A elaboração deste trabalho experimental teve como base o estudo das alteração do metabolismo por parte das células neoplásicas. Deste modo, foram seleccionados três genes envolvidos no metabolismo celular para avaliar a sua expressão génica em quatro tipos histológico de alterações e lesões mamárias.
A indução tumoral através do composto químico 7,12 – dimetilbenzantraceno (DMBA) resultou no aparecimento de uma variedade de lesões macroscópicas como pode ser observado na tabela 4.1.1.; estas foram classificadas e agrupadas em quatro grupos histológicos: hiperplasia, neoplasia benigna, carcinoma (neoplasia maligna) não- invaso e carcinoma invasivo. Deste modo podemos obter uma visão global das alterações ao nível da expressão ao longo da progressão da doença neoplásica. As lesões maioritariamente observadas foram as hiperplasias e as neoplasias malignas invasivas, ou seja uma alteração não neoplásica mas que pode, em alguma circunstâncias, constituir uma alteração pré-tumoral e uma fase final da doença, uma vez que as hiperplasias no rato podem progredir para fibroadenomas e papilomas (Dias et al, 1999).
A avaliação da expressão génica é baseada na quantificação do número de cópias de mRNA do gene-alvo presentes na amostra. Para que esta avaliação possa ser estimada é necessário obter um RNA de alta qualidade e integridade, sendo necessário realçar a necessidade da boa preservação das amostras e do recurso a um bom método de extracção de RNA. A fim de garantir a boa qualidade e integridade do RNA, as amostras depois de extraídas foram avaliadas através do kit “Agilent RNA Nano Kit”. A integridade do RNA foi avaliada em função do RIN “RNA Intregrity Number”. O valor de RIN é um algoritmo obtido pelo quociente entre o RNA 28S/18S, algoritmo este que permite a classificação do RNA total através da numeração de 1 a 10, onde 1 representa uma amostra muito degradada e 10 uma amostra de alta integridade. Para procedimentos como o RT-PCR podem-se utilizar amostras que apresentem valores de RIN ≥ 5 (Schroeder et al, 2006). Tendo em conta este parâmetro foram eliminadas todas as amostras abaixo deste valor, de modo a garantir a qualidade dos resultados obtidos. Por esta razão foram também eliminadas três amostras que tinham um pico supranumerário, uma vez que não foi possível avaliar a natureza da sustância contaminante.
A compreensão dos fenómenos moleculares que estão por detrás da transformação neoplásica, nomeadamente quais as alterações a nível da expressão génica durante a progressão da doença neoplásica tem sido alvo de intensos estudos, com o objectivo não só de compreender os mecanismos, assim como de descobrir potenciais alvos de diagnóstico, prognóstico e intervenção terapêutica. Do mesmo modo, desde Otto Warburg em 1927 até aos dias de hoje, vários têm sidos os estudos que investigam a reprogramação metabólica das células neoplásicas compreendendo a actividade enzimática envolvidas no metabolismo da glicose. Com o avanço das tecnologias moleculares, começou a ser alvo de crescente interesse os níveis de expressã dos genes directamente envolvidos no metabolismo celular e descobrir de que forma esta expressão é modelada.
Existem diversos estudos sobre a expressão de genes envolvidos no metabolismo das neoplasias mamárias (Yen et al, 2010; Reitman and Yan, 2010; Kennedy and Dewhirst, 2010; Ortega et al, 2009; ScornacK, 2005) mas, bibliografia consultada, não foram encontrados estudos da variação da expressão dos três genes analisados neste estudo (citrato cintase, acetil-coA carboxilase alfa e glucose-6-fosfatase, sub-unidade (catalítica) nos diferentes tipos histológicos de lesões mamárias induzidas por DMBA.
Como já foi dito nos capítulos anteriores, a expressão dos genes em estud foi quantificada de forma relativa, ou seja, quantificada em relação á expressão de um controlo endógeno (gene housekeeping). O controlo endógeno escolhido neste estudo foi o gene Actina-β, que é um dos melhores genes de controlo endógeno mesmo quando se estudam neoplasias (Kok et al, 2005; Rubie et al, 2004; Lupberger et al, 2002; Suzuki et al, 2000).
O gene Citrato sintase codifica uma proteína mitocondrial que participa no ciclo de Krebs e que catalisa a síntese de citrato a partir de Acetil-coA. Em média a expressão do gene Cs nos quatro tipos histológicos foi inferior à expressão do gene Cs no tecido normal mas, esta diferença apenas é significativa nos grupos das lesões neoplásicas e dentro destas observou-se uma diferença significativa entre as neoplasia benigna e as malignas. De um grosso modo, pode-se afirmar que a expressão do gene Cs diminui ao longoda progressão da doença oncológica. A diminuição da expressão deste gene no estado neoplásico pode dever-se ao facto de, nas células neoplásicas, a actividade do ciclo de Krebs estar diminuída devido à sua preferência pela via da glicólise para a
síntese de ATP. Uma vez que a actividade enzimática mitocondrial está diminuída é de esperar que a expressão dos genes que codificam estas enzimas esteja diminuída.
Uma pesquisa por padrões de expressão génica na base de dados “GEO profiles”, uma base de dados desenvolvida pelo NCBI que permite a pesquisa perfis de expressão génica para uma grande variedade de genes de diferentes espécies, foi encontrado um padrão de expressão deste gene em tumores de mama de rato induzidos por NMU (N-metil-N-nitrosureia) em que a expressão deste gene era inferior nas amostras tumorais do que nas amostras normais. Este padrão apenas distingue o normal do neoplásico não fazendo diferença entre os diferentes tipos histológicos. No entanto, este padrão corrobora os resultados obtidos neste trabalho, revelando que a expressão do gene da citrato sintase é inferior nas neoplasias(GEO profiles, 2005a).
O gene Acaca (acetil-coA carboxilase alfa) codifica um complexo sistema enzimático multifuncional que catalisa a carboxilação do acetil-coA em malonil-coA, um passo limitante da via de síntese de ácidos gordos, esta via é essencial à proliferação neoplásica. A expressão de Acaca pode ser regulada por uma variedade de factores como nutrição, hormonas e outras respostas fisiológicas. A expressão deste gene parece ser essencial no desenvolvimento embrionário e os valores de proteína foram relatados como aumentados na células tumorais. A síntese de ácidos gordos providencia componentes-chave na biossintese de membranas celulares e desempenham um papel importante na sinalização celular (Milgraum et al, 2007)
Contrariamente ao esperado, no nosso estudo apenas observámos um aumento da expressão no grupo das neoplasias benignas em relação ao grupo controlo, apesar deste aumento não ter sido estatisticamente significativo; nas neoplasias malignas a expressão do gene Acaca foi inferior à expressão no tecido normal. No entanto, a expressão deste gene permitiu verificar uma diferença significativa entre as neoplasias benignas e malignas, podendo ser o decréscimo de expressão deste gene um marco entre o estado benigno e maligno.
Contudo, ao pesquisar os padrões de expressão génica na base de dados “GEO profiles”, em tumores de mama induzidos em rato através de NMU (N-metil-N- nitrosoureia) a expressão do gene Acaca foi mais baixa nas amostras tumorais do que nas amostras normais (GEO profiles, 2005b).
O gene G6pc (glucose-6-fosfatase, sub-unidade catalítica) codifica uma enzima- chave na regulação homeostática dos níveis de glicose no sangue, participa nas vias de gliconeogénese e glicogenólise. Como as células neoplásicas consomem maior quantidade de glicose do que as células normais, o estudo da expressão deste gene nas neoplasias torna-se interessante. No entanto, neste estudo este gene apresentou uma expressão bizarra, uma vez que nos quatro grupos histológicos, a expressão deste gene tanto se encontrou abaixo do normal, com valores de expressão próximos de zero, como apresentou valores de expressão bastante mais elevados que no normal.
Os valores de expressão deste gene apresentaram uma grande amplitude de valores, com excepção do grupo das neoplasias malignas invasivas, mas, estas diferenças não foram significativas não sendo possível diferenciar os tipos histológicos pelos níveis de expressão deste gene.
A expressão do gene G6pc tanto pode estar elevada como ausente, esta variação pode ocorrer de amostras para amostra proveniente do mesmo animal, como pode variar de animal para animal, podendo revelar que a expressão deste gene pode estar dependente das condições fisiológicas do animal e não ser considerado um bom marcador metabólico das neoplasias uma vez que não permite fazer uma distinção entre grupos histológicos. Ao pesquisar os padrões de expressão génica na base de dados “GEO profiles”, pode-se ver que este gene apresenta um comportamento diferente; para tumores de mama de rato induzidas por NMU (N-metil-N-nitrosoureia) a expressão deste gene é superior nos tumores do que no tecido normal (GEO profiles, 2005c).
Como já foi mencionado anteriormente, este tratou-se de um estudo inicial que pode ser futuramente complementado com outras técnicas, como a imuno-histoquímica para analisar os resultados da expressão proteica. Pode também ser utilizado como base para a realização de outros estudos, nomeadamente em amostras humanas, para averiguar se o padrão de expressão é semelhante e se estes três genes podem ser utilizados como marcadores metabólicos.
Os nossos resultados, evidenciam a importância destes procedimentos experimentais na compreensão das alterações metabólicas que ocorrem ao longo da progressão da doença neoplásica e a investigação de novos marcadores de diagnóstico, prognóstico e possíveis alvos terapêuticos. Este trabalho revela a importância da
experimentação animal na compreensão oncobiologia e na sua aplicação em medicina humana.