UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
LETÍCIA MARRONE DE SOUZA
METABOLISMO DE LIGNINA EM QUATRO GENÓTIPOS DE CANA-DE-AÇÚCAR CULTIVADOS EM CAMPO
CAMPINAS 2015
LETÍCIA MARRONE DE SOUZA
METABOLISMO DE LIGNINA EM QUATRO GENÓTIPOS DE CANA-DE-AÇÚCAR CULTIVADOS EM CAMPO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Vegetal.
ORIENTADOR: PAULO MAZZAFERA
CAMPINAS 2015
Agência: FAPESP
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Marcy e José Milton, por todo amor e paciência, ao meu irmão Leonardo, a alegria da casa, à minha avó Salete, meu exemplo de vida e ao meu companheiro e amigo de longa data Ulysses.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus, pela fé, saúde e coragem concedidas para que eu alcançasse esse ideal.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal. À FAPESP, pelo suporte financeiro.
Ao Departamento de Biologia Vegetal, pela infra-estrutura, e a todos do departamento: técnicos, alunos e professores.
Ao Prof. Dr. Paulo Mazzafera, pela orientação e oportunidade de crescimento e aprendizado durante a realização deste trabalho.
Aos membros da banca e pré-banca, pelas valiosas sugestões ao meu trabalho.
Aos amigos do LaFiMP-Unicamp (Flávia, Vanessa, Dani, Naty, Rafa, Mari, Adilson, Eduardo, Luciano, Pedro, Felipe, Dimi e Tati) pela acolhida, carinho, risadas e inúmeras ajudas.
Aos amigos e ex-estagiários Laerti, pela paciência e primeiros passos no laboratório, e Luana por trabalhar duro comigo durante as análises.
Ao Eduardo Kiyota pela ajuda nas análises de cromatografia.
Ao João Benhur Mokochinski por disponibilizar o método e tempo para me ajudar com as análises de composição de lignina.
À Begoña e Luciano pela ajuda com os programas de estatística.
À Ilse e à Flávia pelos altos papos, incentivo, ajuda e amizade, dentro e fora do laboratório.
À minhas amigas guerreiras Mônica e Tatiane por sempre torcerem por mim.
Ao meu namorado Ulysses, pelo carinho, amizade, companheirismo, apoio e incentivo nos momentos mais difíceis.
Aos meus pais, Marcy e José Milton, batalhadores e exemplos de honestidade e bom caráter, a quem devo minha formação pessoal e profissional, e de quem tenho muito orgulho. Obrigada por acreditarem em mim.
A toda minha família, primos, tias, tios e avós pelo carinho e torcida, e à todos que contribuíram de alguma forma para a realização desse trabalho.
RESUMO
A cana-de-açúcar é a principal fonte de sacarose para a produção do bioetanol de primeira geração e mais recentemente uma importante fonte de biomassa lignocelulósica para a geração do etanol de segunda geração, obtido a partir da celulose depositada na parede celular vegetal. A lignina, um complexo heteropolímero aromático presente na parede secundária das células vegetais, é o principal fator que confere recalcitrância ao material lignocelulósico e o maior obstáculo encontrado pelas biorrefinarias para a produção viável do etanol de segunda geração. Este biopolímero é formado pela polimerização oxidativa combinatória de principalmente três monômeros de álcool hidroxicinamílicos: álcool p-coumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico. Ao serem incorporados ao polímero de lignina passam a ser chamados, p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S), respectivamente, os quais são ligados por diferentes tipos de ligações covalentes. Sabendo que características como o conteúdo de lignina, sua composição e os tipos de ligações existentes entre suas unidades S, G e H são fatores que afetam a recalcitrância da parede celular, este trabalho teve como objetivo obter conhecimento a respeito da composição e biossíntese de lignina em quatro genótipos de cana-de-açúcar cultivados em condições de campo em duas localidades do Estado de São Paulo. Os genótipos foram previamente caracterizados quanto ao teor de lignina e foram contrastantes para essa característica, sendo IACSP04-028 e IACSP04-053, com menor teor (± 4%), e IACSP04-691 e IACSP04-015, com maior teor (± 8%). As regiões do córtex e medula do colmo da cana-de-açúcar, em dois estádios do desenvolvimento vegetativo puderam ser diferenciadas pelo conteúdo de lignina, da mesma forma que a composição da lignina (razão S/G) mostrou diferença entre os tecidos. O perfil dos oligômeros identificou doze compostos fenólicos dentre aldeídos, dímeros e trímeros e evidenciou o efeito de localidade entre os genótipos. Os padrões de expressão relativa de dezenove genes codificadores das enzimas da via de biossíntese de lignina foram obtidos, indicando elevado grau de complexidade na correlação entre os dados moleculares e bioquímicos referentes à lignina. Os resultados aqui apresentados trazem conhecimentos complementares importantes quanto à biossíntese de lignina em cana-de-açúcar, os quais podem contribuir para futuras manipulações de genes envolvidos em processos da biossíntese desse polímero como forma de otimizar a produção de etanol lignicelulósico, tendo a biomassa da cana-de-açúcar como matéria prima.
ABSTRACT
Sugarcane is the leading source of sucrose for first generation bioethanol production and more recently an important source of lignocellulosic biomass for second-generation ethanol production, obtained from cellulose deposited in plant cell walls. Lignin, a complex aromatic heteropolymer present in the secondary wall of plant cells, is the main factor conferring recalcitrance in lignocellulosic material and a major obstacle encountered by biorefineries for the viable production of ethanol. This biopolymer is formed by oxidative combinatorial coupling of mainly three p-hydroxycinnamyl alcohol monomers: p-coumaryl, coniferyl and sinapyl alcohols. When incorporated into the lignin polymer, these monomers are called p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) and syringyl (S) units, respectively, and are connected by different types of covalent bonds. With the knowledge about content and composition of lignin, and the types of linkages between H, G, and S that affect the recalcitrance of the cell wall, this study aimed at gaining knowledge regarding lignin composition and biosynthesis in four sugarcane genotypes grown under field conditions in two localities in the State of São Paulo. The genotypes were previously analyzed for lignin content and were contrasting for this characteristic: IACSP04-028 and IACSP04-053 with lower lignin content (± 4%) and IACSP04-691 and IACSP04-015, with higher lignin content (± 8 %). The cortex and medulla regions of the sugarcane stem, at two growth stages, could be distinguished by lignin content in the same way that the composition of lignin (S/G ratio) showed significant differences among these tissues. Oligomer profiling identified twelve phenolic compounds among aldehydes, dimers and trimers showing locality effect between genotypes. The relative expression patterns of nineteen genes encoding enzymes from the lignin biosynthetic pathway indicated a high degree of complexity when correlated with molecular and biochemical data. The results presented here provide an important additional knowledge about lignin biosynthesis in sugarcane, which can contribute to further study and manipulation of genes involved in the biosynthesis process of this polymer in order to optimize the production of lignocellulosic ethanol using sugarcane biomass as raw material. Keywords: Sugarcane. Lignin. Bioethanol.
SUMÁRIO DEDICATÓRIA ... 2 AGRADECIMENTOS ... 3 RESUMO ... 4 ABSTRACT ... 5 1 INTRODUÇÃO ... 10 1.1 Biocombustíveis ... 10 1.2 Cana-de-açúcar ... 12 1.3 Lignina ... 14 2 OBJETIVOS ... 22 2.1 Objetivo geral... 22 2.2 Objetivos específicos ... 22 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 23 3.1 Material vegetal ... 23
3.2 Determinação de lignina por Klason... 24
3.3 Perfil dos oligômeros de lignina ... 25
3.4 Determinação da razão S/G ... 25
3.5 Extração de RNA total e síntese de cDNA ... 26
3.6 Análise de expressão por qRT-PCR ... 27
3.7 Análises estatísticas ... 30
4 RESULTADOS ... 31
4.1 Determinação do conteúdo de lignina ... 31
4.2 Perfil dos oligômeros de lignina ... 34
4.3 Determinação da razão S/G ... 37
4.4 Análise de expressão por qRT-PCR ... 38
4.5 Análise da Componente Principal (PCA) ... 49
5 DISCUSSÃO ... 51
6 CONCLUSÃO ... 61
REFERÊNCIAS ... 62
1 INTRODUÇÃO
1.1 Biocombustíveis
O desenvolvimento industrial do século passado viu nos combustíveis fósseis uma fonte necessária e de extrema importância para o desenvolvimento da economia mundial, de modo que seu uso como fonte de energia se intensificou. O petróleo, atualmente o principal combustível fóssil, ganhou força na economia mundial e se tornou um dos principais fornecedores de energia aos diferentes setores da economia (IEA, 2004). A queima de qualquer tipo de combustível fóssil para a geração de energia, no entanto, é altamente poluente, causando danos ambientais e intensificando o chamado efeito estufa, que ocorre pela intensa emissão de, principalmente, dióxido de carbono na atmosfera (Koonin, 2006). Assim, a preocupação social com as questões ambientais e o alto preço dos combustíveis fósseis, além da crescente demanda do mercado levaram à busca de novas fontes energéticas que fossem economicamente viáveis em busca do desenvolvimento sustentável (Li et al., 2008; Nigam and Singh, 2011; Somerville, 2007). Como consequência disto surgem os biocombustíveis, denominação que se dá a todo combustível - gás, líquido ou sólido - produzido a partir de fontes biológicas de carbono. Tais fontes teriam como vantagens a redução da emissão de gases de efeito estufa, a melhora da segurança energética e do desempenho de veículos, além de promover maior desenvolvimento econômico rural (IEA, 2004; Nigam and Singh, 2011; Srivastava et al., 2010).
É evidente o crescente interesse no uso dos biocombustíveis líquidos no setor de transporte, setor de maior crescimento e uma das maiores fonte de poluição antropogênica (Pickett et al., 2008). Assim, a produção de biocombustíveis no século passado aumentou drasticamente, e projeções futuras indicam que até 2050 eles representarão 27% do total dos combustíveis de transporte (IEA, 2011).
Os dois principais biocombustíveis disponíveis atualmente no mercado são o bioetanol e o biodiesel (Li et al., 2008), sendo o primeiro de maior importância econômica, dado o volume de produção e consumo (Waclawovsky et al., 2010). O bioetanol é classificado em etanol de primeira ou segunda geração, de acordo com o modo de produção. O de primeira geração é produzido através da fermentação da sacarose ou amido, açúcares encontrados predominantemente na cana-de-açúcar e beterraba (sacarose), e grão de milho e mandioca (amido), entre outras plantas (Waclawovsky et al., 2010; Yuan et al., 2008). O etanol brasileiro derivado da cana-de-açúcar é o exemplo mais bem sucedido do uso eficiente de
energia renovável (Goldemberg, 2007). Em 2008, os biocombustíveis no Brasil representaram 21% da demanda por combustíveis no setor de transporte rodoviário, sendo o principal deles o etanol derivado da cana-de-açúcar. Enquanto, nos Estados Unidos, país que lidera a produção mundial de etanol derivado do milho, apenas 4% do combustível utilizado vem de biocombustíveis (IEA, 2011).
A crescente demanda de consumo e a perspectiva do uso do etanol como fonte de energia sustentável, no entanto, tem levado à busca pela maior produtividade e melhoria dos processos para sua obtenção (Goldemberg, 2007). Devido à biomassa ser potencialmente a fonte de melhor custo-benefício para a produção de etanol, a inovação dos biocombustíveis tem dado ênfase ao seu uso como matéria-prima para a produção de etanol (Carroll and Somerville, 2009). Assim, surge o etanol de segunda geração, uma potencial alternativa para o aumento da oferta de biocombustíveis provenientes de culturas energéticas. Neste conceito, surge a biomassa lignocelulósica, que se refere principalmente aos resíduos da cultura, e é representada pelos principais açúcares constituintes da parede celular, ou seja, celulose e hemicelulose. O uso desses açúcares para a produção de bioetanol não só aumentaria a oferta de etanol como também minimizaria a competição por terras agricultáveis para o cultivo de alimentos e combustíveis, como o caso do milho nos Estados Unidos (Dias et al., 2012; IEA, 2004; Koonin, 2006; Lisboa et al., 2011).
A biomassa lignocelulósica é composta por todas as partes da planta e inclui resíduos agrícolas como a palha de milho e o bagaço da cana-de-açúcar, bem como outras gramíneas e árvores (IEA, 2004). Em países tropicais, como o Brasil, o bagaço da cana-de-açúcar originado após a extração do caldo rico em sacarose, é o material mais abundante em lignocelulose, sendo que uma tonelada de cana-de-açúcar origina 280 kg de bagaço, o qual é composto por 39% de celulose, 25% de hemicelulose e 23% de lignina, entre outros componentes (Carroll and Somerville, 2009; Rabelo et al., 2011). Atualmente, o bagaço remanescente é utilizado para a geração de calor e eletricidade, através de termoelétricas instaladas nas próprias usinas de açúcar e álcool, que é empregada no processamento do açúcar em etanol, mas que também pode ser vendida no mercado de energia (Carroll and Somerville, 2009). A produção de etanol de segunda geração pode ser bastante vantajosa para a indústria da cana-de-açúcar, uma vez que o bagaço é prontamente disponível após a extração da sacarose para produção de etanol/açúcar, de modo que o etanol celulósico poderia ser co-produzido, compartilhando-se parte da infraestrutura onde o etanol de primeira geração é obtido (Dias et al., 2009; Dias et al., 2012; Rabelo et al., 2011).
1.2 Cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma espécie perene de clima tropical e subtropical, originária da Nova Guiné, no sudeste Asiático (Barnes, 1974). É uma monocotiledônea pertencente à família Poaceae, apresentando folhas longas e lanceoladas com elevada capacidade fotossintética, raiz fasciculada, e um caule complexo composto por tecidos epidérmico, vascular, meristemático e parenquimático, sendo segmentado em entrenós, os quais estão em diferentes etapas de desenvolvimento ao longo do caule (Moore, 1995).
Como uma planta de metabolismo C4, os genótipos de cana-de-açúcar (Saccharum spp. híbridos) apresentam alta capacidade de converter a radiação solar em biomassa, possuindo uma característica única dentro da família Poaceae, que é a capacidade de acumular até 60% da massa da matéria seca do caule como sacarose em tecidos maduros (Casu et al., 2004). Por essa característica é uma cultura de grande interesse econômico, pois possui o maior rendimento em toneladas entre todas as plantas cultivadas, sendo considerada uma das culturas mundiais mais importantes como fonte de sacarose para a produção de alimento - açúcar - e energia na forma de etanol (Dal-Bianco et al., 2012).
Com iniciativas governamentais, desde 1975 o Brasil passou a investir na produção da cana-de-açúcar para produzir etanol combustível como alternativa à importação do petróleo (Goldemberg et al., 2008). O Brasil, com isto, se tornou o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, com 8.810,43 mil hectares de área cultivada e colhida na safra 2013/2014, o que resultou na produção de 658.822,25 mil toneladas, das quais 360.901,82 mil toneladas foram destinada à produção de etanol, gerando 27,96 bilhões de litros (Conab, 2014). Como o Brasil, os Estados Unidos é um grande produtor de etanol, liderando o ranking de produção mundial, entretanto sua produção se dá a partir do amido extraído do milho. A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar, no entanto, tem a vantagem de não competir diretamente com a produção de alimentos, já que o milho e o amido do milho são utilizado em diversos alimentos, além de a cana-de-açúcar apresentar um melhor equilíbrio energético e maior potencial de retenção de gases de efeito estufa, quando comparado a outros sistemas, além de vantagens técnicas e econômicas (Goldemberg, 2007; Lisboa et al., 2011).
Há diferentes espécies de cana-de-açúcar dentro do gênero Saccharum, cada uma com características morfológicas e composição distintas (Dinardo-Miranda et al., 2008). Todas, no entanto, apresentam genoma complexo com alto grau de ploidia, sendo um desafio não só para o melhoramento genético tradicional como também para alternativas relacionadas
à manipulação através de biologia molecular (Grivet and Arruda, 2002). O genoma é ainda mais complexo nos híbridos cultivados atualmente, uma vez que são resultantes de cruzamentos interespecíficos entre, principalmente, S. officinarum (2n = 80), uma espécie
acumuladora de sacarose, e S. spontaneum (2n = 40-128), que possui vigor e resistência a patógenos e estresse abiótico. Dessa forma, as duas organizações cromossômicas coexistem para as cultivares atuais, apresentando ploidia que varia entre 2n = 100-130, preservando 15– 25% dos cromossomos de S. spontaneum e 60–70% de S. officinarum, além de cerca de 5-10% de recombinação cromossômica entre os homólogos (Arruda, 2012; Azevedo et al., 2011; Grivet and Arruda, 2002).
É fato que até pouco tempo o interesse no melhoramento da cana-de-açúcar se dava principalmente para otimização do conteúdo de açúcar. A geração de energia, recentemente, passou a ser bastante importante, merecendo a atenção dos programas de melhoramento devido à co-evolução dos biocombustíveis e da indústria energética, ampliando o interesse para a produção de genótipos com mais biomassa, com o objetivo de aumentar a produtividade do etanol pela produção do etanol lignocelulósico. Assim, os programas de melhoramento, atualmente estão introduzindo novos genótipos ancestrais em cruzamentos, no intuito de produzir genótipos com maior teor de fibra, os chamados cana-energia (Dal-Bianco et al., 2012; Matsuoka et al., 2014).
O etanol lignocelulósico, atualmente, já é produzido em escala comercial, sendo obtido por algumas indústrias a partir de resíduos agrícolas, como a palha de trigo, arroz, milho e culturas energéticas (www.biochemtex.com, www.granbio.com.br, www.raizen.com.br). As iniciativas para produção, porém, ainda são bastante restritas devido às dificuldades no processamento da biomassa, o que eleva os custos da produção (Escamilla-Treviño et al., 2014; Mielenz, 2001). O processamento para a obtenção do etanol celulósico (Figura 1) se inicia com o pré-tratamento de pulverização de ácido quente na biomassa, o qual parcialmente hidrolisa a hemicelulose e outros polissacarídeos, e desfaz a associação da lignina com o polissacarídeo. Na sequência o material hidrolisado é neutralizado, separado da fração insolúvel e fermentado para produzir etanol. A fração insolúvel é então tratada com celulase e glicosidases para a liberação da glicose, que é igualmente fermentada para produzir etanol. O material residual, composto principalmente por lignina é queimado para gerar energia para o processo (Somerville, 2007). Diversos fatores, entretanto, interferem no processamento da biomassa, como a estrutura cristalina da celulose, a quantidade de lignina e sua composição (razão S/G), a matriz polissacarídica, a abundância de ácido ferúlico e a matriz monossacarídica da fração hemicelulose (arabinose, galactose e xilose) (Van Acker et
al., 2013). A presença da lignina na biomassa e sua capacidade em resistir à degradação, porém, torna esse polímero fenólico o componente da parede celular vegetal responsável pela recalcitrância para o desdobramento da celulose em glicose e posterior fermentação para produção do etanol de segunda geração (Escamilla-Treviño et al., 2014; Sarkar et al., 2009).
Figura 1. Etapas da produção do etanol de segunda geração a partir da biomassa da cana-de-açúcar (modificado de Rabelo et al., 2011).
1.3 Lignina
As plantas ao longo da evolução desenvolveram mecanismos para se adaptarem melhor ao ambiente terrestre e superar desafios como a perda de água, radiação UV, variações na temperatura e ataques de patógenos e herbívoros, entre outros. Dessa maneira, modificações fisiológicas acompanharam as novas necessidades que o ambiente exigia, incluindo o desenvolvimento de vias metabólicas especializadas, dentre as quais, a de fenilpropanóides foi uma das mais importantes (Waters, 2003; Weng and Chapple, 2010). A
via de fenilpropanóides se desenvolve a partir de compostos formados pela via do chiquimato e é geradora de grande variedade de metabólitos secundários que contribuem para todos os aspectos do desenvolvimento e resposta a estresse biótico e abiótico das plantas. Dentre os diversos metabólitos estão os flavonoides, taninos, suberina e, principalmente, a lignina (Herrmann, 1995; Vogt, 2010).
A lignina é o componente estrutural mais importante da parede celular de plantas superiores, apresentando funções vitais como, por exemplo, promover rigidez ao sistema vascular, permitindo que as plantas tenham crescimento vertical; conferir hidrofobicidade ao xilema, o que auxilia o transporte de água, e conferir defesa estrutural contra microrganismos (Herrmann, 1995; Martone et al., 2009). Talvez a importância da lignina possa ser medida pela quantidade de carbono alocada em sua biossíntese, uma vez que depois da celulose, a lignina é o maior dreno de carbono em plantas (Weng e Chapple, 2010).
As moléculas de lignina consistem em um complexo heteropolímero fenólico resultado da polimerização oxidativa de unidades monoméricas de álcoois p-hidroxicinamílicos (monolignóis) (Figura 2), que diferem entre si pelo grau de metilação: álcool p-coumarílico (não metoxilado), álcool coniferílico (mono-metoxilado) e álcool sinapílico (di-metoxilado) (Ralph et al., 2004; Vanholme et al., 2010a). Após a incorporação dos monolignóis na molécula da lignina (lignificação), os mesmos passam a serem chamados, respectivamente, p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S) (Boerjan et al., 2003). As proporções entre cada uma dessas unidades variam conforme o organismo, tecido e até mesmo camadas celulares (Camarero et al., 2014). Além desses três monolignóis outros fenilpropanóides podem ser incorporados ao polímero da lignina em vários níveis, incluindo hidroxicinamatos, hidroxicinamil aldeídos e hidroxicinamil acetatos (Raes et al., 2003). Descobriu-se, mais recentemente, que a tricina, uma molécula de flavonoide, além de fazer parte do polímero de lignina (Figura 2), é iniciadora do processo de lignificação em monocotiledôneas, de modo a estabelecer a formação de dímeros precursores da molécula de lignina (Lan et al., 2015). Por tais motivos, as ligninas são consideradas moléculas não regulares, pois possuem variabilidade na sua composição e estrutura (Ralph et al., 2004).
Figura 2. Estrutura dos três monolignóis canônicos: álcool p-coumarílico (H), álcool coniferílico (G) e álcool sinapílico (S) (modificado de Kiyota et al., 2012) (A). Estrutura da molécula de tricina e do dímero precursor do polímero de lignina em monocotiledôneas, o flavonolignol (modificado de Lan et al., 2015) (B).
De modo geral, o material lenhoso das plantas é classificado em “softwood” - característica de gimnosperma, que apresenta lignina composta por unidades G e em menor quantidade por unidades H - e em “hardwood” - presente nas angiospermas dicotiledôneas, cuja lignina é composta de unidades G e S, e traços de H (Donaldson, 2001; Kishimoto et al., 2009). Em monocotiledôneas, ambas as unidades S e G estão presentes nas moléculas de lignina em níveis similares e a quantidade de unidades H é relativamente mais alta (Boerjan et al., 2003).
Os monômeros de lignina são sintetizados no citoplasma e transportados para a parede celular (Alejandro et al., 2012) de traqueídeos e elementos de vaso, mas também de esclerênquima, fibras do floema e periderme, onde são geralmente incorporados quando o crescimento celular está completo e a parede celular secundária começa a se espessar (Rogers and Campbell, 2004). O processo de lignificação, no entanto, se antecipa à parede primária de
células do xilema e se estende à parede secundária após sua completa formação (Donaldson, 2001).
Além da lignina, a parede celular vegetal é composta por celulose, hemicelulose e pectina (Cosgrove, 2005). A parede celular é a única fonte de celulose para a indústria de papel e mais recentemente para a produção de etanol lignocelulósico (Carroll and Somerville, 2009). A celulose é um longo polímero linear formado por moléculas de D-glicose que se ligam através de ligações glicosídicas β-1,4 formando as microfibrilas, que posteriormente se conectam através de múltiplas pontes de hidrogênio e forças de Van der Waals, dando origem a sua estrutura cristalina (Cosgrove, 2005). Na parede celular, a celulose está embebida em uma matriz de polissacarídeos hemicelulósicos que estão covalentemente ligados às heterogêneas e complexas moléculas de lignina formando a recalcitrante estrutura lignocelulósica que compõe a biomassa (Figura 3) (Vega-Sánchez and Ronald, 2010).
A resistência da parede celular de ser digerida em açúcares fermentáveis é chamada recalcitrância, e é considerada o principal obstáculo para a produção de biocombustíveis celulósicos a custo competitivo no mercado. Essa característica se dá, principalmente, pela presença da lignina que limita o acesso de enzimas hidrolíticas na quebra da celulose e hemicelulose (Escamilla-Treviño et al., 2014). A lignina, por sua vez, sendo um polímero não linear formado por diferentes unidades monoméricas unidas por ligações quimicamente diversas e de baixa reatividade impede o acesso de enzimas exógenas para sua degradação (Weng et al., 2008). No entanto, quando degradada através de tratamento químico seus subprodutos inibem a ação enzimática no processo de fermentação, diminuindo o rendimento da produção de biocombustível (Simmons et al., 2010). Consequentemente, o processo de conversão da biomassa em biocombustível requer préǦtratamento caro e severo para degradar a lignina, afrouxar a rigidez da parede celular e permitir o acesso de enzimas que desdobrarão a celulose em hexoses para consequente fermentação (Vanholme et al., 2010b). Dessa forma, as pesquisas recentes procuram alterar de alguma forma o acesso à celulose da parede celular, aumentando o rendimento e reduzindo os custos na produção de etanol celulósico (Marriott et al., 2014).
Figura 3. Diagrama ilustrando como as subunidades fenólicas de lignina infiltram-se nos espaços entre as microfibrilas de celulose (outros componentes da matriz são omitidos neste diagrama) (Taiz and Zeiger, 2013).
Características como o conteúdo de lignina, sua composição e os tipos de ligações existentes entre suas unidades são alguns fatores que afetam a recalcitrância da parede celular (Chen and Dixon, 2007; Kiyota et al., 2012). O grau de metilação dos três monolignóis canônicos lhes proporciona realizar ligações ditas mais ou menos recalcitrantes entre si, e por consequência, caracterizá-los (razão S/G) torna-se uma informação importante em termos de rendimento da produção (Van Acker et al., 2013). Lignina rica em unidades do tipo G é considerada mais recalcitrante, pois a presença de um sítio de ligação livre (C5) permite realizar ligações ditas mais recalcitrantes como: 8−5, 5−5 e 5−O−4 (Boerjan et al., 2003). Enquanto que lignina rica em unidades S, caracterizada pela ausência de sítios de ligação livres, realiza ligações de mais fácil clivagem, como a do tipo 8−O−4 (Kiyota et al., 2012).
O controle da biossíntese dos monolignóis é realizado por uma sequencia de enzimas bastante conhecidas, que atuam na via de fenilpropanóides (Figura 4), sendo bastante conservada na maioria das plantas vasculares (Weng and Chapple, 2010). Tais enzimas são normalmente organizadas em superfamílias, como oxigenases, ligases, oxido-redutases e transferases, e suas expressões são espacialmente e temporalmente controladas por famílias gênicas, o que confere especificidade em tecidos e órgãos e dá a característica química de cada planta (Vogt, 2010). Dez enzimas estão envolvidas na via de biossíntese dos monômeros de lignina: fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hidroxilase (C4H), 4-coumarato CoA ligase (4CL), hidroxicinamoil CoA:chiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase (HCT), ρ-cumarato 3-hidroxilase (C3H), cafeoil-CoA O-metiltransferase (CCoAOMT), ferulato 5-hidroxilase (F5H), cafeato O-metiltransferase (COMT), cinamoil-CoA redutase (CCR), cinamil álcool desidrogenase (CAD) (Vanholme et al., 2010a).
O início da via de fenilpropanóides se dá pela ação da PAL, cuja atuação marca a transferência do fluxo de carbono do metabolismo primário para o secundário, através da conversão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico, que é então para-hidroxilado pela C4H para produzir o ácido p-coumárico, que por sua vez se converte em p-coumaroil CoA por ação da 4CL (Figura 4). Esses três primeiros passos da via é comum a diferentes compostos fenólicos, pois o éster p -coumaroil CoA pode ser direcionado para a via de biossíntese de monolignóis ou de flavonóides (Weng and Chapple, 2010), representando um ponto de ramificação muito importante dentro da via de biossíntese dos fenilpropanóides (Bottcher, 2013). A enzima HCT dá continuidade à via de biossíntese dos monolignóis, catalisando dois passos da mesma. O primeiro é a formação do éster p-coumaroil chiquimato, precursor inicial das unidades S e G da lignina. O segundo se dá por ação da C3H, que promove a hidroxilação do p-coumaroil chiquimato, produzindo cafeoil chiquimato, que então sofre ação da HCT e origina o éster cafeoil CoA (Weng and Chapple, 2010). A CCoAOMT catalisa a primeira reação de transferência de um grupo metil, sintetizando feruloil-CoA à partir de cafeoil CoA. A via procede então pela ação da CCR sobre os ésteres hidroxicinamoil CoA para formar hidroxicinamaldeídos, que são hidroxilados pela ação da F5H ou reduzidos pela ação da CAD, última enzima da via, formadora direta dos monolignóis (Fraser and Chapple, 2011).
Figura 4. Via de biossíntese dos monolignóis e enzimas envolvidas. PAL, fenilalanina amônia-liase; C4H, cinamato 4-hidroxilase; 4CL, 4-hidroxicinamoil CoA ligase, HCT, hidroxicinamoil CoA: chiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase; C3H, ρ-Cumarato 3-hidroxilase; CCoAOMT, cafeoil-CoA O-metiltransferase; CCR, cinamoil-CoA redutase; F5H, ferulato 5-hidroxilase; COMT, cafeato O-metiltransferase; CAD, cinamil álcool desidrogenase; PER, peroxidase e LAC, lacase (Li et al., 2008).
As enzimas responsáveis pelas reações da via dos monolignóis são normalmente codificadas por famílias multigênicas na maioria das plantas (Bonawitz and Chapple, 2010). Sobretudo, de maneira isolada, os genes podem responder de modo diferente a estresses bióticos e abióticos (Vannozzi et al., 2012), e, portanto terem sua expressão alterada por esses fatores (Landi et al., 2014).
A engenharia genética, recentemente, tem sido usada extensivamente para produzir plantas que ou acumulam menos lignina ou produzem lignina que tenha composição diferente e seja mais susceptível à degradação química, numa tentativa de facilitar o processamento da biomassa vegetal para a produção de biocombustível (Carroll and Somerville, 2009). Para compreender a biossíntese de lignina e dar subsídios à estudos que
permitam a manipulação genética, Bottcher et al. (2013) fizeram em cana-de-açúcar um estudo sistemático dos genes da via de biossíntese de lignina, suas expressões e as variações no conteúdo e tipo de lignina. O estudo foi feito em dois genótipos contrastantes para o teor de lignina, provenientes de uma população produzida dentro de um programa de melhoramento para cana-de-açúcar forrageira. O estudo utilizou plantas coletadas do campo, e distinguiu os tipos de tecidos em colmos novos, intermediários e maduros, indo do ápice da planta para a base. Além disso, cada colmo foi separado em medula e córtex. Tendo como conclusão, o trabalho relatou a nível tecidual, a distinção de deposição e composição de lignina entre o córtex e a medula do colmo da cana-de-açúcar, que se acentua com a maturidade dos tecidos, além de ter gerado dados de expressão gênica bastante complexos para os genes analisados.
O presente trabalho foi desenvolvido por ser essencial para dar validade aos dados de Bottcher et al. (2013), obtidos a partir de apenas dois genótipos e cultivados em apenas uma localidade, Ribeirão Preto. Além disso, o material analisado por Bottcher et al. (2013) foi selecionado em função de determinações de lignina realizadas em material plantado em outros experimentos. No presente trabalho o teor de lignina foi determinado em vários genótipos plantados em cinco localidades e, em função desses dados, foi feita a seleção de duas localidades e de quatro genótipos a serem estudados mais detalhadamente. Os genótipos que Bottcher et al. (2013) usaram em seu estudo não são os mesmos que aqueles estudados aqui, mas pertencem à mesma população.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Verificar o comportamento em relação à biossíntese de lignina de quatro genótipos de cana-de-açúcar crescidos em condições de campo em duas localidades, incluindo análises bioquímicas e de expressão gênica, levando em conta tipos de tecidos e diferentes estádios de desenvolvimento que sabidamente diferem quanto ao teor desse polímero.
2.2 Objetivos específicos
Quantificar o teor de lignina nos quatro diferentes tecidos do colmo (ápice/córtex; ápice/medula; base/córtex e base/medula).
Analisar o perfil dos oligômeros precursores da molécula de lignina. Calcular a razão S/G.
Analisar a expressão relativa de genes envolvidos em cada passo enzimático da via biossintética dos monolignóis.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
Quatro genótipos de cana-de-açúcar (Saccharum spp. híbridos) contrastantes para o teor de lignina foram utilizados neste estudo. A seleção dos mesmos se deu, inicialmente, a partir de sessenta e seis genótipos gerados pelo programa de melhoramento da cana-de-açúcar realizado pelo Centro de Cana-de-açúcar do Instituto Agronômico em Ribeirão Preto, SP, Brasil. Destes genótipos, trinta foram selecionados quanto ao teor de lignina, sendo quinze com maior e quinze com menor teor, e então instalados em diferentes localidades do Estado de São Paulo. Estes materiais, posteriormente, foram analisados para características tecnológicas e bromatológicas, e em função dos teores de lignina nos locais de instalação dos ensaios e sua coincidência com os dados dos três anos de análises efetuadas pelo Instituto Agronômico, foram selecionados os quatro genótipos aqui analisados: IACSP04-028 e IACSP04-053, com baixo teor (± 4%), e IACSP04-691 e IACSP04-015, com alto teor (± 8%) dos ensaios de Ribeirão Preto (RP) e Pindorama (PIN).
A instalação dos genótipos foi feita no período entre março e abril de 2010, em Ribeirão Preto/SP (21o10’35.97” S e 47o94’14.74” W), no campo experimental do Centro Avançado de Tecnologia do Agronegócio de Cana do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) onde o solo é do tipo Latossolo Vermelho férrico, e em Pindorama/SP (21o11’12.62” S e 48o54’34.35” W), no Polo Regional de Desenvolvimento Tecnológico dos Agronegócios do Centro Norte, cujo solo é do tipo Argissolo Vermelho Amarelo eutrófico de textura arenosa/média. Ambos os municípios são classificados climaticamente segundo Koppen como Aw (CEPAGRI, 2015). A precipitação no período de cultivo foi semelhante entre os municípios, sendo em RP 2945,9 mm, e em PIN 2969,3 mm no período total, sendo as maiores concentrações de chuva ocorridas nos meses de outubro a março (CIIAGRO, 2015). No delineamento experimental os genótipos foram cultivados em blocos de Federer com duas repetições, sendo que cada bloco era constituído por trinta genótipos. Cada genótipo no bloco era representado por uma linha (sulco) de 4 m de comprimento, sendo o espaçamento entre linhas de 0,7 m. As plantas foram mantidas com adubação e procedimentos agronômicos habituais para primeira soqueira da cana-de-açúcar, conforme determinado pelo colaborador Dr. Ivan Antônio Anjos do Centro de Cana em Ribeirão Preto.
A coleta do material foi feita em outubro de 2012, sendo que as duas repetições do campo foram juntadas em uma amostra composta, e então subdivididas em três repetições. O
material foi separado em porção medular (pith - P) e cortical (rind - R) de duas regiões do colmo, apical (1º ao 3º entrenó - Y) e basal (16º e 17º entrenó - M). A separação da medula e córtex foi feita com o auxílio de uma lâmina, quando se procurou retirar não mais que os primeiros 3 mm do córtex (Figura 5). Imediatamente após a separação, os tecidos foram colocados em nitrogênio líquido e posteriormente armazenados em freezer -80ºC.
Figura 5. Material utilizado para as análises. (A) Entrenós da cana-de-açúcar maduro (superior) e jovem (inferior). (B) Corte transversal de um entrenó distinguindo a região do córtex (rind) e da medula (pith) (modificado de Cesarino et al., 2012).
Dessa forma, as amostras foram provenientes de quatro genótipos, quatro tecidos (YR=casca jovem, MR=casca madura, YP=miolo jovem, MP=miolo maduro) e colhidos em duas localidades (RP e PIN), com triplicata para cada tecido, gerando o total de 96 amostras.
O material congelado foi moído em nitrogênio líquido usando um moinho MICRO-MILL® GRINDER e, quando necessário, com almofariz e pilão, para a obtenção de um pó fino para melhores extrações nas análises.
3.2 Determinação de lignina por Klason
A quantificação de lignina das amostras foi feita pelo método Klason conforme modificações propostas por Rogers et al. (2005). Inicialmente o material macerado foi liofilizado e lavado com 100 mL de acetona em Soxhlet por 8 h. Na sequência, foi deixado a acetona residual evaporar em temperatura ambiente e com o material seco pesou-se 0,2 g de cada amostra, às quais foram adicionados 3 mL de H2SO4 (72%), sendo homogeneizadas em vórtex e colocadas em banho-maria à 20ºC por 2 h, com agitação por 1 min a cada 10 min. O
conteúdo foi então transferido para frascos de 125 mL, adicionou-se 112 mL de água MilliQ (concentração final de H2SO4 ؆ 2%), os frascos foram tampados e selados com fita para autoclave e autoclavados à 121ºC por 60 min. Depois de resfriadas para a temperatura ambiente, as amostras hidrolisadas foram filtradas a vácuo em filtros de fibra de vidro previamente secos em estufa 105ºC e pré-pesados. O material retido foi lavado com 200 mL de água MilliQ pré-aquecida à 50ºC, com a finalidade de remover os resíduos do ácido e açúcares. Uma alíquota do filtrado foi usada para leitura em espectrofotômetro a 205 nm e a lignina solúvel foi determinada de acordo com TAPPI UM 250 (1991). O material hidrolisado retido no filtro foi seco por 24 h em estufa à 105ºC e a massa obtida em balança. A lignina insolúvel foi determinada gravimetricamente a partir da diferença da massa final com a massa inicial do filtro.
3.3 Perfil dos oligômeros de lignina
A massa equivalente a 0,1 g de material liofilizado e finamente macerado foi utilizada para extração dos oligômeros de lignina (Kiyota et al., 2012). Foi feita extração em tubos Eppendorf com etanol 80% em ultrassom por 30 min, seguida de centrifugação em centrífuga de bancada à 14.000 rpm. O sobrenadante foi recuperado e seco em Speed Vac (Savant). O material seco foi solubilizado em 0,5 mL de água milli-Q e as ligninas foram extraídas com 0,6 mL de acetado de etila, com intensa agitação em vórtex. A fase orgânica foi coletada e evaporada em fluxo de N2. O resíduo seco foi solubilizado em solução aquosa, contendo 35% acetonitrila. Os compostos foram analisados em um cromatógrafo Acquity UPLC (Waters Corp.) acoplado a um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo (Micromass-Waters), conforme Kiyota et al. (2012). As identificações dos compostos foram baseadas em seus tempos de retenção, m/z e MS/MS com os dados disponíveis em biblioteca de banco de dados das ligninas sintetizados em nosso laboratório. A identificação dos oligômeros foi realizada pelo Dr. Eduardo Kiyota.
3.4 Determinação da razão S/G
Um novo método para a determinação da razão S/G, proposto por Mokochinski, et al. (dados não publicados) foi utilizado conforme segue. As amostras de material fresco foram
secas e 0,1 g foram hidrolisados com 2 mL de solução de 4 M NaOH em tubos de ensaio com tampa de rosca, que foram vedados com fita teflon. Na sequência, foram aquecidos durante 24 h à 95ºC em dry block. Após a etapa de hidrólise, os tubos foram resfriados à temperatura ambiente e acidificados com 1,6 mL de 6M HCl sendo agitadas em vórtex por 2 min. Em seguida as amostras foram centrifugadas à 7.000 rpm em centrífuga de bancada durante 5 min e do material sobrenadante retirou-se 500 µL, o qual foi transferido para um tubo de 2 mL. Na sequência foi feita extração com 1 mL de acetato de etila e agitação em vórtex por 2 min, a qual foi repetida por 3 vezes. A fase orgânica recuperada em cada centrifugação foi juntada, evaporada sob fluxo de N2 e o conteúdo foi solubilizado em 1,0 mL de água Milli-Q. Em seguida as amostras foram analisadas em um cromatógrafo Acquity UPLC (Waters Corp.) acoplado a um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo (Micromass-Waters). O software MassLynx V.4.1 (Waters Corp., Manchester, UK) foi utilizado para aquisição e tratamento dos dados. Os compostos da fração solúvel, provenientes da hidrólise alcalina, foram separados usando uma coluna C8 (50 mm × 2,1 mm; 1,7 µm). Como fase móvel utilizou-se água (A) e acetonitrila (B), seguindo o gradiente: 90% A até 4,5 min, mudando para 100% B em 8 min. Essa condição foi mantida constante até 9 min, e em seguida retornou-se para condição inicial estabilizando em 10 min. O fluxo manteve-se constante durante a corrida em 0,300 mL min-1. O volume de injeção foi de 5,0 µL. Os espectros de massas foram adquiridos em modo SIM para os íons m/z 121, 151 e 181, em modo negativo, sendo a voltagem do capilar -3,0 kV e do cone -52, -26 e -30 V para H, G e S, respectivamente. As temperaturas da fonte e de dessolvatação foram de 150°C e 350°C, respectivamente.
3.5 Extração de RNA total e síntese de cDNA
O RNA total do tecido macerado foi extraído inicialmente pelo método CTAB descrito por Chang et al. (1993), contudo, devido ao baixo rendimento da extração, optou-se pelo uso do Reagente Tri-Phasis (Bio Agency), cujo protocolo de extração foi otimizado por Porto (2010). Para se obter maior quantidade de RNA optou-se por extrair o RNA do córtex em duplicata e da medula em triplicata. Ao final das extrações, as replicatas de cada tecido foram unidas em uma amostra só.
Em um tubo Eppendorf de 2 mL foi adicionado aproximadamente 1/3 do seu volume com material finamente macerado e adicionou-se 1,5 mL do Reagente Tri-Phasis. O tubo foi agitado em vórtex por 30 s e incubado à temperatura ambiente por 30 min. Em
seguida o material foi centrifugado à 12.000 xg por 10 min à 4ºC, sendo a partir de então mantido em gelo. O sobrenadante foi recuperado, a ele adicionado 0,5 mL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v/v), seguido de agitação em vórtex por 15 s e centrifugação à 12.000 xg à 4ºC, por 15 min. Recuperou-se 1 mL do sobrenadante e a ele foram adicionados 0,25 mL de isopropanol e 0,25 mL de 10 M LiCl. O extrato foi mantido “overnight” à -20ºC para precipitação do RNA. Após esse período o conteúdo foi novamente centrifugado à 12.000 xg à 4ºC por 15 min, e o pellet formado foi lavado duas vezes com 1 mL de etanol 70%, com centrifugação à 12.000 xg por 5 min entre as lavagens. O pellet foi seco à temperatura ambiente e, posteriormente, solubilizado em água DEPC, definindo-se para as amostras de medula e córtex 30 µL e 20 µL, respectivamente.
A quantificação do RNA total foi feita em espectrofotômetro a 260 nm e a pureza verificada pela razão A260/A280, que deve ser próxima de 2,0. A qualidade do RNA foi verificada por eletroforese em gel agarose 1% com brometo de etídio e visualizada sob luz UV em fotodocumentador (Gel Doc 2000, BIORAD). As amostras de RNA total foram tratadas com DNAse, usando o kit Turbo DNAse-free (Ambion) e submetidas à transcrição reversa usando o kit SuperScript III de síntese de cDNA primeira fita (Invitrogen).
3.6 Análise de expressão por qRT-PCR
O banco de dados de EST da cana-de-açúcar (SUCEST - http://sucest-fun.org) foi extensivamente analisado por Bottcher et al. (2013), onde a partir de Sugarcane Assembled Sequences (SAS) identificou vários prováveis genes ortólogos relacionados com a síntese de lignina. Dezenove genes foram analisados aqui, sendo utilizados os mesmos pares de primers (Tabela 1) usados por Bottcher et al. (2013). A eficiência dos pares de primers foi determinada pela curva de eficiência, onde para todos eles esteve entre 90% e 110%. O par de primer, cuja eficiência foi diferente do parâmetro citado teve sua expressão calculada pelo valor da sua respectiva eficiência. A especificidade do amplicon foi verificada pela análise da curva de dissociação gerada pelo equipamento ao final de cada corrida. Usado como gene referência, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; forward: 5’-TTGGTTTCCACTGACTTCGTT-3’; reverse 5’-CTGTAGCCCCACTCGTTGT-3’), foi tido como sendo mais estável por Bottcher et al. (2013). Para cada amostra vegetal foram realizadas reações em duplicata técnica, e reações sem amostras foram utilizadas como controle negativo para cada par de primer. A quantificação relativa foi determinada pela
comparação da expressão entre o gene alvo e o gene referência, pelo método 2-ΔCq, onde ΔCq = (Cqtag – Cqref), sendo o Cq = Quantification cycle, definido como o número de ciclos necessários para a taxa de amplificação do gene alvo se tornar exponencial, tag = gene alvo, e ref = gene referência (Bustin et al., 2009; Livak and Schmittgen, 2001). As reações de qRT-PCR foram preparadas com o QuantiFastTM SYBR Green qRT-PCR Kit (Quiagen) e analisadas em um iCycler CFX96 TouchTM Real-Time PCR System (Bio-Rad) nas condições: 95oC por 3 min, seguidos por 40 ciclos de 95ºC por 10 s e 60ºC por 30 s.
Tabela 1. Genes, identificação das SAS, par de primers e tamanho do amplicons utilizados nas análises em RT-qPCR.
Gene SAS Par de primers Amplicon
(bp)
ShPAL1 SCCCLR1048D07.g
5´- AGGAGGAGAAGAGGAGGAAAATAC
- 3´ 150
5´- AGAAGAAAGAACAACGCCACA - 3´
ShPAL2 SCEQRT1024E12.g 5´- TCCCACAAAGCCAAAGC - 3´ 179
5´- ACACAGATGAGAGGAACAACG - 3´
ShPAL3 SCSGAM1094D05.g 5´- CTACCCGCTCTACCGCTTC - 3´ 200
5´- TCCCTATGCGTTTTTCTGTTC - 3´ ShPAL4 SCJLRT1013C01.g 5´- CAAGAGGCAAGAGGAGGAG - 3´ 200 5´- AGCAAGGTAAGAACAAACAGACA - 3´ ShC4H1 SCCCCL4009H01.g 5´- CCGCAGATCCAGCACTATG - 3´ 107 5´- ATCCAACACCATTCCTCAGC - 3´ ShC4H2 SCJFRZ2030D03.g 5´- ATCGTGAATGCTTGGGCTCT - 3´ 170 5´- CTTGTTCCTGGGCAAATCCT - 3´ Sh4CL1 SCCCCL3002A03.g 5´- AGCCGTTCCAGGTCAAGTC - 3´ 161 5´- CTCGGGGTCGTTCAGGTAA - 3´ Sh4CL2 SCVPLB1015F12.g 5´- CACACTGGGGACATTGGTT - 3´ 162 5´- CATTGAGACAACAGCAGCATC - 3´ ShHCT1 SCCCCL4009E02.g 5´- AGCACAGAGAAGCGGAGAAG - 3´ 151 5´- AAAGGGGGCAAGCAGAAA - 3´ ShHCT-like SCVPRT2082B07.g 5´- GCAGGTGGTAGAGTCGTCGT - 3´ 81 5´- ATGAGGTCCAGGGGAGAGAG - 3´ ShC3H1 SCVPCL6041E07.g 5´- TCACTGCTGGAATGGACACA - 3´ 163 5´- TGTAGGTAGGGGAGGTTCTGG - 3´ ShC3H2 SCQSRT1036E09.g 5´- CCGGTCTCGTCACCTTCA - 3´ 155 5´- CAACAGCATCAGCTTCCAAA - 3´ ShCCoAOMT1 SCAGCL6012G12.g 5´- GACGCCGACAAGGACAAC - 3´ 162 SCCCLR1069B09.g SCCCLR1079A02.g 5´- CACGAAGTCGCGGTAGAAG - 3´ SCRUFL4024C06.b ShCCoAOMT2 SCJLRT2050C09.g 5´- TTGCTGCTGCGTAATCCTC - 3´ 117 SCQSRT1034C09.g 5´- GCGGATGGAAAGARAGAAAA - 3´ ShCCR1 SCCCRZ2C01A04.g 5´- GCTGGTCGGTCTCTTATCATC - 3´ 214 SCBFRT1064A01.g 5´- CTGACGGTTCCCTTGACAG - 3´ ShF5H1 SCJLRT1022E04.g 5´- GCACTACGGTCCCTTCTGG - 3´ 194 5´- TCACGTTCTTGGTCAGGTTG - 3´ ShCOMT1 SCRFLR1012F12.g 5´- GAGGACAAGGACGGCAAGT - 3´ 139 SCJLRT1023B09.g 5´- AGTACCAGCTCTCCATGAGGAC - 3´
ShCAD2 SCBFAM2021E08.g 5´- CCCCTACACCTACACCCTCA - 3´ 157
SCEPRZ1011A02.g 5´- CACCTCACCGACCACCTC - 3´
ShCAD8 SCEQLR1029E05.g 5´- ACGGCTGGAGAAGAACGAC - 3´ 154
5´- GCAAAGCACCAACTCATCAA - 3´
Sh, Saccharum spp. híbrido; PAL, fenilalanina amônia-liase; C4H, cinamato 4-hidroxilase; 4CL, 4-hidroxicinamoil CoA ligase, HCT, hidroxicinamoil CoA: chiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase; C3H, ρ-Cumarato 3-hidroxilase; CCoAOMT, cafeoil-CoA O-metiltransferase; CCR, cinamoil-CoA redutase; F5H, ferulato 5-hidroxilase; COMT, cafeato O-metiltransferase; CAD, cinamil álcool desidrogenase.
3.7 Análises estatísticas
O teste t de Student foi utilizado para avaliar as diferenças no teor de lignina entre medula e córtex, tecido jovem e maduro, e entre o mesmo tecido comparando RP e PIN, bem como para analisar diferenças entre os estádios de desenvolvimento dos tecidos na análise da razão S/G. One-way ANOVA foi usada para identificar diferenças no teor de lignina para o mesmo tecido entre os quatro genótipos, bem como para as análises da razão S/G e expressão gênica para avaliar diferenças entre os tecidos. Quando uma variação significativa foi encontrada, a comparação das médias foi feita pelo teste de Tukey a 5%. Os resultados das análises foram expressos pela média e erro médio padrão (n=3). A normalização dos dados de expressão gênica se deu pela transformação em escala logarítmica de base 10. Para as análises utilizou-se o programa estatístico GraphPad Prism 6.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego,CA, USA). A Análise do Componente Principal (PCA) foi realizada pelo programa The Unscrambler® X 10.2 (Camo AS, Oslo, Norway), sendo consideradas as análises quantitativas: lignina solúvel e insolúvel, razão S/G e expressão gênica.
4 RESULTADOS
4.1 Determinação do conteúdo de lignina
A determinação de lignina pelo método Klason mostrou que os teores de lignina solúvel (Figura 6) e insolúvel (Figura 7) encontrados nos quatro genótipos puderam diferenciar os tecidos da cana-de-açúcar analisados.
Os dados obtidos sugeriram, de modo geral, que o teor de lignina solúvel (Figura 6) é maior em tecidos jovens do que em maduros, apresentando valores entre 5,9 e 22,8 mg/g de massa de matéria seca, dentre todos os tecidos de plantas crescidas nas localidades de Ribeirão Preto (RP) e Pindorama (PIN). Nota-se ainda a existência de clara tendência do teor ser maior na medula do que no córtex, sendo isto evidente estatisticamente nos tecidos maduros. As análises de lignina solúvel também permitiram observar que apesar de certa tendência, não houve diferenças estatísticas significativas entre os tecidos jovens de um mesmo genótipo nas diferentes localidades. Porém, os tecidos maduros dos diferentes genótipos crescidos na localidade de PIN apresentaram maiores teores de lignina solúvel, tanto no córtex como na medula, do que os mesmos genótipos crescidos na localidade de RP, com exceção do genótipo IACSP04-015. Comparando-se os genótipos notou-se que em ambas as localidades o comportamento foi o mesmo, sendo o IACSP04-028 o único genótipo que não apresentou diferença estatística entre córtex e medula, apenas a tendência para essa diferenciação. O mesmo ainda mostrou quantificação entre esses tecidos contrária ao padrão observado para lignina solúvel nos demais genótipos em se tratando apenas de tecidos jovens de PIN.
L ig n in re la ti v e a m o u n t (m g /g d ry c e ll w a ll re s id u e s ) R P R P R P R P 0 1 0 2 0 3 0 aA2 aA1 aA1 aA1 aA1 aA1 aA1 aA1 R P R P R P R P aA1 aA1 aA1 aA1 aA1 a B1 a A B1 a A B1 L ig n in re la ti v e a m o u n t (m g /g d ry c e ll w a ll re s id u e s ) R P R P R P R P 0 1 0 2 0 3 0 bA2 b A B2 aA2 b B1 aA1 a C2 a C 2 a B 2 R P R P R P R P IA C S P 0 4 - 0 2 8 IA C S P 0 4 - 0 5 3 IA C S P 0 4 - 6 9 1 IA C S P 0 4 - 0 1 5 a A1 bC1 b B1 bD1 a A1 a A B1 a A 1 a B2 R ib e ir ã o P r e to P in d o r a m a Y O U N G M A T U R E * * * * * * * * *
Figura 6. Teor de lignina solúvel obtido pelo método Klason, nos genótipos IACSP04-028, IACSP04-053, IACSP04-691 e IACSP04-015 para as localidades de RP e PIN. YOUNG, tecidos jovens (entrenós 1+2+3); MATURE, tecidos maduros (entrenós 16+17); R (rind) = córtex; P (pith) = medula. As letras minúsculas indicam diferenças estatísticas entre diferentes tecidos dentro de um mesmo genótipo; as letras maiúsculas indicam diferenças entre os quatro genótipos para um mesmo tecido; os números indicam diferenças estatísticas entre as duas localidades para o mesmo tecido; e o asterisco indica diferença no mesmo tecido entre estádios de desenvolvimento diferentes. As barras verticais indicam erro padrão da média (n=3). Análise pelo teste t e Tukey a 5% de probabilidade.
O teor de lignina insolúvel (Figura 7) pelo método Klason representa a lignina polimerizada, que efetivamente forma a estrutura do polímero. Os dados obtidos mostraram variação no teor de lignina entre 116,2 e 259,6 mg/g de massa de matéria seca, sendo os maiores valores encontrados no córtex de tecidos maduros. Na medula os valores tenderam a ser próximos entre os entrenós maduro e jovem. O comportamento dos genótipos na deposição de lignina insolúvel foi contrário ao de lignina solúvel, uma vez que o teor de insolúvel é maior no córtex que na medula, diferença esta que também se acentua com a maturidade, como mostrado estatisticamente para canas-de-açúcar de ambas as localidades, exceto para o genótipo IACSP04-053 em RP. Em PIN, sobretudo, a diferença entre córtex e medula pôde ser notada desde os entrenós mais jovens, com exceção ao genótipo IACSP04-691 (Figura 7).
A classificação prévia dos genótipos quanto ao teor de lignina (IACSP04-028 e IACSP04-053 com menor teor e IACSP04-691 e IACSP04-015 com maior teor) não foi confirmada pelas análises com o método Klason, uma vez que os níveis de lignina no genótipo IACSP04-691 mais se assemelharam aos genótipos de baixa lignina. Sobretudo, apenas em PIN o genótipo IACSP04-015 se manteve com o maior teor de lignina insolúvel em ambos os tecidos analisados.
Diferenças no teor de lignina entre as localidades e tecidos foram evidentes estatisticamente, porém, não foi regra para todos os tecidos, condições e localidades de cultivo. L ig n in re la ti v e a m o u n t (m g /g d ry c e ll w a ll re s id u e s ) R P R P R P R P 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 aA1 aA1 aA1 aA1 aA1 aA1 aA 1 bA1 R P R P R P R P aA1 a B1 a B1 a B1 bA1 b B2 b B2 a A B1 L ig n in re la ti v e a m o u n t (m g /g d ry c e ll w a ll re s id u e s ) R P R P R P R P 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 aA1 a B2 a A B1 a A B1 bA2 bA1 aA1 bA1 R P R P R P R P IA C S P 0 4 - 0 2 8 IA C S P 0 4 - 0 5 3 IA C S P 0 4 - 6 9 1 IA C S P 0 4 - 0 1 5 aA1 a B1 a C1 a C2 bA1 b B1 b B2 b B1 R ib e ir ã o P r e to P in d o r a m a Y O U N G M A T U R E * * *
Figura 7. Teor de lignina insolúvel obtido pelo método Klason, nos genótipos IACSP04-028, IACSP04-053, IACSP04-691 e IACSP04-015 para as localidades de RP e PIN. YOUNG, tecidos jovens (entrenós 1+2+3); MATURE, tecidos maduros (entrenós 16+17); R (rind) = córtex; P (pith) = medula. As letras minúsculas indicam diferenças estatísticas entre diferentes tecidos dentro de um mesmo genótipo; as letras maiúsculas indicam diferenças entre os quatro genótipos para um mesmo tecido; os números indicam diferenças estatísticas entre as duas localidades para o mesmo tecido; e o asterisco indica diferença no mesmo tecido entre estádios de desenvolvimento diferentes. As barras verticais indicam erro padrão da média (n=3). Análise pelo teste t e Tukey a 5% de probabilidade.
4.2 Perfil dos oligômeros de lignina
A análise da lignina solúvel possibilitou identificar vários oligômeros e assim comparar quais estruturas e tipos de ligações potencialmente existem na lignina que compõe os tecidos dos genótipos estudados. Para isso, os dados foram considerados válidos quando a estrutura foi identificada em pelo menos duas das três repetições amostrais analisadas. A identificação foi possível pela comparação com a os dados da biblioteca “Do-It-Yourself” (DIY) disponibilizada por Kiyota et al. (2012), a qual leva em consideração a m/z, o tempo de retenção, a fórmula estrutural e o padrão de fragmentação MS/MS. Doze diferentes estruturas fenólicas foram identificadas nos tecidos (Tabela 2), sendo eles, dois aldeídos, quatro dímeros e seis trímeros. Foram identificadas três estruturas não detectadas por Kiyota et al. (2012): um dímero (m/z = 405) e dois trímeros (m/z = 601), sendo estas confirmadas por seus padrões de fragmentação e m/z. O dímero S(8-O-4)G (m/z = 405) foi detectado em apenas duas amostras distintas e não esteve presente em pelo menos duas repetições das mesmas, por esse motivo não fez parte das análises referentes às Figuras 9 e 10.
Com estes dados não se pôde diferenciar os tecidos com clareza, no entanto, foi possível notar a presença de estruturas que são predominantes em estádios de desenvolvimento e tecido específico. Três tipos de ligações covalentes foram observadas: 8-O-4, 8-5 e 8-8 (Tabela 2). Dois dos dímeros apresentaram ligações 8-5 e outros dois ligações 8-O-4, e entre os trímeros as ligações identificadas foram do tipo 8-O-4, com apenas duas ligações 8-5 e uma 8-8. Não foram identificadas estruturas contendo unidades do tipo H. Entre as unidades S e G, a ligação mais frequente foi 8-O-4, considerada menos condensada e, portanto, de clivagem mais fácil.
A distribuição dos oligômeros (Figura 8) e o registro de frequência das estruturas entre os genótipos e entre as localidades (Tabela 3) permitiu observar padrões de distribuição entre as estruturas. Observou-se que a estrutura predominante entre os tecidos foi o trímero G(8-O-4)S(8-5)G (m/z = 583) e a menos frequente o trímero S(8-O-4)G(8-O-4)G (m/z = 601), este último, mostrando ser um oligômero típico da região periférica. De modo geral os trímeros S(8-O-4)S(8-5)G (m/z = 613), S(8-O-4)G(8-O-4)S (m/z = 631) e S(8-O-4)S(8-8)S (m/z = 643) foram as estruturas mais frequentes em tecidos maduros, como mostra a Figura 8, sendo eles menos frequentes entre os genótipos IACSP04-028 e IACSP04-691 em relação à IACSP04-053 e IACSP04-015. O dímero G(8-5)G (m/z =357) e o trímero S(8-O-4)G(8-O-4)G (m/z = 601) tiveram baixa frequência, e foram ausentes em 028 e IACSP04-691. Entre os tecidos jovens, apenas para IACSP04-028 de RP não foram detectados aldeídos
e dímeros. Na região central do colmo não foi detectado coniferil aldeído e nenhum dos compostos foi considerado como típico a este tecido.
Tabela 2. Massa (m/z), tempo de retenção dos monolignóis e oligômeros identificados nos genótipos IACSP04-028, IACSP04-053, IACSP04-691 e IACSP04-015, obtidos por UPLC-MS/MS.
Tempo de retenção (min) Estrutura m/z
3.3 coniferil aldeído 177 3.25 sinapil aldeído 207 3.45 G(8-5)G 357 3.2 S(8-5)G 387 3.2 G(8-O-4)S 405a 3.4 S(8-O-4)G 405b 3.6 G(8-O-4)S(8-5)G 583 3.0 G(8-O-4)S(8-O-4)G 601a 3.4 S(8-O-4)G(8-O-4)G 601b 3.6 S(8-O-4)S(8-5)G 613 3.5 S(8-O-4)G(8-O-4)S 631 3.75 S(8-O-4)S(8-8)S 643
Frequência das ligninas nas repetições amostrais: 0-1x = 2x = 3x =
Figura 8. Distribuição dos oligômeros (m/z) identificados nos genótipos IACSP04-028, IACSP04-053, IACSP04-691 e IACSP04-015 sob condições de campo nas localidades de RP e PIN. YP (young pith) = medula jovem, YR (young rind) = córtex jovem, MP (mature pith) = medula madura, MR (mature rind) = córtex maduro. A estrutura 405b como não foi registrada em pelo menos duas repetições amostrais, portanto não foi inserida na figura. Os valores de massa/carga (m/z) correspondem aos aldeídos e oligômeros encontrados na Tabela 2.
Os genótipos IACSP04-053 e IACSP04-691 foram os que mais apresentaram variação no perfil dos oligômeros, como evidenciado na Figura 8, pela presença de mais compostos entre os tecidos nos genótipos provenientes de PIN do que os de RP. IACSP04-053 foi o genótipo que apresentou maior frequência de estruturas entre os tecidos, e aquele com menor frequência foi IACSP04-028, ambos provenientes de PIN (Figura 8). Foi possível observar que o efeito de localidade influenciou na síntese dos monômeros e oligômeros (Tabela 3), isto devido à diferença na detecção dos mesmos entre os genótipos, uma vez que compostos como coniferil aldeído (m/z = 177), G(8-5)G (m/z = 357), G(8-O-4)S (m/z = 405), G(8-O-4)S(8-O-4)G e G(8-O-4)S(8-O-4)G (m/z = 601), S(8-O-4)S(8-O-4)S (m/z = 643) foram detectados apenas em uma localidade e ausentes em outra entre os tecidos analisados (Figura 8).
m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b 613 631 643 m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b613 631 643
YP YP
YR YR
MP MP
MR MR
m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b 613 631 643 m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b613 631 643
YP YP
YR YR
MP MP
MR MR
m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b 613 631 643 m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b613 631 643
YP YP
YR YR
MP MP
MR MR
m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b 613 631 643 m/z 177 207 357 387405a 583601a 601b613 631 643
YP YP YR YR MP MP MR MR IACSP04-028 IACSP04-691 IACSP04-053 IACSP04-015 P IN R P P IN R P P IN R P P IN R P
Tabela 3. Frequência das estruturas identificadas no perfil dos oligômeros por UPLC-MS entre os tecidos considerando as repetições amostrais. (A) relação entre todos os genótipos dentro de cada localidade. (B) entre cada genótipos.
4.3 Determinação da razão S/G
Os resultados da determinação da razão S/G nos quatro tecidos analisados são mostrados na Figura 9. De modo geral em ambas as localidades os quatro genótipos mantiveram o mesmo padrão, o qual se deu pela razão S/G ser menor nos tecidos jovens e aumentar com a maturidade. Em RP, na fase jovem do desenvolvimento dos tecidos, o córtex mostrou a tendência em ter a razão S/G maior que a medula, sendo o inverso observado nos tecidos quando maduros. Entre os quatro tecidos, as menores relações S/G foram observadas nos tecidos jovens do genótipo IACSP04-028 (0,43 no córtex e 0,30 na medula) e os maiores valores para os tecidos maduros de IACSP04-015 (3,95 no córtex e 4,10 na medula). Notou-se também que os genótipos IACSP04-691 e IACSP04-015 apresentaram maior razão S/G, enquanto IACSP04-028 e IACSP04-053 apresentaram menor razão, o que foi bastante evidente em PIN. A 177 207 357 387 405a 583 601a 601b 613 631 643 Ribeirão Preto 8 26 2 33 8 43 2 2 37 26 16 203 Pindorama 16 37 8 37 15 47 6 5 34 25 20 250 B 177 207 357 387 405a 583 601a 601b 613 631 643 IACSP04-028 4 7 0 12 2 22 6 0 15 8 5 81 IACSP04-053 5 17 4 18 12 21 2 2 21 17 12 131 IACSP04-691 10 17 0 21 2 23 0 0 13 10 6 102 IACSP04-015 5 22 6 19 7 24 0 5 22 16 13 139 m/z m/z Localidade Genótipo Frequência total Frequência total
Figura 9. Razão S/G nos genótipos 028, 053, 691 e IACSP04-015 para as localidades de RP e PIN. YP, medula jovem; YR, córtex jovem; MP, medula madura; MR, córtex maduro. As letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos para o mesmo tecido, as letras minúsculas indicam diferença entre tecido jovem e maduro e o asterisco entre as localidades para o mesmo tecido. As barras verticais indicam erro padrão das médias (n=3). Análise pelo teste t e Tukey a 5% de probabilidade.
4.4 Análise de expressão por qRT-PCR
Foram selecionados 19 genes a partir do trabalho de Bottcher et al. (2013) baseando-se nos maiores níveis de expressão obtidos pelos autores e na eficiência de amplificação dos pares de primers no material vegetal utilizado neste trabalho.
Quatro genes codificadores de enzimas PAL foram analisados (Figura 10) e claramente pôde-se observar que os níveis de transcritos de ShPAL1 e ShPAL4 mantiveram-se mais altos do que os de ShPAL2 e ShPAL3, independente do tecido, genótipo ou localidade. Para os quatro genes o que se observou ainda foi que, com pouquíssimas exceções, houve
clara tendência de queda nos níveis de expressão nos tecidos de colmos maduros. Os níveis de expressão das isoformas ShPAL analisadas foram semelhantes entre córtex e medula de colmos jovens e entre córtex e medula de colmos maduros.
Figura 10. Perfil de expressão relativa das quatro isoformas do gene ShPAL em relação ao gene referência. YR = córtex jovem, MR = córtex maduro, YP = medula jovem, MP = medula madura. IACSP04-028 e IACSP04-053 = genótipo com baixo teor de lignina, IACSP04-691 e IACSP04-015 = genótipo com alto teor de lignina.
Dos dois genes codificadores da enzima C4H analisados, ShC4H1 foi o gene que apresentou maior nível de expressão tanto no córtex como medula nos quatro genótipos analisados, padrão que se manteve independentemente do local de cultivo (Figura 11). Por outro lado, embora ShC4H2 tenha tido menor expressão, sempre houve maior expressão na medula e córtex de colmo maduro, exceto para o genótipo IACSP04-015 em PIN. De forma inversa e ainda que tenha tido maior expressão do que ShC4H2, o gene ShC4H1 apresentou tendência de manter igual (genótipos IACSP04-028 e IACSP04-053) ou menor o nível de transcritos nos tecidos de colmos maduros, sendo isto mais evidente em PIN.
Figura 11. Perfil de expressão relativa dos genes ShC4H1 e ShC4H2 em relação ao gene referência. YR = córtex jovem, MR = córtex maduro, YP = medula jovem, MP = medula madura. IACSP04-028 e IACSP04-053 = genótipo com baixo teor de lignina, IACSP04-691 e IACSP04-015 = genótipo com alto teor de lignina.
Dos dois genes codificadores da enzima 4CL analisados, Sh4CL2 sempre apresentou maior nível de transcritos do que Sh4CL1 nos tecidos de colmos jovens (Figura 12). Por outro lado, os níveis de expressão de Sh4CL1 e Sh4CL2 em tecidos maduros hora foi maior para um ou para o outro gene. Ainda que tenha sido observada certa variação, os genótipos apresentaram padrão de expressão bastante semelhante entre as duas localidades, sendo a exceção mais evidente o córtex dos colmos jovens e maduros do genótipo IACSP04-015.
Figura 12. Perfil de expressão relativa dos genes Sh4CL1 e Sh4CL2 em relação ao gene referência. YR = córtex jovem, MR = córtex maduro, YP = medula jovem, MP = medula madura. IACSP04-028 e IACSP04-053 = genótipo com baixo teor de lignina, IACSP04-691 e IACSP04-015 = genótipo com alto teor de lignina.
