Os resultados obtidos mostraram a eficácia do método de bombardeamento de calos embriogênicos para a obtenção de plantas transgênicas de C. arabica. A regeneração dos embriões aconteceu de forma lenta, o que é comum na cultura de tecidos do café (TEIXEIRA, J. B. et al., 2004). As plantas crescidas na casa de vegetação se desenvolveram normalmente e não apresentaram alterações fenotípicas. Após dois anos de cultivo, 4 plantas floresceram e 3 produziram frutos normalmente, porém uma não gerou frutos viáveis (Planta “1”). A esterilidade observada nesta planta pode ter sido causada por variação somaclonal ou devido a algum problema relacionado com a inserção dos transgenes. A posição em que o plasmídeo se inseriu no genoma pode ter provocado uma meiose irregular. Alternativamente, a interrupção de algum gene relacionado com a formação de frutos ou sementes pode ter interferido para a esterilidade da planta “1”. Esterilidade causada por procedimentos de transformação genética já foi observada em arroz e soja transgênicos (BHAT, S. R.SRINIVASAN, S., 2002). As duas plantas restantes ainda não alcançaram o estágio de desenvolvimento suficiente para a produção de frutos.
As taxas de germinação das sementes obtidas da geração T1, que foram de 40%, para a planta 2 e de 70% para a planta 4, ocorreram dentro da faixa normal apresentada por plantas de café arabica (VALIO, I. F. M., 1976). Isto indica que a presença do transgene e a expressão do inibidor -AI1 não interferiram na germinação das sementes transgênicas nas plantas avaliadas.
A regeneração dos embriões sob seleção com o antibiótico canamicina gerou 26 plantas, das quais apenas 6 foram consideradas transformadas com o gene para o inibidor -AI1 (Figuras 5 e 6). Esta porcentagem de plantas transgênicas (23,1%) foi maior do que a observada na transformação de C. canephora via bombardeamento, que obteve 12,5% de plantas transformadas (RIBAS, A. F. et al., 2005). No presente trabalho, a integração do gene no genoma das plantas de C. arabica foi confirmada por Southern blot, e este gene foi transferido para a geração seguinte (T1) na descendência de duas plantas avaliadas, como foi visto por PCR (Figuras 5C e 5D).
Todas as plantas da geração T1 foram positivas para os genes -AI1 e nptII (Figura 5). No entanto, a proporção esperada era de 3:1 de plantas positivas e negativas, respectivamente. Esperava-se essa proporção porque C. arabica é uma planta alotetraplóide que apresenta um pareamento regular de cromossomos bivalentes durante a meiose (LASHERMES, P. et al., 2000). Essa diferença da clássica proporção 3:1 pode ter sido obtida ao acaso, pois foram analisados apenas 11 indivíduos da geração T1, sendo 4 descendentes da planta “2” e 7 descendentes da planta “4”. O teste de qui-quadrado (x2) (Ver anexo 5) mostrou que uma descendência assim pode ser observada, ao acaso, entre 50% e 30% para a descendência da planta “2”, e entre 20% e 10% para a descendência da planta “4”. Logo, o desvio da proporção 3:1 é perfeitamente possível, levando-se em consideração o número de indivíduos avaliados.
Três plantas de café que produziram sementes tiveram a expressão do inibidor -AI1 avaliada qualitativamente e quantitativamente por experimentos de SDS-PAGE, Western blot e ELISA. Observando o perfil protéico do extrato total de proteínas das sementes dessa planta, foi possível notar a presença de uma banda com massa molecular similar à apresentada pelo inibidor -AI1 isolado de P. vulgaris, que é de 19 kDa (Figura 7A). A expressão do inibidor -AI1 foi detectada por anticorpos específicos no Western blot (Figura 7B). Neste “blot”, pode-se notar a presença de mais de uma banda correspondente ao inibidor; no entanto, um resultado similar foi observado em plantas de tabaco transformadas com o gene para o inibidor -AI1 (ALTABELIA, T.CHRISPEELS, M. J., 1990). Essas bandas com diferentes massas moleculares correspondendo ao -AI1 estão presentes devido a diferentes níveis de glicosilação que ocorrem durante as modificações pós- traducionais. Alternativamente, essas diferenças de massa molecular podem ter sido geradas por interações iônicas do inibidor no gel com SDS (OBIRO, W. C. et al., 2008). A subunidade do inibidor tem dois sítios de glicosilação que sempre são glicosilados em P. vulgaris (SAWADA, S. et al., 2002). A subunidade também possui dois sítios de glicosilação, mas estes nem sempre são glicosilados nas plantas de feijão (SAWADA, S. et al., 2002). Como as plantas de café são geneticamente distantes do P. vulgaris, não é possível afirmar com precisão, sem uma avaliação experimental, se o -AI1 é glicosilado da mesma forma nas plantas de café transgênicas. Plantas de ervilha transformadas com o -AI1 (SCHROEDER,
H. E. et al., 1995) apresentaram um padrão alterado de glicosilação do inibidor expresso. Essas alterações, além de terem mudado a massa do inibidor, provocaram respostas alérgicas e inflamatórias em ratos alimentados com essas ervilhas (PRESCOTT, V. E. et al., 2005). No entanto, essas alterações imunológicas em ratos só foram provocadas pelas ervilhas transgênicas. Plantas de grão-de-bico expressando o mesmo inibidor não foram capazes de sensibilizar imunologicamente os ratos alimentados (PRESCOTT, V. E. et al., 2005). Consequentemente, apesar das alterações imunológicas provocadas em ratos alimentados com ervilhas--AI1, não se pode afirmar que o mesmo acontecerá com as plantas transgênicas de café.
O direcionamento da expressão do inibidor -AI1 para as sementes de café pelo promotor da fitohemaglutinina é muito importante, pois dificultará que esta planta transgênica atinja algum inseto não alvo, como, por exemplo, abelhas e borboletas polinizadoras. As plantas de C. arabica são capazes de se autofecundar. No entanto, a fecundação cruzada provocada por abelhas pode aumentar entre 15 e 50% a quantidade de café produzida (RICKETTS, T. H. et al., 2004). Esta fecundação cruzada aumenta, também, a qualidade do café produzido, gerando grãos maiores e mais robustos, além de diminuir a proporção de frutos mal formados que contêm apenas uma semente (RICKETTS, T. H. et al., 2004). Logo, o direcionamento da expressão apenas para o tecido atacado pela broca-do-café protegerá os insetos polinizadores da ação do inibidor -AI1. O promotor da fitohemaglutinina, assim como o inibidor -AI1, foi isolado do feijão P. vulgaris e se mostrou específico para sementes, expressando a proteína nos cotilédones em formação, apresentando o mesmo comportamento mesmo após ter sido transferido para plantas de fumo (VOELKER, T. et al., 1987). Sua especificidade foi utilizada para expressar o inibidor -AI1 em plantas transgênicas de ervilha (SCHROEDER, H. E. et al., 1995), grão-de-bico (IGNACIMUTHU, S.PRAKASH, S., 2006) e Vigna unguiculata (SOLLETI, S. K. et al., 2008).
A quantificação do inibidor nas sementes mostrou diferentes níveis de expressão para cada uma das plantas testadas (Figura 8). Vários fatores podem estar contribuindo para gerar esses diferentes níveis de expressão. A posição do transgene no genoma da planta pode interferir nessa expressão, bem como o número de cópias inserido (BHAT, S. R.SRINIVASAN, S., 2002). Alternativamente, apenas diferenças na proporção de sementes positivas e negativas podem ter
gerado esses distintos níveis de expressão. Comparando o nível de expressão da planta 2 (0,29%) com a expressão obtida em outras plantas transgênicas, nota-se que ele foi menor do que o observado em plantas de grão-de-bico (IGNACIMUTHU, S.PRAKASH, S., 2006) e ervilhas (SCHROEDER, H. E. et al., 1995).
O ensaio de atividade mostrou, também, diferentes níveis de inibição da - amilases da broca-do-café (Figura 9). Porém, comparando-se a quantidade de inibidor expresso em cada planta e a taxa de inibição, é possível notar que a inibição in vitro das -amilases da broca-do-café foi proporcional à concentração do inibidor em cada uma das amostras (Figura 10). O nível de inibição apresentado pela planta 2 (88,8%) é muito similar ao alcançado em ensaios in vitro com extratos de P. vulgaris (VALENCIA, A. et al., 2000).