INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Medicina Tropical
ESTUDO RETROSPECTIVO DOS ASTROVIRUS HUMANOS ASSOCIADOS A CASOS DE GASTRENTERITE AGUDA EM CRIANÇAS RESIDENTES EM TRES REGIOES DO BRASIL: NORDESTE, SUDESTE E SUL NO PERIODO DE 1994 A 2011.
MARIA DA PENHA TRINDADE PINHEIRO XAVIER
RIO DE JANEIRO
II
INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Medicina Tropical
MARIA DA PENHA TRINDADE PINHEIRO XAVIER
ESTUDO RETROSPECTIVO DOS ASTROVIRUS HUMANOS ASSOCIADOS A CASOS DE GASTRENTERITE AGUDA EM CRIANÇAS RESIDENTES EM TRES REGIOES DO BRASIL: NORDESTE, SUDESTE E SUL NO PERIODO DE 1994 A 2011.
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Virologia
Orientador: Prof. Dr. Eduardo de Mello Volotão
RIO DE JANEIRO
III
Fundação Oswaldo Cruz
Pós-Graduação em Medicina Tropical
ESTUDO RETROSPECTIVO DOS ASTROVIRUS HUMANOS ASSOCIADOS A CASOS DE GASTRENTERITE AGUDA EM CRIANÇAS RESIDENTES EM TRES REGIOES DO BRASIL: NORDESTE, SUDESTE E SUL NO PERIODO DE 1994 A 2011.
Autora: Maria da Penha Trindade Pinheiro Xavier Orientador: Dr. Eduardo, de Mello Volotão
EXAMINADORES:
Dra. Flavia Barreto dos Santos – FIOCRUZ/RJ (Presidente da banca) Dra. Patrícia Brasil - FIOCRUZ/RJ
Dra. Elba Regina Sampaio de Lemos - FIOCRUZ/RJ Dra. Tatiana Xavier de Castro – UFF/RJ
Dra. Debora Regina Lopes dos Santos – UFRRJ
Suplentes:
Dra. Luciane Almeida Amado Leon – IOC/FIOCRUZ Dra. Adriana de Abreu Corrêa – UFF/FIOCRUZ
V
Trabalho realizado no Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, com o apoio financeiro e operacional do Programa de Excelência em Pesquisa/Conselho Nacional de Pesquisa (PROEX/CNPq) e da Fundação Oswaldo Cruz.
VI
Dedico esta tese à minha irmã, carinhosamente chamada por Bê, que não faz mais parte deste mundo terreno. Recebi a notícia que tinha passado no curso de doutorado no mesmo dia em que fui acometida pela notícia da sua doença, mesmo assim comemorou comigo. À ela, todo o meu eterno amor.
VII
“Eu não me preocupo com as coisas que sei que não sei. Eu só me preocupo com as coisas que não sei que não sei. Porque as coisas que eu sei que eu não sei, é fácil, é só procurar, que eu vou saber. Porém, as coisas que eu não sei que não sei, não tenho nem por onde começar! ”
VIII
AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente a Fundação Oswaldo Cruz por ter sido a minha verdadeira escola responsável por tudo que aprendi profissionalmente. Quem conhece sabe da importância desta casa na formação do indivíduo na área de Saúde Pública. Quando ingressei no curso de Doutorado, conheci o lado acadêmico da FIOCRUZ, e pude constatar que é uma escola que se leva para a vida toda. É nítido o comprometimento com o saber, com o querer que o aluno saiba, com o compromisso de se chegar à população todo o conhecimento produzido. Se eu já admirava está instituição, hoje me sinto grata por fazer parte deste universo do saber.
Ao corpo docente, secretaria e à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do IOC pelo auxilio constante durante o doutorado.
A todas as crianças que participaram da pesquisa e aos seus pais por permitirem participar deste estudo.
À Dra Marize Pereira Miagostovich. É uma imensa honra e orgulho tê-la como chefe e amiga. Não esqueço dos seus conselhos, ensinamentos e as cobranças, que sei que fazem parte do meu crescimento. Agradeço pelo exemplo de profissional e mulher e por confiar a mim este e outros projetos em curso no nosso laboratório.
Ao amigo Dr. José Paulo Gagliardi Leite por confiar a mim este trabalho e me dar a oportunidade de fazer parte da equipe do Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental. Obrigada por todos os momentos em que precisei da sua orientação e amizade.
Ao Dr. Filipe Anibal Carvalho-Costa, pela força no início do doutorado, pelo apoio estatístico dos artigos e por todo carinho dispensado durante o período de convivência.
IX
Ao meu orientador Eduardo de Mello Volotão, pela amizade e carinho dispensados durante todos esses anos. Sou imensamente grata pelo incentivo e ajuda no estudo filogenético, nas observações críticas e submissão do manuscrito e leitura atenta a esta tese.
Aos meus pais biológicos Manoel e Izabel (in memoriam), pela oportunidade da vida. A minha eterna saudade.
A minha família adotiva, Nélio, Elisa, Daniele e Nelinho, pela oportunidade de estudo, sem eles o meu caminho teria sido bem mais difícil.
Aos meus irmãos, Inha, Zé, Bê, Lena, Tata, Bel e Manel, sempre presentes em todos os meus momentos.
À minha secretária Suely por cuidar da minha família nos momentos em que eu precisei me ausentar.
A minha amiga Mônica Simões Rocha pela parceria nos artigos publicado, sem essa parceria seria impossível a realização desta tese. Por todos os momentos difíceis ou alegres que vivenciamos e principalmente por suas palavras de incentivo e amizade.
A minha amiga Juliana Andrade, não só pelos momentos de descontração e gargalhadas, mas por me ajudar na formatação das figuras desta tese, submissão de manuscrito e por falar sempre: Calma! A você o meu imenso carinho.
Um agradecimento especial a Silvana Augusta, pela amizade e olhar carinhoso, fraternal mesmo, que me dá uma imensa paz.
À Francisca Alves, o meu muito obrigada por ser essa pessoa maravilhosa e querida. Por toda luz e união que traz ao LVCA.
X
Preciso homenagear ainda, toda a equipe do LVCA, que de alguma forma, individualmente ou no coletivo, contribuíram na realização deste trabalho: Tulio Fumian, Rosane Assis, Marcia Pimenta, Marcia Terezinha Baroni, Mariela, Sergio Molta, Fernando Cesar, Marcelle Figueira, Carmen Baur, Irene Trigueiros, Julia Fioretti, Tatiana Rose, Matias Victoria, Fernando Lopes, Alexandre Fialho, Ana Pinto, Isabele Luz, Marcelle Bottecci, Matheus Assis e Thais Ramos. Todos vocês têm uma parcela de contribuição neste trabalho, seja por uma palavra, um conselho ou uma ajuda na bancada. A toda equipe o meu muito obrigada.
Um agradecimento especial a minha aluna de Iniciação Cientifica, Fernanda Kreischer Bandeira Diniz por toda a competência demostrada durante os experimentos. Você é um orgulho!
À Dra. Jussara Pereira do Nascimento (in memorian), ícone da virologia, pelo primeiro convite que recebi para fazer o curso de mestrado, que foi o início de tudo.
Aos meus amigos do condomínio e às amigas Analin, Ana Cristina, Claudia, Gleizer e Marcia por brindarem por mim com um chope ou um champanhe sempre gelado mesmo na minha ausência.
Aos meus amigos da Medicina Tropical, Alexandre Silva, Jorlan Fernandez, Helena Medina, Liana Strecht, Lyana Lima e Nathalia Lazarini. O meu imenso carinho e eterna amizade. Que nossos copos nunca fiquem vazios e que sejamos sempre feitos de Titanium.
Por último, porém os mais presentes na minha vida, Deus e a minha família, em especial ao meu marido Luiz, ao meu primogênito Victor Hugo e ao caçula João Pedro pela parceria e por todo o aprendizado como mãe.
XI
INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Medicina Tropical
RESUMO
Os astrovírus humanos (HAstVs) pertencem a família Astroviridae e são associados a gastrenterite aguda (GA) em crianças menores de cinco anos, tanto nos países desenvolvidos como naqueles em desenvolvimento, o que os tornam de interesse no campo da Saúde Pública. A família Astroviridae é dividida em dois gêneros: Avastrovirus e Mamastrovirus. No gênero Mamastrovirus, encontram-se os astrovirus associados à infecção em mamíferos, tanto humanos como animais. Até 2008, os astrovirus associados a doenças em humanos eram restritos a oito genótipos, conhecidos como HAstV 1-8. A partir de então novos HAstVs foram sendo descritos, associados a doenças em humanos, como os HAstVs MLB1-3 e os HAstVs VA1-4.O presente estudo consiste no estudo epidemiológicos retrospectivos (1994 a 2011) para detecção e caracterização molecular de HAstV em amostras de fezes provenientes de crianças com menos de cinco anos de idade com GA, em diferentes regiões do Brasil: Nordeste, Sudeste e Sul. Incluem-se neste trabalho três estudos: 1) Estudo dos HAstV em casos esporádicos de GA ocorridos em crianças menores de cinco anos de idade, em três regiões brasileiras (Nordeste, Sudeste e Sul), durante o período de 2005 a 2011, incluindo a pesquisa dos novos HAstV; 2) Estudo dos HAstV em crianças com GA, atendidas na creche Bertha Lutz, FIOCRUZ-RJ, durante o período de janeiro de 1994 a dezembro de 2008; 3) Estudo dos HAstV, em crianças menores de dois anos de idade, com GA, hospitalizadas no município de Niterói-RJ no período de abril a setembro de 2003. A detecção dos HAstV foi realizada utilizando diferentes protocolos de detecção e caracterização molecular como: Reação em Cadeia pela Polimerase, precedido de Transcrição Reversa (RT-PCR), RT-PCR em única etapa (“OneStep”RT-PCR) e Reação em Cadeia pela Polimerase em Tempo Real (“RealTime”-PCR). Os HAstV detectados até o momento foram caracterizados por sequenciamento parcial dos genes localizados na região da ORF2 do genoma viral. O estudo 1 demonstrou a frequência de detecção de HAstV em 7.1% das amostras analisadas, além de descrever o primeiro HAstV-MLB1 no Brasil. A caracterização molecular das amostras detectadas permitiu identificar a circulação dos genótipos HAstV-1, 2, 3, 4, 5, 6 e 8. O estudo 2 demonstrou a presença de HAstV em 6,3% dos casos de GA em creche e a circulação dos genótipos HAstV-1, 2, 4 e 5, durante os 15 anos de estudo. No estudo 3, o HAstV foi detectado em 12.7% das amostras de fezes de crianças hospitalizadas, sendo o HAstV-1 o único genótipo identificado. Nossos resultados apontam para a circulação de diferentes genótipos de HAstV na população com menos de cinco anos de idade, corroborando com a literatura que descreve o genótipo HAstV-1 como o mais frequentemente detectado. O HAstV-MLB1 foi detectado pela primeira vez em amostras brasileiras, circulando em diferentes regiões e períodos. Os dados obtidos neste estudo reforçam a importância da investigação dos HAstV dentro dos cenários das gastrenterites, uma vez que existe uma carência de dados disponíveis na literatura.
XII
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ABSTRACT
Human astrovirus (HAstVs), belong to Astroviridae family, and are associated with acute gastroenteritis (GA) in children under five years-old, both in developed and in developing countries, which makes them of interest in the Public Health field. The Astroviridae family is divided into two genera:
Avastrovirus and Mamastrovirus. Mamastrovirus are the astroviruses
associated to infection in mammals, both humans and animals. By 2008, the astrovirus associated with human disease were restricted to eight genotypes, known as HAstV 1-8. Since then, new HAstVs have been described, associated with human disease, such as HAstVs MLB1-3 and HAstVs VA1-4. The present study is the retrospective epidemiological study (1994 to 2011) for the detection and molecular characterization of HAstV in stool samples from children under five years old presenting GA, in different regions of Brazil: Northeast, Southeast and South. Three studies are presented: 1) Study of HAstV in sporadic cases of GA occurred in children under five years old in three Brazilian regions (Northeast, Southeast and South) from 2005 to 2011, including the description of a new HAstV; 2) Study of HAstV in children with GA, attending the day care Bertha Lutz, FIOCRUZ-RJ from January 1994 to December 2008 and 3) Study of HAstV in children under two years old presenting GA and hospitalized in Niteroi, Rio de Janeiro from April to September 2003. The detection of HAstV was performed using different protocols for detection and molecular characterization such as: Reverse–transcriptase polymerase chain reaction, (RT- PCR), Single step RT -PCR (“OneStep "RT-PCR) and RealTime RT- PCR. The HAstV detected were characterized by partial sequencing of ORF2 region of the viral genome. The study 1 demonstrated the HAstV detection frequency in 7.1 % of samples, and described the first ASTV MLB1 in Brazil. The molecular characterization identified the circulation genotypes HAstV -1, 2, 3, 4, 5, 6 and 8. The study 2 showed the presence of HAstV in 6.3% of cases of GA in the daycare and the circulation of genotypes HAstV -1, 2, 4 and 5, during the 18 years of study. In study 3, the HAstV was present in 12.7 % of samples from hospitalized children stool, and only HAstV -1 genotype was detected. Our results point to the existence of different genotypes HAstV in the population under five years old, and confirming the HAstV -1 as the most frequently detected genotype. The HASTV - MLB1 was first identified in Brazilian samples, circulating in different regions and periods. The data from this study reinforce the importance of research of HAstV within the scenarios of gastroenteritis, since there is a lack of data available in the literature.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
aa – Amino ácido
AAstV – Gênero Avastrovirus
ANV - Astrovírus de nefrite de aves ANV -1 – Astrovírus nefrite de galinha
BAstV – Astrovírus de morcegos (do inglês Bats Astrovirus)
BdAstV –Astrovírus de golfinhos (do inglês Bottlenose dolphins Astrovirus) BoAstV – Astrovírus de bovino (do inglês Calf Astrovirus)
CAstV - Astrovírus de galinha (do inglês Chicken Astrovirus) CaAstV - Astrovírus de canino (do inglês Canine Astrovirus) CcAstV – Astrovírus de cervos (do inglês Deer Astrovirus)
CDC - Centro de Controle de doenças (do inglês Control Disease Center) CEP – Comitê de Ética e Pesquisa
CO – Centro Oeste
CSAIAstV – Astrovírus de leões marinhos (do inglês Sea lions Astrovirus) DAstV – Astrovirus de patos (do inglês Ducks Astrovirus)
DF – Distrito Federal
EIE - Ensaio Imuno Enzimático EUA – Estados Unidos da America
FeAstV - Astrovírus de felino (do inglês Cats Astrovirus) fsRNA - Ácido Ribonucleico de fita simples
HAstV – Astrovírus humano (do inglês Human Astrovirus) HAstV MLB – Astrovírus Melbourne de humanos
HAstV VA – Astrovírus Virginia de humanos
HIV- Virus da Imunodeficiência humano (do inglês Human Immunodeficiency
Virus)
ICTV – Comitê Internacional de Taxonomia Viral (do inglês International
Committee on Taxonomy of Viruses).
IF - Imunofluorescência
IME – Imuno Microscopia Eletrônica kDa - Quilodaltons
LACEN – Laboratório Central
XIV
MAstV – Gênero Mamatrovirus
ME - Microscopia Eletrônica
MiAstV – Astrovírus de mustelídeo (do inglês Minks Astrovirus) MP - Máxima Parcimônia
MS - Ministério da Saúde
NASBA - Nucleic acid sequence based amplification - Amplificação baseada na sequência do ácido nucléico (do inglês Nucleic Acid Sequence Based
Amplification).
NE – Nordeste NO – Norte NoV - Norovírus
NSP – Proteína não estrutural (do inglês Non Structural Protein) OAstV - Astrovírus de ovino (do inglês Sheep Astrovirus)
ºC – Graus centígrados
OneStep-RT-PCR - – Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em etapa única (do inglês OneStep-Polymerase Chain Reation) ORF - Fase aberta de leitura (do inglês Open Reading Frame)
PAstV -– Astrovírus de suíno (do inglês Pig Astrovirus) PNI – Programa Nacional de Imunização
PS –Proteína estrutural (do inglês Structural Protein)
qPCR - Reação em cadeia pela polimerase quantitativa RAstV – Astrovírus de ratos (do inglês Rat Astrovirus)
Real Time - RT-PCR - – Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela
polimerase em tempo real (do inglês Real Time Reverse Transcriptase –
Polymerase Chain Reaction )
RFS – Sítio de reconhecimento ribossomal (Ribossomal Frameshift Signal) RT-PCR – Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (do inglês Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)
RV-A – Rotavírus da espécie grupo A SE – Sudeste
SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde
TAstV – Astrovírus de perus (do inglês Turkey Astrovirus) VP - Proteína Viral (do inglês Viral Protein)
XV
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Filogenia da Família Astroviridae incluindo o gênero Mamastrovirus
baseada na análise da ORF2 de acordo com a classificação proposta ICTV, 2011. Os astrovírus de origem humana estão em vermelho (Adaptado de Bosch et al., 2014) 19
Figura 2 - Diagrama esquemático da organização do genoma do astrovírus
humano. RNA subgenômico detectado no citoplasma de células infectadas (Adaptado de Bosch et al.,2014)
(Http://pdbj.org/emnavi/emnavi_detail.php?id=emdb-5413, Acesso 06/05/2015) 20
Figura 3 - Morfologia do astrovírus. Micrografia eletrônica das partículas de
astrovírus, algumas com aspecto estelar (Cortesia de C. Humphrey, CDC, EUA) 21
Quadro 1 - Estudos dos Clássicos HAstV em casos de gastrenterite
XVI SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 17 1.1 Considerações gerais ... 17 1.3 Os Astrovírus Humanos ... 19 1.3.1 Breve Histórico ... 19 1.3.2 Classificação e morfologia ... 19
1.3.3 Patogênese e manifestações clínicas ... 25
1.3.4 Diagnóstico laboratorial ... 27
1.3.5 Epidemiologia dos astrovirus no mundo ... 28
1.3.6 Epidemiologia dos Astrovírus no Brasil ... 29
1.3.6 Prevenção e controle ... 32 2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO... 34 3. OBJETIVOS ... 35 3.1 Objetivo geral ... 35 3.2 Objetivos específicos ... 35 4. METODOS E RESULTADOS ... 36
4.1 - Artigo 1 - Surveillance of human astrovirus infection in Brazil: The first report of a new MLB1 astrovirus. ... 36
4.2 - Artigo 2 - Assessment of gastroenteric viruses frequency in a children's day care center in Rio De Janeiro, Brazil: a fifteen year study (1994-2008). ... 63
4.3 - Artigo 3 - Genotyping of gastroenteric viruses in hospitalised children: first report of norovirus GII.21 in Brazil... 82
5. DISCUSSÃO ... 92
6. CONCLUSÕES ... 101
7. PERSPECTIVAS ... 102
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
Gastroenterite é um termo abrangente para várias condições patológicas do trato gastrointestinal, cuja principal manifestação é a diarreia, podendo ou não estar associada a náuseas, vômitos e dor abdominal. A gastrenterite aguda (GA) é uma doença caracterizada pela inflamação do intestino e geralmente de origem infecciosa, sendo a desidratação uma das piores consequências, podendo ser grave e fatal em crianças e indivíduos imunocomprometidos ou idosos. Especialmente em crianças menores de cinco anos de idade, representa um problema social, econômico e de saúde pública relevante tanto nos países em desenvolvimento quanto nos desenvolvidos (Glass et al., 2013). Após as doenças respiratórias agudas, a diarreia infantil representa a mais importante causa de morbidade e mortalidade infantil nos diferentes continentes. Embora seja rara, a mortalidade por essa doença em países desenvolvidos, onde a população tem acesso a programas de saúde, ainda se observa alta taxa de morbidade, o que representa alto custo para esses países. É também um indicador de saúde capaz de expressar desigualdade social, pois a doença se apresenta de forma mais grave em populações infantis expostas às piores condições de saneamento e nutrição, além do acesso ao sistema de saúde ser precário ou mesmo inexistente (Barreto, 2007; Black et al., 2010; Wardlaw et al., 2010; Rasella et al 2013).
A etiologia das GA é complexa e diversos patógenos são associados às doenças diarreicas, sendo que as infecções intestinais bacterianas e parasitárias são diretamente relacionadas às condições de saneamento e socioeconômicas da população enquanto que os vírus representam um problema de saúde pública independente das condições econômicas e ambientais.
No que se refere à etiologia das infecções virais, destacam-se os rotavírus do grupo A (RVA), por suas altas taxas de prevalência em todo o mundo. Entretanto, outros agentes, como os norovírus (NoV), astrovírus humano (HAstV) e adenovírus entérico (AdV), vêm assumindo uma importância
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cada vez maior como causa de episódios de GA (Glass et al., 2013, Méndez & Arias, 2013).
A GA é uma síndrome resultante da infecção da mucosa intestinal, que acometem tanto humanos como animais. Sem sinais clínicos que permitam um diagnóstico diferencial do agente etiológico associado a esta doença, a identificação deste é feita através de diagnóstico laboratorial (Glass et al., 2013).
A transmissão da GA é fecal-oral e geralmente acontece através de ingestão de água e alimentos contaminados, do contato pessoa-pessoa, contato com fômites ou mesmo através de aerossóis produzidos durante os episódios de vômito, com destaque para as precárias condições de higiene e saneamento (Meakins et al., 2003; Méndez & Arias, 2013). Por ser agente de fácil disseminação, devem ser consideradas várias fontes de infecção como água destinada ao consumo humano, água de piscinas, rios, alimentos, ambientes fechados como creches, escolas, asilos, ambientes domésticos, enfermarias e hospitais (Leite et al., 1991; Victoria et al., 2007; Jeong et al., 2012; Méndez & Arias, 2013). A presença de HAstVs foi demonstrada em resíduos biológicos sólidos de esgoto e nas amostras coletadas na entrada da rede de tratamento (Le Cann et al., 2004; Fumian et al., 2013) e, a detecção destes vírus em águas tratadas demonstra que os HAstVs não são efetivamente eliminados durante o processo de tratamento (Méndez & Arias, 2013).
As manifestações clínicas típicas das GA incluem diarreia, náuseas, febre, dores abdominais, cefaleia e vômito. Todos os sinais e sintomas da GA podem apresentar-se individualmente ou em conjunto e assemelhar-se àqueles causados por outras etiologias (toxinas, drogas, etc). Em lactentes e crianças, a acentuada perda de eletrólitos e líquidos provocada por quadros de diarreia grave pode levar à desidratação e a complicações que podem resultar em óbito (Sdiri-Loulizi, 2009; Fischer et al., 2012; Rasella et al.,2013).
As infecções sintomáticas são mais comuns em crianças entre seis meses e dois anos de idade, enquanto que as assintomáticas são comuns em lactentes com menos de seis meses de vida, período em que há proteção por anticorpos maternos adquiridos de forma passiva (Méndez & Arias, 2013). A
19
GA é uma doença autolimitada, porém, a correção da perda de água e eletrólitos através da terapia de reidratação oral ou intravenosa é necessária para evitar que a doença evolua para quadros mais graves (Fischer et al., 2012).
Uma das formas que facilita a disseminação dos HAstV, é através da eliminação do vírus nas fezes de indivíduos assintomáticos, onde o indivíduo infectado excreta o vírus nas fezes por um período de até duas semanas, ampliando a transmissibilidade (Méndez & Arias, 2013).
1.3 Os Astrovírus Humanos
1.3.1 Breve Histórico
A associação dos HAstV com as gastrenterites no homem ocorreu em 1975, em estudos realizados por Appleton & Higgins (1975), que visualizaram através da microscopia eletrônica (ME) numerosas partículas arredondadas de pequenos vírus, com tamanhos que variavam de 28-30nm de diâmetro, em espécimes fecais de recém-nascidos hospitalizados e de surtos em maternidades. Ainda em 1975, Madeley & Cosgrove, usaram o termo astrovírus (AstV) para descrever os pequenos vírus arredondados, com uma aparência característica de estrela ("Astron", do grego: estrela), encontrados nas fezes de crianças hospitalizadas com gastroenterite.
1.3.2 Classificação e morfologia
Os HAstV pertencem a família Astroviridae, constituída por dois gêneros,
Mamastrovirus (MAstV) e Avastrovirus (AAstV). Inicialmente, a família Astroviridae consistiu um único gênero, Astrovírus, com base na morfologia da
partícula. No entanto, mais tarde, dois gêneros foram estabelecidos com base em seus hospedeiros de origem: MAstV e AAstV, infectando espécies de mamíferos e aves, respectivamente (Mendez & Arias, 2013).
Embora inicialmente detectados nas fezes das crianças, os HAstVs também foram encontrados nas fezes de uma ampla variedade de espécies de
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mamíferos, bem como em espécies de aves, domésticas ou selvagens (Bosch et al, 2014).
De acordo com a última atualização proposta pelo Comitê Internacional sobre Taxonomia de Vírus (ICTV, 2011) que foi baseada na análise filogenética da ORF 2 (Figura1), no gênero MAstV encontram-se os HAstVs que infectam o homem, sendo este dividido em quatro diferentes grupos de MAstV: MAstV 1, (Os clássicos HAstV 1-8), MAstV 6 (HAstV- MLB), e os MAstV 8 e MAstV 9 (HVA/HMO), além de outros vírus que infectam outros mamíferos como bovinos (BoAstV-1 e 2), felinos (FAstV-1), suínos (PAstV-1), mustelídeos (MiAstV-1), ovinos (OAstV-1), caninos (CaAstV), morcegos (BAstV), ratos (RAstV), cervos (CcAstV) e mamíferos marinhos como leões marinhos (CAIAstV) e golfinhos (BdAstV).
O gênero Avastrovirus inclui AstVs de aves como patos (DAstV-1), perus (TAstV-1-2) e galinhas (CAstV-1), assim como o vírus causador da nefrite em galinhas (ANV-1 e 2) (Méndez & Arias, 2013; Bosch et al., 2014).
Desde a primeira associaçao entre os astrovírus e doença em humanos em 1975 por Madeley e Cosgrove, oito sorotipos/genotipos de astrovírus, conhecidos como HAstV 1-8, foram identificados e bem caracterizados (Méndez & Arias, 2013) representando aproximadamente cerca de 10% dos casos de diarreia esporádicos, principalmente em crianças abaixo de cinco anos de idade (Bosch et al., 2014). A partir de 2008, devido à utilização de técnicas moleculares mais eficientes e acessíveis, novos HAstV vêm sendo identificados em amostras fecais de origem humana apresentando características genéticas, diferentes dos HAstV conhecidos, ampliando o conhecimento desta família de vírus.
Os HAstV-MLB, foram inicialmente identificados em amostras de fezes de crianças na cidade de Melbourne na Austrália (Finkbeiner et al., 2009a) e, em estudos posteriores, em diferentes partes do mundo, nomeados de MLB1, MLB2 e MLB3 (Finkbeiner et al., 2009b; Jiang et al., 2013).
Em 2009, um segundo grupo de novos astrovírus foi descrito pela primeira vez em um surto de gastroenterite sem etiologia definida, ocorrido em crianças na cidade de Virginia nos Estados Unidos (Finkbeiner et al., 2009c) e
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simultaneamente descrito nas amostras oriundas da Nigéria, Pasquistão e Nepal (HMO, do inglês Human-Mink-Ovine-like astrovirus), denominado HastV-VA/HMO (Kapoor et al, 2009; Jiang et al., 2013). Um vírus muito semelhante ao HAstV-VA/HMO foi detectado em tecido cerebral de uma criança imunocomprometida, sendo este o primeiro relato de um HAstV associado a encefalite em humanos (Quan et al., 2010; Burbelo et al., 2011).
No esforço em definir a prevalência dos astrovírus associados a casos de doenças em humanos, novos vírus vêm sendo descobertos e descritos como novos astrovírus. A análise comparativa dos genomas desses vírus confirmam que estas novas estirpes virais possuem pequenas variações entre e até mesmo dentro do mesmos clusters aos quais estes vírus estão inseridos, confirmando que esses são geneticamente divergentes das espécies de HAstV clássicos. (Bosch et al., 2014).
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Figura 1. Filogenia da Família Astroviridae incluindo o gênero Mamastrovirus
baseada na análise da ORF2 de acordo com a classificação proposta ICTV, 2011. Os astrovírus de origem humana estão em vermelho (Adaptado de
Bosch et al., 2014).
A nova classificaçao dos HAstV proposta no 9º Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV, 2011) foi baseada na análise filogenética da sequencia de aminoacido da região aberta de leitura 2 (do ingles Open
Reading Frame - ORF2) que codifica a proteina do capsideo viral e representa
a regiao mais variável do genoma do vírus, conforme apresentada na árvore filogenetica (Figura 1) (Méndez & Arias, 2013, Bosch et al., 2014).
Mamastrovirus
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O genoma viral é constituído por uma molécula de RNA de fita simples (fsRNA), com polaridade positiva e aproximadamente 6800 nucleotídeos, sendo composto de 30% de adenina (A), 22% de citosina (C), 23% de guanidina (G), 25% de uracila (U), além de extremidades não codificantes 3’ e 5’. Na extremidade 3’ existe uma cauda poli-A, contendo 31 adeninas (A) (Méndez & Arias, 2013).
O genoma viral se apresenta organizado em três fases abertas de leitura, denominadas ORF1a e ORF1b, localizadas próximas à extremidade 5’ e codificam proteínas não estruturais, isto é, as polimerases e as proteases, e a ORF2, localizada próxima à região 3´ do genoma, codifica as proteínas estruturais, precursoras do capsídeo viral (VP2), as quais são expressadas a partir de um RNA subgenômico. Recentemente, foi descrito nos clássicos HAstV e em outros AstV de mamíferos, uma região denominada de ORFX, cuja função ainda não foi estabelecida (Figura 2) (Bosch et al, 2014).
Figura 2 - Diagrama esquemático da organização do genoma do astrovírus
humano. RNA subgenômico detectado no citoplasma de células infectadas (adaptado de Bosch et al., 2014).
O produto da tradução da ORF1a é chamado de proteína não estrutural 1a (NSP1a), com massa molecular de 103 kDa, enquanto que o produto da tradução da ORF1b é uma proteína de fusão (NSP1a/1b) de 160 kDa. Ambas são processadas proteoliticamente para gerar as proteínas virais implicadas na replicação do genoma viral (Geigenmüller et al., 2002)
24
As sequências de nucleotídeos (AAAAAAAC), na junção da ORF1a/ORF1b, representam sequências altamente conservadas e estão localizadas no sítio de reconhecimento do ribossomo (do inglês ribossomal
frameshift signal-RFS) e acima do sítio de iniciação de transcrição do RNA
sub-genômico (Figura 2) (Bosch et al., 2014).
O diâmetro das partículas de AstVs pode variar dependendo da sua origem e do método de preparação usado para a ME. Verificou-se que os HAstV-2 propagados em cultivos celulares epiteliais de rim de macaco Rhesus (LLCMK2) na presença de tripsina, exibem partículas com simetria icosaédrica e projeções bem definidas na superfície do vírus, alcançando o diâmetro de 41nm. Quando submetidos a tratamento alcalino (pH 10,0) as partículas virais se transformam e apresentam a morfologia estelar típica (Figura 3) (Risco et al., 1995; Méndez & Arias, 2013).
Figura 3 - Micrografia eletrônica das partículas de astrovírus, algumas com
25 1.3.3 Patogênese e manifestações clínicas
A patogênese da infecção pelos HAstV é pouco conhecida, estudos envolvendo voluntários já foram realizados com o intuito de determinar a presença e frequência das manifestações clínicas e a magnitude da excreção viral (Bosch et al., 2014). Um estudo de revisão demonstrou que, o período de incubação dos HAstV, apresenta uma média de 4,5 dias após à ingestão de partículas infecciosas (Lee et al., 2013a).
Tipicamente, a infecção HAstV induz uma diarreia aguda e aquosa que dura entre 2 e 3 dias, associada a vômitos, febre, anorexia e dores abdominais. O vômito é menos prevalente em infecção HAstV que em RVA ou infecção por NoV. As infecções por HAstV também mostram um período de incubação mais longo e dados de estudos em voluntários adultos e surtos de gastroenterite em uma creche apresentaram o período de incubação médio de infecções calculado em 4,5 dias (Lee et al., 2013a). Em geral, a diarreia causada pela infecção por HAstV é mais branda do que as causadas por RVA ou NoV, e resolve-se espontaneamente, entretanto, em alguns casos, faz-se necessário a hospitalização para restabelecimento do paciente. Embora as infecções assintomáticas tenham sido descritas em crianças e adultos, a prevalência de HAstV em indivíduos assintomáticos ainda tem de ser caracterizada. (Maldonado et al, 1998; Gabbay et al., 2005; Bosch et al., 2014).
Estudos sorológicos indicam que a maioria das crianças são infectadas com HAstV e desenvolvem anticorpos contra o vírus no início da vida (Kriston et al 1996, Koopmans et al, 1998), podendo proporcionar proteção contra futuras infecções. É importante destacar que a relação de infecção do HAstV para a etiologia da intussuscepção em crianças também foi estudada. Embora com menos frequência do que a infecção por RVA, a infecção por HAstV também tem sido identificada como um fator de risco potencial para a intussuscepção (Aminu et al., 2009; Jakab et al., 2007; Lee et al., 2013b).
Diversos estudos associam o HAstV com casos de diarreia aguda em pacientes imunocomprometidos, incluindo adultos (Gallimore et al., 2005; Cubbit et al., 1999) e enterocolite necrozante em crianças prematuras (Bagci et al., 2008). Um estudo realizado na Alemanha também mostrou que as
26
infecções HAstV pode se espalhar sistemicamente e causar infecções letais graves e disseminadas em crianças imunocomprometidas (Wunderli et al., 2011). Um estudo sobre AstVs murinos (MuAstVs) foi capaz de demonstrar uma distribuição de vírus para além do trato gastrointestinal (baço, fígado e rim) em camundongos imunocomprometidos (Yokoyama et al., 2012).
Em seres humanos, estudos envolvendo voluntários foram realizados com o intuito de determinar a presença e frequência das manifestações clínicas e a magnitude da excreção viral (Moser et al., 2005). Em indivíduos sintomáticos, partículas de HAstVs foram detectadas no epitélio basal das vilosidades, na superfície epitelial a partir de biópsias planas e em macrófagos da lâmina própria (Mitchell, 2002). A infecção parece estar restrita às vilosidades dos enterócitos e ao epitélio exposto (Phillips et al., 1982).
O relato dos achados obtidos em uma criança receptora de medula óssea humana que apresentou diarreia grave por HAstV demonstrou que a replicação viral envolveu os enterócitos que recobrem dois terços da região apical das vilosidades do intestino delgado, com a liberação de partículas virais por descamação no lúmen intestinal (Sebire et al., 2004). A coloração por imunohistoquímica revelou um aumento progressivo dos HAstVs no intestino delgado, com uma infecção mais extensa no jejuno, se comparado ao duodeno. Não se demonstrou qualquer envolvimento gástrico. Anormalidades morfológicas detectadas no intestino sugerem que, apesar da diarreia grave, a resposta inflamatória não está inicialmente envolvida na patogênese desses vírus (Sebire et al., 2004; Méndez & Arias, 2013).
A falta de informações adicionais sobre a histopatologia na infecção por HAstV deve-se, em parte, à ausência de um modelo animal de pequeno porte que servisse de modelo para melhor entender-se a doença causada por esses vírus. Mais recentemente foi isolado de aves um novo AstV que causa mortalidade por uma síndrome entérica observada em um grupo de perus, sendo que esse vírus (TAstV- 2) tem sido utilizado em estudos sobre replicação e propagação sistêmica do AstV (Koci et al., 2004; Behling-Kelly et al., 2002;).
A gravidade da infecção pelos HAstV é considerada menor em relação aos outros agentes entéricos, como os RVA e os NoV, porém o quadro clínico
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pode ser agravado quando associado ao uso contínuo de antibióticos ou ainda por infecção mista ou imunodeficiência (Méndez & Arias, 2013).
1.3.4 Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial dos HAstV baseia-se na detecção direta do vírus nas fezes. A técnica de ME foi o primeiro método utilizado para identificação do vírus e durante muito tempo era a única forma de detecção dos HAstV (Madley & Cosgrove, 1975). A técnica de Imuno Microscopia Eletrônica (IME) é utilizada em pesquisa quando a excreção de partículas virais é baixa ou quando se pretende avaliar a resposta imunológica aos HAstV. Ambos os métodos possuem sensibilidade limitada, mas permitem a visualização das partículas virais e a detecção de co-infecção (Herrmann et al., 1990; Méndez & Arias, 2013).
Embora a propagação dos clássicos HAstVs em cultura de célula seja possível, o isolamento do vírus em cultura de células não é aplicável para diagnóstico destes vírus em espécimes fecais. Entretanto, a cultura de células permitiu o desenvolvimento de testes diagnósticos como o Ensaio Imuno Enzimático (EIE) e imunofluorescência (IF). O EIE detecta tanto antígenos virais quanto anticorpos, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais para grupo específicos e a IF é utilizada em pesquisa de diferentes sorotipos do HAstV (Méndez & Arias, 2013).
Técnicas moleculares como RT-PCR, nested-RT-PCR, PCR em tempo real e sequenciamento de nucleotídeos encontram-se disponíveis para diagnostico (Noel et al., 1995; Sakamoto et al., 2000, Walter et al., 2003; Guix et al., 2005; Dai et al., 2010).
A detecção de HAstV pela RT-PCR foi inicialmente descrita por Noel e colaboradores (1995) e até hoje é a técnica mais utilizada em laboratórios de pesquisa tanto para detecção como para sequenciamento (Bosh et al., 2014). Os iniciadores que amplificam a região que codifica para a proteína principal do capsídeo viral localizado na extremidade 5`da ORF2 (Mon 244/Mon245 e Mon 260/Mon270), são amplamente utilizados nos laboratórios de pesquisa (Noel et
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al., 1995, Mendez & Arias, 2013, Bosch et al., 2014). Após a descoberta dos novos AstV, iniciadores consensuais direcionados para a região codificante do gene da polimerase localizado na extremidade 3`da ORF1b, estão sendo utilizados para detecção dos Clássicos e dos novos HAstV (Finkbeiner et al., 2009a, b; Holtz et al., 2011; Medici et al., 2014). Iniciadores específicos para detecção dos HAstV-MLB e HAstV-VA/HMO também têm sido descritos (Finkbiner et al., 2009a).
A técnica de RT-PCR quantitativa em tempo real (qPCR) tem sido descrita como uma técnica rápida capaz de estimar a carga viral em amostras clínicas e ambientais, demonstrando maior sensibilidade e menor risco de contaminação se comparada à RT-PCR qualitativa (Le Cann et al., 2004; Guix et al., 2005; Royuela et al., 2006; Dai et al., 2010; Jeong et al., 2012).
Outras técnicas menos convencionais, como a amplificação baseada na sequência do ácido nucléico (NASBA) e microcarreadores, também tem sido utilizadas para detecção dos oito sorotipos do HAstV (Tai et al., 2003; Brown et al., 2008). É importante destacar, que a escolha do método de diagnóstico pode ter um impacto significativo na descrição do HAstV e influenciar nas taxas de prevalência e incidência na população estudada, devido à especificidade e à sensibilidade da metodologia escolhida.
1.3.5 Epidemiologia dos astrovirus no mundo
Infecções por HAstVs têm sido relatadas em diferentes partes do mundo em crianças menores de cinco anos de idade, mas não exclusivamente, representando entre 2 e 9% dos casos de diarreia aguda não bacteriana (Bosch et al, 2014). Estudos de soroprevalência também têm demonstrado que até 90% das crianças nesta faixa etária já foram infectadas por este enteropatógeno (Mitchell, 2002).
Surtos e casos esporádicos de diarreia associados aos HAstV já foram relatados em escolas, creches, asilos, hospitais geriátricos e pediátricos (Silva et al., 2001; Walter & Mitchell, 2003; Jeong et al., 2012), assim como em acampamentos militares e em comunidades rurais (Maldonado et al., 1998).
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Além disso, surtos relacionados com alimentos e água contaminados por HAstV já foram descritos acometendo crianças e adultos (Glass et al., 2013; Sezen et al., 2015).
Altas taxas de prevalência dos HAstV são raras. Porém, em surtos de GA, como observado na reserva indígena Maxakali, em Minas Gerais e no Sudeste do México, foram observadas prevalências de 56% e 28%, respectivamente (Maldonado et al., 1998; Gabbay et al.,2006).
As infecções por HAstV apresentam um perfil espécie-especifica, não sendo descrita, até o momento, a transmissão interespécie. Nos últimos cinco anos, mais de 20 novos AstV tem sido descrito em uma ampla variedade de animais, apresentando perfil genético semelhantes aos HAstV, aumentando o potencial zoonotico desses vírus (Bosch et al., 2014).
Surtos e casos esporádicos de GA por HAstV podem ocorrer durante todo o ano. Embora não apresente padrão de sazonalidade definida, estudos apontam para uma maior prevalência dessas infecções nos meses mais frios nas regiões de clima temperado e nas estações mais húmidas em países de clima tropical (Cardoso et al., 2002; Matsui, 2002; Mendez & Arias. 2013).
Um estudo de revisão demostrou que dentre os oito sorotipos/genótipos dos clássicos HastV1-8, os HastV-1 é o tipo prevalente em países dos cinco continentes e Oceania, seguido dos HAstV-2. A circulação dos demais genótipos pode variar de acordo com a região e período estudado (Bosch et al., 2014). Os HAstV-3, HAstV-4, HAstV-5 são descritos com frequência maior que os HAstV-6, HAstV-7 e HAstV-8, considerados os genótipos mais raros (Mendez & Arias et al., 2013).
1.3.6 Epidemiologia dos Astrovírus no Brasil
No Brasil existem poucos estudos relacionados aos HAstV e seu papel na ocorrência de casos de gastroenterites, sendo a maioria deles realizados no âmbito hospitalar (Quadro 1). Os primeiros relatos da evidência dos HAstV associados a casos de GA foram em um estudo com fezes de crianças com
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diarreia, onde Nozawa e colaboradores (1985) detectaram, utilizando ME, HAstV em infecção mista com RVA.
No início da década de 1990, novos casos foram relatados na cidade do Rio de Janeiro (Leite et al., 1991) e São Paulo (Stewien et al., 1993) em crianças hospitalizadas com diarreia aguda, abaixo de dois anos de idade utilizando ensaios imunoenzimáticos.
Quadro 1 - Estudos acerca do papel dos HAstV em casos de gastrenterite em
diferentes regiões do Brasil.
Estado/ Região População Idade (anos) Prevalência (%) HAstV Método de detecção Referência
São Paulo/SE Hospital <2 4,8 EIE Stewien et al., 1991 Rio de Janeiro/SE Hospital <2 4,2 ME Leite et al., 1991 São Paulo/SE Hospital <0,6 3,0 ME Stewien et al., 1993 São Paulo/SE Surto familiar <5 5 crianças ME/IME Tanaka et al., 1994
Rio de Janeiro/SE Creche <3 33
RT-PCR/EIE/ME Silva et al., 2001
Goiás/CO Hospital <2 2,8 RT-PCR Cardoso et al., 2002 Maranhão/NE Hospital <2 11 RT-PCR Gabbay et al., 2005 Minas Gerais/SE Reserva indígena <6 56 EIE/RT-PCR Gabbay et al., 2006 São Paulo/SE Hospital 1-13 11 RT-PCR Rosit et al., 2007 Pará/NO,
Maranhão/NE
Hospital/Creche/ Comunidade
4,8 EIE/RT-PCR Gabbay et al., 2007
Rio de Janeiro/SE Hospital <6 13,5 RT-PCR Victoria et al., 2007 São Paulo/SE Hospital <6 28,2 RT-PCR Resque et al., 2007 DF e Goiás/CO Hospital <5 0,5 e 4,3 RT-PCR Santos et al., 2007 Rio de Janeiro/SE Hospital ≤10 5,3 RT-PCR Soares et al., 2008 Mato Grosso Sul/CO Hospital <3 3,1 RT-PCR Andreasi et al., 2008 Bahia/NE Comunidade <5 7,9 RT-PCR Xavier et al., 2009
SE HIV positivo <18 10 Gonçalves et al., 2009
Goiás, DF e Mato Grosso Sul/CO
Hospital <5 Tipagem RT-PCR Silva et al., 2009 Goiás/CO Hospital/HIV
positivo
<18 7,1 RT-PCR Ferreira et al., 2010 Rio de Janeiro/SE Hospital <2 12,7 RT-PCR Ferreira et al., 2012a Rio de Janeiro/SE Creche <5 6,3 RT-PCR Ferreira et al., 2012b
SE (Sudeste); CO (Centro-Oeste); NE (Nordeste); NO (Norte); DF (Distrito federal
EIE – Imuno microscopia eletronica; ME – Microscopia eletrônica; RT-PCR - Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase.
(Fonte: Elaboração da autora)
Com o advento da biologia molecular, foi possível não só a detecção como a caracterização molecular das amostras de HAstV. A maioria dos estudos dos HAstV foi realizado no âmbito hospitalar, tanto com crianças com quadro de GA sintomático como assintomáticos, com prevalência que variou de 2,8% no estado de Goiás a 28,8% no estado de São Paulo, ambos realizados
31
com crianças com quadro de GA, utilizando técnica de RT-PCR (Cardoso et al., 2002; Resque et al., 2007).
Posteriormente, os HAstV foram associados a casos de GA em crianças abaixo de seis anos de idade no estado do Maranhão, Pará, São Paulo, Mato Grosso do Sul, Bahia, Rio de Janeiro, além do Distrito Federal (Gabbay et al., 2005; Gabbay et al., 2007; Rosit et al., 2007; Andreasi et al., 2008; Silva et al., 2009; Victoria et al., 2007; Soares et al., 2008; Xavier et al., 2009; Ferreira et al., 2012a).
A associação dos HAstV com casos de diarreia aguda ocorrido em crianças de creche, já foi relatada em dois estudos realizados nas cidades do Rio de Janeiro e em um estudo na cidade de São Luiz do Maranhão, onde o HAstV-1 foi o genótipo prevalente (Silva et al. 2001; Ferreira et al., 2012b; Gabbay et al., 2007).
São raros os relatos de altas prevalências dos HAstV. Um estudo realizado em uma tribo indígena, conhecida como Maxakali no estado de Minas Gerais, 56% das amostras analisadas foram positivas para HAstV. Este surto acometeu cerca de cem crianças com idade inferior a seis anos de idade, apresentando quadro de diarreia aguda, febre e vômito. O HAstV-2 foi o único genótipo identificado (Gabbay et al., 2006).
Estudos com pacientes imunodeficientes, incluindo pacientes infectados com o HIV, descreveram os HAstV em infecções mistas com outros enteropatógenos, como bactérias, parasitos e diversos vírus associados ou não a doenças gastrentericas, como RVA, NoV, AdV, Epstein-Barr, citomegalovirus e bocavirus humano (Rosit et al., 2007; Gonçalves et al., 2009; Ferreira et al., 2010).
No Brasil, o HAstV-1 é o genótipo prevalente, seguido dos genótipos HAstV-2, HAstV-3 e HAstV-4. Os genótipos HAstV-5, HAstV-6, HAstV-7 e HAstV-8 são menos observados (Silva et al., 2001; Cardoso et al., 2002; Gabbay et al., 2005; Silva et al., 2006; Gabbay et al 2006; Gabbay et al., 2007a, Gabbay et al., 2007b; Gabbay et al., 2007c; Victoria et al., 2007; Resque et al., 2007; Soares et al., 2008; Xavier et al., 2009; Silva et al., 2009; Ferreira et al., 2012 a,b).
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Estudos brasileiros também têm demonstrados a presença dos clássicos HAstV em amostras ambientais como esgoto e água para consumo humano (Guimaraes et al., 2008; Miagostovich et al., 2008; Victoria et al., 2009; Fumian et al., 2013).
Apesar de novas cepas de HAstVs terem sido relatadas desde 2008 (Finkbeiner et al., 2008), ainda não existe relato de estudos desses vírus na América Latina.
1.3.6 Prevenção e controle
Não existe uma forma de prevenção específica e as medidas de prevenção dos HAstV são as mesmas adotadas nas GA infeciosas de etiologia viral. Como não existe uma vacina contra os HAstV, a interrupção da transmissão viral representa uma medida extremamente importante especialmente em hospitais, creches, asilos e ambientes familiares, onde a contaminação pessoa-a-pessoa acontece com frequência.
Procedimentos adequados como a lavagem das mãos antes e após o contato com o paciente, cuidados com a higiene pessoal e limpeza de todas as superfícies com desinfetantes adequados devem ser reforçados nestes locais, devido à resistência dos HAstVs aos vários agentes físicos e químicos, uma vez que os HAstVs mantem sua infectividade após o uso de desinfetantes de rotina e água clorada (Méndez & Arias, 2013).
Ações adotadas para a contenção da disseminação viral em ambientes hospitalares como o isolamento de crianças hospitalizadas com quadro diarreico grave, assim como dos pacientes imunocomprometidos é de fundamental importância e representa uma medida crucial para prevenir as infecções nosocomiais, principalmente se considerado o longo período de excreção viral após a resolução dos sintomas (Walter et al., 2003).
O monitoramento dos indivíduos responsáveis pela manipulação de alimentos, por cuidar das crianças com GA, o controle dos suprimentos de água usados tanto para o preparo de alimento como as águas utilizadas para recreação, isolamento de doentes em postos de saúde e hospitais, assim como a equipe medica, principalmente na fase aguda da doença, são medidas
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importantes que visam a prevenir e controlar surtos de gastroenterite viral causados pelos HAstVs. (Walter et al., 2003; Méndez & Arias, 2013).
A formulação de uma vacina para administração nos primeiros anos de vida seria interessante para indução de imunidade precoce, uma vez que esses vírus infectam principalmente crianças menores de um ano de idade. Essa pratica seria interessante em grupos específicos como as crianças pré-maturas, indivíduos imunocomprometidos como os portadores de HIV, transplantados e idosos acamados. Futuros estudos seriam de fundamental importância para o entendimento da imunidade nas infecções por estes vírus e para avaliar o custo benefício de uma vacina (Méndez & Arias, 2013).
Porém, certos fatores devem ser considerados antes de cogitar-se o desenvolvimento de uma vacina, tais como um melhor entendimento da imunidade nas infecções por esses vírus, bem como o papel protetor dos anticorpos homotípicos e heterotípicos e a realização de estudos clínico-epidemiológicos mais abrangentes, utilizando métodos de diagnóstico que detectem os vírus tanto em amostras humanas como nas ambientais (Méndez & Arias, 2013).
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2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
Diversos vírus são reconhecidos como importantes agentes etiológicos associados à GA em humanos. Apesar dos esforços no desenvolvimento de diferentes metodologias capazes de elucidar o papel dos patógenos virais dentro do cenário das gastrenterites, estudos demonstram que cerca de 40 a 60% dos casos dos episódios de GA permanecem sem etiologia conhecida (Lambert et al., 2012; Glass et al., 3013).
A relevância dos HAstV na saúde pública tem aumentado desde a descoberta, nos últimos anos, dos novos HAstV isolados em humanos que mostram similaridades genéticas com cepas de astrovírus isolados em animais (Chu et al., 2010; Bosch et al., 2014)
No Brasil, existem poucos estudos sobre os HAstV e a maioria anteriores a 2009. A partir de então, são raros os relatos, gerando uma lacuna no conhecimento da frequência e de como esses vírus se distribuem naturalmente nos ambientes. A indisponibilidade de dados referentes a detecção dos novos HAstV, apontam para a necessidade de padronização de protocolos de detecção e caracterização molecular que ajudem na vigilância epidemiológica desses vírus no país.
A inclusão da vacina monovalente contra os RV-A (Rotarix®) pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI) ressaltou a necessidade de se investigar outros patógenos entéricos virais associados à GA, principalmente infantil. O estudo dos clássicos e dos novos HAstV, contribuirá para um melhor entendimento do papel na doença clínica, no entendimento da circulação desses vírus na população e para o estabelecimento e estratégias de contenção, prevenção e controles dessas viroses.
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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Determinar a frequência e a circulação de diferentes genótipos de HAstV associados em casos de GA ocorridos em crianças menores de cinco anos em diferentes populações (comunidades, creche e hospitais) de três diferentes regiões do Brasil entre 1994 e 2011.
3.2 Objetivos específicos
1. Estimar a prevalência de HAstV em crianças menores de cinco anos residentes no Nordeste, Sul e Sudeste do Brasil, entre 2005 e 2011. 2. Investigar a ocorrência de novos HAstV em casos de GA ocorridos em
menores de dois anos de idade.
3. Determinar a frequência e a circulação de diferentes genótipos de HAstV em crianças com GA, atendidas na creche Bertha Lutz, Fiocruz-RJ, durante o período de janeiro de 1994 a dezembro de 2008.
4. Determinar a frequência dos HAstV, em crianças menores de dois anos de idade com GA, atendidas em hospital no município de Niterói-RJ no período de abril a setembro de 2003.
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4. METODOS E RESULTADOS
As metodologias e os resultados obtidos neste trabalho serão apresentados sob a forma de manuscritos publicados ou aceitos para publicação em revistas indexadas e apresentados de acordo com os objetivos específicos. Esse estudo teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da FIOCRUZ (CEP 311/06).
4.1 - Artigo 1 - Surveillance of human astrovirus infection in Brazil: The
first report of a new MLB1 astrovirus.
Os resultados apresentados neste manuscrito são referentes aos objetivos específicos 1 e 2:
Estimar a prevalência de HAstV em crianças menores de cinco anos residentes no Nordeste, Sul e Sudeste do Brasil, entre 2005 e 2011. Investigar a ocorrência de novos HAstV em casos de GA ocorridos em
menores de dois anos de idade.
Artigo publicado na revista PLoS One em 14 de agosto de 2015 (PONE-D-14-46739R1).
Fator de Impacto da Revista: 3.730
Referência: XAVIER MPTP, VOLOTAO EM, ROCHA MS, ANDRADE JSR, DINIZ FKB, ANDRADE TR, MIAGOSTOVICH MP, LEITE, JPG, CARVALHO-COSTA FA. (2015) Surveillance of human astrovirus infection in Brazil: The first report of a new MLB1 astrovirus. Plos One.
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RESUMO
O Astrovírus Humano (HAstV) representa o terceiro vírus mais comum associado a diarreia aguda (AD). Este estudo teve como objetivo estimar a prevalência da infecção por HAstV em crianças brasileiras menores de 5 anos com AD e pesquisar novas cepas de HAstV descritas na literatura, através de uma extensa vigilância laboratorial em três regiões da costa do Brasil entre 2005 e 2011. Usando a metodologia da reação reversa da cadeia de polimerase (RT- PCR), a taxa global de detecção HAstV atingiu 7,1% (207/2913) com o percentual que variou de acordo com a região geográfica estudada: 3,9% (36/921) no Nordeste, 7,9% no Sul (71/903) e 9,2% no Sudeste (100/1089) (p < 0,001). Casos de HAstV foram detectados em todas as faixas etárias, com taxas de positividade, sendo maior entre os pacientes com idade entre 49-60 meses (p = 0,054). As taxas de detecção foram ligeiramente maiores durante a primavera. A análise da sequência de nucleotídeos de um fragmento de 320 – pb da região do capsídeo viral, revelou que HAstV-1 foi o genótipo predominante ao longo dos sete anos de estudo. O novo HAstV-MLB1, foi detectado pela primeira vez no Brasil em duas crianças com AD de uma amostragem de 200 amostras testadas, revelando a circulação desse novo vírus no nordeste e sudeste do Brasil. Estes resultados fornecem dados epidemiológicos e moleculares adicionais sobre HAstV circulação em três regiões costeiras do Brasil e destaca o potencial deste vírus como causa de AD infantil.
38
Surveillance of human astrovirus infection
in Brazil: The first report of MLB1 astrovirus.
Maria da Penha Trindade Pinheiro Xavier1*, Eduardo de Mello Volotão1, Mônica Simões Rocha1, Juliana da Silva Ribeiro de Andrade1, Fernanda Kreischer
Bandeira Diniz1, Thais Ramos de Andrade1, Marize Pereira Miagostovich1, José Paulo Gagliardi Leite1, Filipe Aníbal Carvalho Costa1.
1
Laboratory of Comparative and Environmental Virology - Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Ministry of Health, Rio de Janeiro, RJ,
Brazil.
*
Corresponding author at: E-mail address: tpx@ioc.fiocruz.br (XMPTP)
Abstract
Human astrovirus (HAstV) represents the third most common virus associated with acute diarrhea (AD). This study aimed to estimate the prevalence of HAstV infection in Brazilian children under 5 years of age with AD, investigate the presence of recently described HAstV strains, through extensive laboratory-based surveillance of enteric viral agents in three Brazilian coastal regions between 2005 and 2011. Using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), the overall HAstV detection rate reached 7.1% (207/2.913) with percentage varying according to the geographic region: 3.9% (36/921) in the northeast, 7.9% in the south (71/903) and 9.2% in the southeast (100/1.089) (p < 0.001). HAstV were detected in cases of all age groups. Detection rates were slightly higher during the spring. Nucleotide sequence analysis of a 320-bp ORF2 fragment revealed that HAstV-1 was the predominant genotype throughout the seven years of the study. The novel AstV-MLB1 was detected in two children with AD from a subset of 200 samples tested, demonstrating the circulation of this virus both the in northeastern and southeastern regions of Brazil. These results provide additional epidemiological and molecular data on HAstV circulation in three Brazilian coastal regions, highlighting its potential to cause infantile AD.
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Introduction
Acute diarrhea (AD) remains a major cause of hospitalization and death in children worldwide, associated with almost 9.9% of the 6.9 million deaths among children under 5 years old in 2011 [1] . Among the AD etiologic agents , viruses play an important role and after rotavirus group A (RVA) and norovirus (NoV), human astrovirus (HAstV) represents the third most common virus found in children with AD, and is thought to be involved in 0.5 to 15% of AD outbreaks [2, 3]. HAstV infections are more frequent in children, the elderly and among immunocompromised patients causing blunting of the tips of the microvilli as well as disruption of the intestinal epithelium [2, 4, 5].
Human astrovirus belongs to the Astroviridae family and contains single-stranded, positive-sense, polyadenylated RNA 6.2–7.8 kilobases (kb) in length without an envelope, encased within an icosahedral capsid. The genome contains three open reading frames (ORFs) designated ORF1a, ORF1b and ORF2. The two first ORFs encode non-structural proteins, including viral proteinase and RNA polymerase and ORF2 encodes the capsid protein precursor [2, 3].
The Astroviridae family contains two distinguished genera: Mamastrovirus and Avastrovirus. These viruses were originally classified into genera and species based only on the host of origin. Recently, the Astroviruses Study Group, 9th Report ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses), 2011 [6], proposed a classification based on the amino acid sequence, which encodes the capsid polyprotein and represents the most variable region of the
40
genome [2, 3]. In this classification, Mamastrovirus genera associated to human disease is subdivided into four divergent species: MAstV 1 (the classical human astrovirus 1-8), MAstV 6 (AstV MLB1-3), MAstV 8 (AstV VA1 and VA3, also known as HMO-C and HMO-B, respectively) and MAstV 9 (AstV VA2, also Known as HMO-A, and VA4) [2].
In general, HAstV-1 is the most common type found in children, but the predominant genotype can vary with time and location [3, 7, 8]. The recent identification of novel AstV in humans using highly sensitive methods [9-13], highlights the need to analyze the prevalence of these viruses to recognize their actual impact in public health, since they were found to be genetically related to animal viruses and some were isolated from patients with more severe diseases, such as encephalitis [14-16].
This study aimed to associate the HAstV infection to Brazilian children under 5 years old affected with AD in three Brazilian coastal regions in a seven years period (2005-2011), providing epidemiological and molecular characteristics of HAstV genotypes. Recently described strains of HAstV were also studied.
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Materials and Methods
Ethical statement
This study, including consent procedure, was approved by the Ethics Committee of Oswaldo Cruz Foundation (CEP 311/06) and is part of an ongoing official Brazilian Ministry of Health surveillance of enteric pathogens to investigate the viral etiology of Acute Diarrhea (AD). In this context, stool samples from AD cases were obtained by request of in and out patients attending health centers, including hospitals and public central laboratories, following outbreaks or sporadic cases of AD. For this study, consent was obtained verbally from the next of kin, guardians or parents on behalf of the children who were enrolled in this study. Data are maintained anonymously.
Clinical samples and studied areas
For this study, one stool sample of 2.913 patients under five years old with negative diagnosis for RVA and NoV that occurred in the period 2005-2011, in three different Brazilian coastal regions (northeast, southeast and south), with distinct demographic and environmental scenarios were selected for HAstV investigation. The population of the south and southeast regions has a higher income compared to that of the northeast, where some people do not have access to sanitation, and where AD-related mortality is higher [15]. Acute diarrhea was defined as when children presented three or more liquid or semi-liquid evacuations in a 24-h period.
Screening of novel HAstVs from stool samples
To search for novel and recently described HAstVs, 200 stool samples obtained from January to December to 2011 from patients under two years old were randomly selected from three different Brazilian coastal regions (northeast, southeast and south). All samples were previously tested and were negative for RVA, NoV and HAstV1–8.
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Statistical analysis
Rates of HAstV positivity and association between the frequency of symptoms and the different age groups were compared using the chi-squared test. Statistical significance was established at p < 0.05.
Nucleic acid extraction and detection
Fecal suspension was prepared in a 10% (w/v) Tris/HCL/Ca2+ (0,01M, pH 7.2). RNA Extraction was performed using QIAamp Viral RNA extraction kit (Qiagen) methodology according to the manufacturer’s instructions. Detection of classic HAstV and complementary DNA (cDNA) was synthesized using the Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Foster City, Ca, USA) with a previous denaturation step with dimethylsulfoxide for 7 min at 97oC. For classic HAstV detection, a PCR protocol was performed using a set of specific primers that targeted the ORF2 region capsid (Mon 269/270 [0.4 µM of each primer]) in a final reaction mixture of 50 µl in volume, according to the PCR conditions described previously [18].
For novel AstV detection, screening was carried out by amplifying a 409 bp segment of the ORF1b (RNA polymerase) region of the AstV genome with consensus primers SF0073/SF0076 designed with a bias for detection of a highly divergent AstV (Classic HAstV 1-8, MLB1-3 and VA1-3) [13]. Positive samples were sequenced and submitted to BLAST (software) [19] searching and those that indicated MLB1 homology were then subjected to amplification and sequencing of the 402 bp segment of the MLB1 ORF2 specific genome region using primers SF0053 and SF0061 for characterization [13]. All amplifications were performed using SuperScript III One-Step RT-PCR System (Invitrogen), according to the manufacturer´s instructions.
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For all PCR reactions, final primers concentrations were of 0.2 µM for both forward and reverse primers, in a final reaction volume of 25 uL. The products were analyzed in a 2% agarose gels and visualized by ethidium bromide staining.
Molecular sequencing
For the molecular characterization of HAstV strains, PCR products were sequenced in both directions using the ABI Prism 3100 Genetic Analyzer and Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) with the same primers used for the amplification reactions [13,18]. Centri-Sep columns (Princeton Separations, Foster City, CA) were used to purify the sequencing reaction products, according to the manufacturer’s instructions.
Phylogenetic analysis
The chromatograms obtained from sequencing reactions were carried out using BioEdit software version 7.1.3.0 [20] for sequence editing. Sequence similarity searches were performed with sequences deposited in GenBank using the basic local alignment search tool (BLAST) software [19]. For phylogenetic analysis, reference sequences available for the same genomic region (ORF2) and size were selected taking into account the standards of each genetic type of human and/or environmental AstV and other similar sequences representing different geographical regions and time periods were also used. Sequences analyzes were performed using MEGA software version 5.1 [21] and multiple sequence alignments were carried out using the ClustalW program. Phylogenetic trees based on nucleotide (nt) sequences were obtained
