizando que esses vírus não se restringem a doenças no trato gastrointestinal (Chu et al., 2010; Méndez & Arias, 2013; Bosch et al., 2014).
Diante deste cenário, foram selecionadas 200 amostras de fezes de crianças menores de dois anos de idade com GA, de diversos estados brasileiros para pesquisas dos novos HAstV (HAstV-MLB e HAstV-VA), utilizando protocolos propostos por Finkbeiner e Col (2009a). Foram identificadas duas amostras positivas para HAstV-MLB1, uma proveniente de uma criança na cidade de São Luiz do Maranhão, na região Nordeste e a outra de uma criança na cidade do Rio de Janeiro, região Sudeste, em fevereiro e
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novembro de 2011, respectivamente. Ambas as crianças tinham um ano de idade e foram atendidas numa unidade de pronto atendimento pediátrico apresentando quadro de GA. Esta foi a primeira detecção desses vírus no Brasil. O HAstV-VA não foi detectado nas amostras testadas neste estudo.
Através do sequenciamento parcial da região da ORF2, foi possível identificar e classificar as duas amostras brasileiras como pertencentes à espécie MAstV-6 HAstV-MLB1, além de demonstrar relevante homologia temporal e regional entre elas. O ICTV preconiza que seja sequenciada a ORF2 completa para a classificação dos Mamastrovirus (ICTV 2011). Nossos resultados demostraram que a região parcial da ORF2 (409 pb) não variou quando comparada com outras sequencias de HAstV-MLB disponíveis no GenBank, demostrando 100% de identidade entre elas, podendo, portanto, ser considerada uma região de escolha, não só para detecção, como também para classificação desses vírus.
Poucos estudos têm sido conduzidos com o objetivo de avaliar a presença de HAstV–MLB1 e sua associação com a GA. Os HAstV-MLB1, 2 e 3 foram relatados em crianças com gastroenterite na Austrália, Estados Unidos, Índia, México, Egito, Turquia, China, Butão, no Sul da Ásia e na Itália (Finkbeiner et al., 2008, 2009b, 2009a; Banyai et al., 2010; Ahmed et al., 2011; Mitui et al., 2013; Matsuno et al., 2013; Wang et al., 2013; Medici et al., 2014). Um estudo de caso-controle conduzido na Índia, demostrou associação dos clássicos HAstV nos casos de GA enquanto que os HAstV-MLB1 não foi possível demonstrar resultados significativos que determinassem essa relação. Um estudo realizado por Holtz e Col (2011), detectou o HAstV MLB2 na nasofaringe de uma criança com doença respiratória sugerindo que a patogenicidade deste vírus pode afetar células fora do trato gastrointestinal e que a presença deste vírus nas fezes pode ser devido ao modo de transmissão. Porém, nenhum outro patógeno foi detectado nesta amostra, sugerindo que o HAstV MLB2 foi a causa da febre no paciente. O papel desses vírus em humanos e em animais continua desconhecido (Holtz et al., 2011).
Nossos resultados demonstraram a presença do HAstV-MLB1 em dois casos de crianças com GA, embora dois casos não sejam suficientes para avaliar uma associação causal. Futuras investigações serão necessárias,
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incluindo estudos de caso-controle para entender a patogenicidade, potencial zoonótico e epidemiológico do HAstV MLB nas infecções humanas.
A análise da frequência da infecção pelos HAstV, da distribuição dos diferentes genótipos, assim como da associação desses agentes com os aspectos clínicos e epidemiológicos, gerou dados que contribuem para o monitoramento contínuo dos indicadores de morbidade e mortalidade por diarreias, uma vez que no Brasil, o papel dos RVA e dos NoV como agentes associados a GA já está bem estabelecido, havendo uma carência no conhecimento do real impacto dos novos HAstV dentro desse cenário.
No estudo Assessment of gastroenteric viruses frequency in a
children's day care center in Rio De Janeiro, Brazil: a fifteen year study (1994-2008) foram analisadas amostras de surtos e casos esporádicos de
crianças menores de cinco anos de idade, atendidas na Creche Bertha Lutz-Fiocruz no Rio de Janeiro, região Sudeste do Brasil. Para este estudo foi considerado caso de GA toda criança com história de diarreia de início agudo com até quatro dias de evolução, acompanhada ou não de febre, vômito e dor abdominal. As amostras foram coletadas pela equipe médica da creche ou em alguns casos pelo responsável direto da criança em sua própria residência.
A definição de surto ocorreu quando mais de três crianças da mesma turma apresentavam o quadro clínico descrito. Apesar do objetivo inicial deste estudo ter sido a detecção dos NoV e RVA, considerou-se que a pesquisa dos HAstVs, seria de particular relevância em termos epidemiológicos e moleculares, devido à oportunidade de se obter dados sobre a ocorrência e distribuição desses vírus em surtos e casos esporádicos ocorridos em crianças de creche num período de 15 anos.
Neste estudo, foi demonstrando que o HAstV estava presente em 6,3% (19/301) das amostras, sendo os menores de dois anos de idade a faixa etária mais acometida. Esses resultados corroboram outros estudos que descrevem a prevalência em creches variando de 2% a 11%, tanto em surtos como em casos esporádicos nas cidades de Norfolk, Virginia, Belém e no Rio de Janeiro, apresentando as mesmas características epidemiológicas do nosso estudo (Silva et al., 2001; Mitchell et al., 2002; Gabbay et al., 2007a, Victoria et al., 2007; Enserink et al., 2014). A infecção por HAstV foi observada entre os anos de 1994 e 2004, período em que ocorreram 78% (18/23) dos surtos estudados.
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Como estratégia de diminuição dos surtos ocorridos na creche, foram adotadas medidas de prevenção como: afastamento da criança e do profissional da creche durante o período da infecção, limpeza de fômites e lavagem das mãos. No período entre 2005 e 2008, houve uma diminuição do número de surtos na creche e o HAstV não foi observado durante esse período.
A caraterização molecular das amostras detectadas permitiu observar a distribuição de diferentes genótipos, sendo o genótipo HAstV-1 o prevalente, seguido dos genótipos HAstV-2, HAstV-4 e HAstV-5. Nossos resultados corroboram com o primeiro relato no Brasil de um surto de GA associado aos HAstV, realizado com crianças menores de dois anos de idade atendidas na mesma creche, onde Silva e Col. (2001) detectaram o HAstV-1 como o único genótipo presente nos espécimes examinados.
Foi interessante observar a variabilidade de espécies circulantes durante o período deste estudo. Este fato se deve ao acesso a técnicas mais eficazes, como os protocolos de sequenciamento genômico. Não foi possível associar o genótipo identificado com os dados clínicos das crianças (dados não demonstrados).
No artigo Genotyping of gastroenteric viruses in hospitalised
children: first report of norovirus GII.21 in Brazil são apresentados os dados
relativos ao estudo da frequência de HAstV em crianças menores de dois anos atendidas em um hospital público no município de Niterói, no estado do Rio de Janeiro, região Sudeste do Brasil. A distribuição dos casos estudados para HAstV compreendeu não só crianças do município de Niterói como também de outros municípios vizinhos como São Gonçalo, Maricá, Itaboraí, Araruama e Itambi.
As infecções por HAstV foram associadas a 12,7% (7/55) dos casos analisados. Estes resultados estão de acordo com os dados relatados por Victoria e Col. (2007) que avaliaram amostras de fezes de crianças menores de cinco anos de idade de três hospitais públicos na cidade do Rio de Janeiro, sendo o HAstV-1 identificado em 14% das amostras analisadas. Porém, foram superiores aos observados por Soares e Col. (2008) que analisaram amostras hospitalares negativas para bactérias patogênicas. Naquele estudo, encontraram-se 5,3% de positividade para HAstV, comuns tanto em pacientes
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hospitalizados quanto em crianças que receberam atendimento médico no serviço de emergência, em um hospital no Rio de Janeiro.
As amostras positivas pela RT-PCR foram sequenciadas, sendo todas classificadas como HAstV-1, confirmando dados anteriores que descrevem como o genótipo prevalente e frequentemente associado aos casos nosocomiais (Mustafa et al., 2000; Cardoso et al., 2002; Dalton et al., 2002; Guix et al., 2002; Espul et al., 2004; Victoria et al., 2007).
Devido ao curto período de coleta da amostragem (abril a setembro de 2003), não foi possível avaliar padrão de sazonalidade. A sazonalidade dos HAstV é bastante controvérsia e varia de acordo com a população, clima e região estudada (Méndez & Arias, 2013).
Os principais sinais clínicos observados nas crianças foram inapetência, dor abdominal, tosse e diarreia com muco. Sintomas menos frequentes também foram observados como febre e exantema. A análise estatística demonstrou que as frequências dos sintomas não estavam associadas à presença dos HAstV, possivelmente devido ao reduzido número de amostras analisadas.
Neste estudo também foram estudados a ocorrência de RVA e NoV. As crianças internadas, principalmente devido a doenças respiratórias como pneumonias, bronquites, bronqueolite, otite e cardiopatias, desenvolveram um quadro de gastrenterite pelo menos 72 horas após a sua hospitalização. É interessante ressaltar que este é o primeiro estudo de casos esporádicos de GA nosocomial por RVA, NoV e HAstV no Brasil. Infecções nosocomiais são descritas a partir de surtos, sinalizando que uma vigilância ativa para investigação dessas infecções hospitalar pode contribuir para ações de prevenção e controle dessa doença.
Alguns fatores limitam o entendimento da importância dos HAstV como agentes da GA. A grande frequência de co-infecção com outros patógenos que estão implicados nos casos de GA e a falta de diagnóstico e genotipagem dos HAstV isolados dificultam evidenciar o papel desses vírus nas infecções mistas, como observados em relatos que citam o HAstV co-infectando principalmente com RVA e NoV (Carvalho-Costa et al.,., 2006; Victoria et al., 2007; Xavier et al., 2009; Ferreira et al., 2010, So et al., 2013; Soli et al., 2014; Enserink et al., 2014; Iritani et al., 2014).
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A limitação do conhecimento atual da circulação dos diferentes vírus envolvidos nos casos de GA deve ser abordada pela pesquisa nas próximas décadas, gerando conhecimento que serão considerados nas ações de estratégias de prevenção e do controle dessas viroses (Glass et al., 2013). Estudos futuros são necessários para o entendimento do curso natural dos HAstV e suas novas cepas
O conhecimento do papel dessas viroses é um desafio e representa a principal ferramenta no auxílio na prevenção e no controle da GA no Brasil, onde, apesar dos esforços do Ministério da Saúde para modificar o quadro existente, ainda representa a segunda causa de mortalidade e morbidade das crianças menores de cinco anos de idade.
O desenvolvimento e padronização de técnicas moleculares permitiu a identificação de novos HAstV envolvidos em casos de GA. Porém, a carência de um diagnóstico simples, capazes de identificar o patógeno a beira do leito ou no campo, subestima a prevalências desses vírus e a compreensão necessária para ações de contenção para o controle da transmissão dentro dos hospitais e em comunidades (Glass et al., 2013). Em países em desenvolvimento, onde as condições de saneamento são precárias, esses agentes ocorrem muitas vezes co-infectando com outros patógenos, dificultando a associação do agente etiológico com a doença.
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