A elevada produtividade da cana-de-açúcar e sua grande capacidade em acumular sacarose à torna a segunda principal gramínea utilizada na produção de etanol de primeira geração. Da mesma maneira, por ter elevada produção de biomassa lignocelulósica é também uma das mais promissoras fontes para produção de etanol de segunda geração através do uso do bagaço remanescente como matéria-prima (Torres et al., 2014). Seu uso, porém, é visto como um grande desafio para as biorrefinarias que se deparam com um material bastante promissor, mas com elevada recalcitrância para sua utilização (Ragauskas et al., 2006).
A lignina é o principal fator recalcitrante da biomassa, sendo considerada a maior barreira para a produção do etanol de segunda geração e o componente determinante da digestibilidade da parede celular, uma vez que dificulta a hidrólise da celulose em açúcares passíveis de fermentação, além de causar inibição enzimática (Guragain et al., 2014; Simmons et al., 2010).
Diferentes estratégias para melhorar a eficiência da conversão da biomassa lignocelulósica têm sido desenvolvidas, desde formas de aumentar a eficiência e custo de pré- tratamentos químicos, até alteração genética da cana-de-açúcar (Karp et al., 2013; Waclawovsky et al., 2010).
Com o objetivo gerar conhecimento a respeito da biossíntese de lignina em cana- de-açúcar, foram utilizados quatro genótipos de cana-de-açúcar previamente classificados como contrastantes para o teor de lignina, sendo eles IACSP04-028 e IACSP04-053, com menor teor (± 4%), e IACSP04-691 e IACSP04-015, com maior teor (± 8%). Esses genótipos foram cultivados por trinta meses em condições reais de campo, antes de serem coletados para as análises deste trabalho. Para consecução do objetivo foram realizadas a quantificação do teor de lignina e a determinação das estruturas presentes em sua molécula, bem como uma análise da expressão dos genes envolvidos com a sua biossíntese em dois tecidos diferentes e dois estágios de desenvolvimento diferentes.
O processo de lignificação da cana-de-açúcar tem início no período inicial do desenvolvimento do caule, e se restringe a feixes vasculares, sendo os demais tecidos lignificados posteriormente (Jacobsen et al., 1992), de maneira que os estágios de desenvolvimento jovem e maduro se distinguem para o teor de lignina (Bottcher et al., 2013). Nossos resultados apresentaram teores de lignina solúvel (Figura 6) e insolúvel (Figura 7) que diferenciaram os tecidos da cana-de-açúcar, com maior teor de lignina solúvel na medula do colmo e maior teor de lignina insolúvel no córtex do colmo, sendo que, para ambas as frações
de lignina (solúvel e insolúvel), a maturidade evidenciou a diferença entre os dois tecidos. Fato que condiz com a literatura, que mostra a distinção entre os tecidos da região periférica e central de monocotiledôneas, a qual se acentua com a maturidade (Bottcher et al., 2013; Siqueira et al., 2011).
De acordo com Hatfield and Fukushima (2005) a determinação de lignina solúvel por Klason é um método pouco preciso devido a necessidade de se estimar o coeficiente de extinção (110 L g-1 cm-1, Dence (1992)) adequado, uma vez que o mesmo varia conforme a composição da lignina, devendo ser estimado para cada espécie. Assim, apesar do método Klason ter gerado valores que poderiam ser considerados uma estimativa do teor de lignina solúvel, eles estão de acordo com a literatura para outras gramíneas, sendo bastante inferiores em relação ao teor de lignina insolúvel (Li et al., 2012; Nlewem and Thrash Jr, 2010). Além disso, o teor de lignina solúvel, formada por monômeros e oligômeros precursores do polímero insolúvel de lignina, foi maior nos tecidos jovens. Esse resultado pode ser justificado por serem tecidos em formação, os quais se encontram em alta atividade metabólica, e que mesmo em processo de síntese, os monolignóis devem estar sendo direcionados e armazenados em compartimentos celulares, como o vacúolo (Wang et al., 2013), para posterior lignificação no estágio maduro do desenvolvimento do caule. Essa hipótese é baseada na identificação de formas glicosiladas de monômeros e oligômeros encontradas no vacúolo celular de Arabidopsis thaliana, evidenciando que reações de oxidação combinatória entre os radicais dos monolignóis e oligolignóis também ocorrem no citoplasma, local onde os produtos da reação são glicosilados e posteriormente armazenados no vacúolo (Dima et al., 2015).
Pela quantificação de lignina insolúvel (Figura 7) foi possível observar que os teores foram maiores nos córtex dos tecidos maduros do que nos jovens, tendo a medula uma tendência de estabilidade entre os dois estádios de desenvolvimento. Bottcher et al. (2013) também mostraram que os tecidos jovens apresentam menor teor de lignina insolúvel, o que se deve ao fato de que o processo de lignificação nos estágios iniciais do desenvolvimento do caule está associado à tipos celulares específicos, como os vasos do xilema. O adensamento de vasos condutores na região do córtex e a lignificação de tecidos como epiderme e hipoderme também justificam o maior teor de lignina insolúvel na região do córtex colmo (Bottcher et al., 2013). A região central do colmo da cana-de-açúcar por ter a ocorrência de feixes vasculares mais dispersos e circundados por inúmeras células parenquimáticas, caracterizadas por serem menos lignificadas geram um efeito de diluição do teor de lignina neste tecido (Bottcher et al., 2013).
O fato do teor de lignina insolúvel ter aumentado com a maturação do tecido na região do córtex reforça que, além da resistência mecânica, a lignificação serve como uma barreira física natural da planta (Delessert et al., 2004; Neutelings, 2011; Weng and Chapple, 2010), protegendo, por exemplo, ao ataque de patógenos (Li et al., 2012).
As análises não confirmaram o genótipo IACSP04-691 com maior teor de lignina insolúvel (Figura 7), o que seria esperado em função das análises tecnológicas realizadas anteriormente e que permitiram sua seleção como material de alto teor. Enquanto que o genótipo IACSP04-015 apresentou maior teor ou tendência de maior teor tanto no córtex como na medula nas duas localidades, o mesmo não ocorreu com IACSP04-691, que mostrou os níveis mais semelhantes aos dos dois genótipos selecionados como baixo teor. A variação na quantificação do teor de lignina entre a análise classificatória inicial e a realizada neste trabalho se justifica por seguirem metodologias diferentes, uma vez que a primeira seguiu o método de Fibra Detergente Ácida (FDA) e a segunda o método Klason. Os autores Hatfield e Fukushima (2005) afirmam que dependendo do método usado para a determinação de lignina podem ocorrer variações significativas em sua quantificação. A variação do teor de lignina entre as localidades, no entanto, pôde ser explicada por outros fatores, como discutido abaixo. Pela análise dos dados também se notou que em ambas as análises de quantificação de lignina (solúvel e insolúvel) houve distinção entre os tecidos do córtex e da medula, sendo o local de cultivo dos genótipos indiferente para a distinção de ambos os tecidos.
A quantificação de lignina insolúvel (Figura 7) indicou que no material cultivado em PIN, houve diferença entre medula e córtex em ambos os estádios de desenvolvimento do colmo, exceto para o genótipo IACSP04-691. O mesmo não aconteceu em RP, onde os genótipos indicam investimento na produção de lignina também na medula em seu estádio jovem do desenvolvimento, exceto pelo genótipo IACSP04-015. Uma vez que o conteúdo de lignina mostrou ser influenciado inclusive pelas comunidades microbianas do solo (Bennett et al., 2015) não é simples explicar este efeito de localidade dado o conjunto de fatores que influenciam o desenvolvimento vegetal. Gan et al. (2012) observaram com Andropogon gerardii, uma gramínea com alto potencial energético da América do Norte, que o teor de lignina não foi influenciado pelo local de cultivo nos ecótipos analisados. Os genótipos de cana-de-açúcar analisados neste trabalho, no entanto, pareceram sofrer influência do ambiente para esta característica, principalmente no estádio maduro, sobretudo para a quantificação de lignina solúvel. A diferença na quantificação de lignina entre RP e PIN talvez possa ser explicada por fatores edafoclimáticos aos quais as plantas estavam submetidas. Assim, apesar
de terem sido cultivados sob condições climáticas bastante semelhantes, os genótipos analisados foram plantados em solos distintos. Maule et al. (2001), em ensaio de campo, relataram haver alteração da produtividade de cultivares de cana-de-açúcar em função dos tipos de solos onde os mesmos foram cultivados. Em uma revisão sobre os efeitos de estresses no teor de lignina, Moura et al. (2010) comentaram que variações na disponibilidade de nitrogênio, cálcio, boro, zinco e cobre no solo afetam a deposição desse polímero na parede celular. O fator solo, portanto, poderia explicar em parte a diferença no conteúdo de lignina nas localidades onde os genótipos de cana foram cultivados.
A análise do perfil dos oligômeros por LC-MS identificou doze compostos fenólicos (Tabela 2), dentre aldeídos, dímeros e trímeros, e o padrão de distribuição dessas estruturas (Figura 8) não permitiu a distinção clara dos tecidos do colmo dos genótipos de cana-de-açúcar.
O método utilizado promove a extração da lignina solúvel da planta sem que haja sua degradação, portanto, as estruturas identificadas são as precursoras do polímero de lignina, podendo de certo modo representar a lignina da parede celular (Kiyota et al., 2012). É sabido que o processo de polimerização dos álcoois p-hidroxicinamílicos é inicializado após a sua oxidação por peroxidase e lacase, seguido do acoplamento de radicais, que se processa sem controle enzimático, dando origem principalmente a oligômeros formados por ligações do tipo 8-5, 8-O-4 e 8-8 (Syrjãnen and Brunow, 1998). Tais quais em recentes relatos com cana-de-açúcar (Bottcher et al., 2013; Kiyota et al., 2012), as principais ligações encontradas aqui ocorreram entre as unidades S e G, sendo a unidade do tipo H ausente em meio solúvel, o que também foi observado por Bottcher et al. (2013). Embora haja na literatura dados sobre a presença de unidades H em gramíneas (Carpita, 1996; Vanholme et al., 2010a), sua ausência em meio solúvel pode ser justificada por ser o monolignol p-coumail o de maior potencial oxidativo (Syrjãnen and Brunow, 1998) e, portanto, deve ser rapidamente incorporado ao polímero de lignina na parede celular.
A ligação do tipo 8-O-4 (éter β-aril) é o tipo mais frequente de ligação entre as unidades, sendo também a de mais fácil clivagem (Boerjan et al., 2003; Kishimoto et al., 2009). Entre as estruturas identificadas por este trabalho e por Bottcher et al. (2013) também foi o tipo de ligação mais observada entre os monolignóis. As estruturas detectadas foram comuns à maioria dos tecidos, como o trímero G(8-O-4)S(8-5)G (m/z = 583) presente em todos eles. Houve, sobretudo, aquela que demostrou especificidade para determinado tecido, como o trímero S(8-O-4)G(8-O-4)G (m/z = 601b), que além de ter sido a estrutura menos frequente, esteve presente apenas na região do córtex do colmo.
O trímero G(8-O-4)S(8-5)G (m/z = 583) detectado aqui em todos os tecidos, curiosamente não foi encontrado em ensaios com baixa incidência luminosa e disponibilidade de nitrogênio (Bottcher, 2013), levando a crer que sua presença pode estar relacionada à disponibilidade desses dois fatores, os quais são de grande importância para o desenvolvimento vegetal (Murozuka et al., 2014; Rossel et al., 2002). O dímero S(8-5)G (m/z = 387) foi o mais frequente entre os tecidos, principalmente nos tecidos maduros de todos os genótipos. O dímero G(8-5)G (m/z = 357) esteve presente apenas no córtex de apenas dois genótipos, IACSP04-053 e IACSP04-015, sendo que no primeiro genótipo foi identificado apenas no material de PIN. Foi notável que outras estruturas também estiveram presentes em apenas um local de cultivo, de modo que os resultados de frequência apontaram PIN como a localidade de maior diversidade em estruturas entre os genótipos. Assim, considerando que as proporções relativas dos monolignóis podem ser influenciadas por diferentes fatores bióticos e abióticos e, por conseguinte alterar a composição do polímero de lignina (Bennett et al., 2015; Moura et al., 2010), os diferentes perfis observados entre as localidades podem ser consequência de fatores relacionados a cada localidade.
As estruturas detectadas neste trabalho não coincidiram com o perfil dos oligômeros para os genótipos de cana-de-açúcar analisados por Kiyota et al. (2012) e Bottcher et al. (2013), fato este que reafirma a variação na composição do polímero de lignina nos diferentes genótipos de cana-de-açúcar (Bottcher et al., 2013). Entretanto, das treze estruturas observadas por Kiyota et al. (2012), e dos oito estruturas identificadas por Bottcher (2013), apenas três estiveram sempre presentes: coniferil aldeído (m/z = 177), G(8-5)G (m/z = 357) e S(8-O-4)S(8-5)G (m/z = 613) (Tabela 4), sugerindo serem conservadas para a espécie, independentemente do genótipo e localidade de cultivo.
Em acordo com os resultados de quantificação de lignina insolúvel (Figura 7), os tecidos em estágio de desenvolvimento maduro, os quais apresentaram maior teor de lignina, também apresentaram maior frequência de trímeros, fatos que se justificam pela maior atividade de lignificação desses tecidos (Bottcher et al., 2013). Da mesma forma, o genótipo IACSP04-028 com menor teor apresentou também menor frequência dessas estruturas, enquanto IACSP04-015 com maior teor de lignina insolúvel apresentou maior frequência de trímeros. Morreel et al. (2004) afirma que a presença de vários oligômeros de lignina em tecidos que sofrem extenso processo de lignificação são provenientes da disponibilidade de monolignóis que se acoplam em condição oxidativa para lignificação da parede celular, justificando assim a correlação entre teor de lignina e a frequência de oligômeros.
Tabela 4. Relação das estruturas obtidos entre este trabalho, Kiyota et al. (2012) e Bottcher (2013). Especificando a massa (m/z), tempo de retenção e a estrutura dos oligômeros identificados nos genótipos de cana-de-açúcar dos mesmos, obtidos por UPLC-MS/MS.
A determinação da razão S/G (Figura 9) por LC-MS mostrou diferenças na composição do polímero de lignina entre os quatro tecidos dos genótipos, sendo notável o aumento da razão S/G nos tecidos maduros.
A razão S/G é um parâmetro tipicamente utilizado para a caracterização da composição da lignina e para prever o seu grau de condensação através das possíveis ligações poliméricas entre as unidades de monolignóis que a compõe (Liu et al., 2014). Assim, a razão S/G é uma das principais características bromatológicas que influenciam o processo de sacarificação. A escolha do processamento dado ao material (com ou sem pré-tratamento ácido), sobretudo, é uma etapa decisiva e depende da composição S/G influenciando de maneira positiva ou negativa o rendimento da sacarificação (Van Acker et al., 2013).
É sabido que não somente o teor de lignina aumenta com a maturidade, mas também mudanças na composição do polímero são observadas pelo aumento progressivo da razão S/G (Buxton and Russell, 1988). Desse modo, o aumento da razão S/G com a maturidade em ambos os tecidos, reafirmou ser a composição da lignina temporalmente regulada (Boerjan et al., 2003; Bottcher et al., 2013). No entanto, diferentemente dos resultados apresentados por Bottcher et al. (2013), onde a maturidade diminuiu a razão S/G na
m/z Retention Time (min) Structure Retention Time (min) Structure Retention Time (min) Structure
177 3.3 coniferyl aldehyde 3.3 coniferyl aldehyde 3.3 coniferyl aldehyde
179 2.72 coniferyl alcohol 2.72 coniferyl alcohol
207 3.25 sinapyl aldehyde 3.26 sinapyl aldehyde
209 2.75 sinapyl alcohol
327 3.21 G(8−5)H 3.21 G(8−5)H
357 3.45 G(8-5)G 3.39,4.08 G(8−5)G and G(8−8)G 3.39 G(8−5)G
375 3.76 G(8−O−4)G
387 3.2 S(8-5)G 3.42, 3.9 S(8−5)G and S(8−8)G
405 3.2, 3.4 G(8-O-4)S and S(8-O-4)G 3.2 S(8−O−4)G
417 3.79 S(8−8)S 3.79 S(8−8)S
493 3.74 H(8−5)H(8−O−4)G
583 3.6 G(8-O-4)S(8-5)G 3.57, 3.66 G(8−O−4)G(8−5)G 3.57 G(8−O−4)S(8−5)G
601 3.0, 3.4 G(8-O-4)S(8-O-4)G and
S(8-O-4)G(8-O-4)G
613 3.6 S(8-O-4)S(8-5)G 3.52, 4.34 S(8−O−4)S(8−5)G 3.52, 4.34 S(8−O−4)S(8−5)G
631 3.5 S(8-O-4)G(8-O-4)S
643 3.75 S(8-O-4)S(8-8)S 3.82 S(8−O−4)S(8−8)S
Kiyota et al. (2012) Bottcher (2013)
região cortical do colmo, aqui, os dados indicaram que apesar da razão ter sido menor do que na região medular do colmo, no córtex maduro, dos quatro genótipos, foi maior do que quando jovem. Fato que talvez se justifique pelos diferentes genótipos analisados bem como pelas condições de campo. No entanto, o fato de o córtex ser uma região onde está localizada a epiderme, que por sua vez é caracterizada como sendo um tecido de maior recalcitrância ao pré-tratamento ácido e à digestão enzimática (Brienzo et al., 2014), o elevado teor de lignina e a menor razão S/G dessa região no estádio maduro do desenvolvimento do tecido justificaram esta característica.
A mudança na composição da lignina se dá pelo processo de incorporação dos monolignóis à parede celular, onde cada um prevalece em determinado estádio de desenvolvimento de formação da parede celular, obedecendo a ordem na qual, primeiramente, se incorpora o monolignol álcool p-coumalírico, seguido pelo álcool guaiacílico e por fim álcool sinapílico (Dixon et al., 2001; Terashima et al., 1993) Desse modo, o aumento da razão S/G com a maturidade, caracterizada pela formação das etapas finais da parede celular, se dá pela maior incorporação de precursores da unidade S ao polímero de lignina (Carpita, 1996).
É notável que os genótipos IACSP04-691 e IACSP04-015 apresentaram maior razão S/G, enquanto IACSP04-028 e IACSP04-053 apresentaram menor razão, o que se pressupõe que assim como sugerido por Bottcher et al. (2013), deve existir variabilidade genética para essa característica. Outro fato interessante é que o córtex de IACSP04-028 e IACSP04-053, genótipos previamente classificados com menor teor de lignina, teve razão S/G menor que a medula nos tecidos maduros em PIN. Já nos genótipos IACSP04-691 e IACSP04-015 a razão S/G foi praticamente a mesma no córtex e na medula. E mais, a razão S/G de IACSP04-691 e IACSP04-015 foi maior em PIN do que RP, reafirmando o efeito do local de cultivo na biossíntese de lignina.
Sabendo que plantas com lignina rica em unidades do tipo S é considerada mais vantajosa para a indústria de biocombustível, devido à ausência de sítios de ligação disponíveis em sua molécula pela presença de dois grupos metoxi, o que consequentemente reduz o número de combinações possíveis durante a polimerização (Dixon et al., 2001), pode- se dizer que os genótipos IACSP04-691 e IACSP04-015, apesar deste último apresentar maior teor de lignina, são mais propícios à obtenção de etanol de segunda geração pelo parâmetro da razão S/G.
Um dos mecanismos que podem explicar a variação na composição da lignina em diferentes tecidos seria a expressão diferenciada dos genes reguladores da biossíntese dos monolignóis, dentre eles os fatores de transcrição e as famílias multigênicas codificadoras
para as enzimas de cada passo metabólico da via biossintética dos monolignóis (Boerjan et al., 2003; Campbell and Sederoff, 1996).
As várias enzimas catalíticas das etapas da via dos monolignóis são multifuncionais, o que faz com que mais de uma reação da via possa ser catalisada por uma mesma enzima. Da mesma forma que é possível que outras enzimas estejam envolvidas na biossíntese de monolignóis, e que novas vias podem existir para S e G (Dixon, 2001), tal como aquela envolvendo cafeoil chiquimato esterase (CSE), recentemente relatada como mediadora da conversão de cafeoil chiquimato a cafeato (Vanholme et al., 2013). Além disso, essas enzimas são codificadas por genes que, em sua maioria, pertencem a famílias multigênicas em mono e dicotiledôneas (Bonawitz e Chapple, 2010). Logo, para uma determinada enzima pode haver diferentes isoformas, que por sua vez podem apresentar propriedades cinéticas, locais de expressão e fase de desenvolvimento específico, resultando em diferente quantidade e composição da lignina pelos órgãos e tecidos da planta (Bottcher et al., 2013).
A expressão relativa dos genes aqui analisados mostrou ser bastante complexa e variável entre os tecidos e localidades, apresentado diferentes perfis de expressão para alguns genes da via de fenilpropanóides quando comparadas as regiões do córtex e da medula do colmo. Da mesma forma, houve genes que apresentaram variação no nível de transcritos quando comparadas as localidades e genótipos, bem como genes que se mostraram mais estáveis em relação a esses fatores. Ao analisar a expressão dos genes da via dos monolignóis em genótipos de cana-de-açúcar também contrastantes para o teor de lignina, Bottcher et al. (2013) também encontraram diferenças de expressão entre os tecidos do córtex e medula. O padrão de expressão em tecido jovem e maduro para certos genes da mesma família, no entanto, mostrou similaridade de expressão, o que segundo os mesmos autores indica redundância funcional, justificada por serem genes pertencentes ao mesmo grupo filogenético, tendendo a apresentar perfil de expressão de desenvolvimento semelhante.
O estudo da expressão relativa dos genes da via dos monolignóis, associado à caracterização do teor de lignina e sua composição é uma forma de gerar informações embasadas para se determinar aqueles genes que estão mais envolvidos com a biossíntese de lignina. Estudos desse caráter foram realizados por Riboulet et al. (2009) e Bottcher et al. (2013), os quais identificaram genes que pudessem ser mais propensos de estarem envolvidos nos processos de lignificação. Em contraste, a expressão dos genes da via de biossíntese dos monolignóis nem sempre está correlacionada com a lignina em si, o que pode ser explicado pelo fato de que uma gama de outros produtos, como ácidos hidroxicinâmicos, ésteres
fenólicos e lignanas também são produzidos pela via de fenilpropanóides (Wang et al., 2013). Além do mais, outros fatores estão envolvidos no processo de lignificação, como o transporte dos monolignóis para a parede celular e as condições químicas da parede para a incorporação