DIVERGÊNCIAS INTRA E INTERESPECIFICAS DE CO

As divergências intraespecíficas e intragenéricas de COI estão entre as métricas mais comuns utilizadas nos estudos de DNA barcoding (Bergsten et al., 2012). Ambas as métricas são usadas para calcular o intervalo do barcode, que reflete diretamente na acurácia do uso das sequências de COI na identificação de espécies (Hebert et al., 2004). Estudos recentes da variação intraespecífica das sequências de barcode dentro e entre espécies proximamente relacionadas indicaram valores de divergências menores que 3% dentro das espécies e maiores que 8% na maioria dos animais estudados (Hebert

et al., 2003AB). No entanto, devido à alta heterogeneidade das taxas de substituição do

mtDNA, não se deve assumir limites universais para essas divergências, principalmente para as divergências intraespecíficas, quando se está interessado em delimitar espécies (Galtier et al., 2009). Dessa forma, o ideal seria investigar a sobreposição dos valores das divergências intra- e interespecíficas encontrados para cada grupo taxonômico para determinar se eles estariam sobrepostos ou não, no último caso, definindo o intervalo do “barcode”.

No presente estudo, indivíduos de Kempnyia e Gripopterygidae apresentaram sobreposição dos valores das divergências intra- e interespecíficas (Figura 13B e 14AB) enquanto indivíduos de Anacroneuria apresentaram um intervalo entre a máxima intraespecífica e mínima interespecífica entre os valores de 0,6 a 0,9% (Figura 13A). O resultado encontrado aqui sugere que não é possível delimitar ou quantificar as espécies de plecópteros do Sudeste Brasileiro utilizando somente os valores de divergências genéticas de COI de indivíduos coletados, sem a delimitação prévia das divergências intraespecíficas com base na identificação morfológica. A sobreposição desses valores de barcode em estudos empíricos de diversos grupos animais é comum (Aliabadian et

al., 2009, Virgilio et al., 2010, Pauls et al., 2010, Romero & Ramirez, 2011) e a não

existência desse intervalo do “barcode” tem sido enfatizada em estudos recentes (Meyer & Paulay, 2005, Meier et al., 2006, Wiemers & Fiedler, 2007, Bergsten et al., 2012). Dessa forma, a existência desse intervalo em estudos prévios e regionais de barcode seria aparentemente um artefato resultante de uma baixa amostragem de indivíduos e limitada amostragem geográfica (DeWalt, 2011).

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Sobreposições entre as divergências intra- e interespecíficas podem ocorrer devido a baixas divergências genéticas entre espécies proximamente relacionadas (Figuras 13B, 13C) ou altas divergências intraespecíficas, ou ambas. No presente estudo foram encontradas baixas divergências genéticas entre espécies proximamente relacionadas de Kempnyia (eg. K. petersorum x K. neotropica) e Gripopterygidae (Gripopteryx e Tupiperla) (Figuras 13B, 13C), além de altas divergências intraespecíficas em espécies de Kempnyia (Figura 14B).

Comparações interespecíficas variando entre 7 e 8% no gênero Kempnyia (Figura 13B) se referem àquelas entre K. petersorum e K. neotropica (Jacobson & Bianchi). Essas duas espécies, juntamente com K. auberti Froehlich, K. ocellata Froehlich, K. sazimai Froehlich, K. tupinamba Froehlich, K. umbrina Froehlich e K.

vanini Froehlich, compartilham um par de regiões contendo espinhos no tubo

membranoso do pênis (Froehlich, 2011B). Algumas dessas espécies são muito similares na morfologia da genitália, sendo distinguidas somente pelo padrão de coloração e tamanho (Froehlich, 1996). Considerando os possíveis polimorfismos de coloração, a baixa divergência interespecífica e a ausência de estudos genéticos mais detalhados com ênfase nesse grupo de espécies, é possível que essas duas linhagens identificadas aqui como distintas com base na morfologia representem na verdade uma mesma espécie.

Entre os gripopterigídeos, comparações interespecíficas entre 3 e 5% (Figura 12C) referem-se àquelas ocorridas nos gêneros Gripopteryx, entre G. pilosa e G. juetah (ENT563*ENT579), e nos gênero Tupiperla, ocorrendo entre T. tessellata e T. umbya (ENT291*ENT598). Entre os Gripopteryx, as espécies comparadas são diferenciadas pelos paraproctos dos machos, finos em G. pilosa e robustos em G. juetah, e pelas ninfas, que possuem protuberâncias no pronoto, como em G. pilosa e com espinhos longos como em G. juetah. Ambas as espécies possuem tamanhos similares (asas anteriores 13 a 17 mm em machos), paraproctos curvados para trás e ninfas com projeção no tergito X, o que de fato as mantém como espécies próximas. Em Tupiperla, entretanto, as espécies possuem diferenças evidentes no formato dos paraproctos, demonstrando que de acordo com a morfologia, são espécies distintas. Em ambos os casos, a inclusão de mais sequências de espécimes, seja da BRM ou de outras localidades, inclusive uma análise separada, poderá mostrar que as divergências

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intraespecíficas dentro de Tupiperla podem ser menores que dentro de espécies de

Gripopteryx.

No presente estudo, as divergências intraespecíficas para 46 espécies de Plecoptera variaram de 0 a 15% (ver Tabelas 6, 7 e 8). A média da maioria das divergências intraespecíficas de mais de 50% das espécies se manteve dentro dos 3%, com divergências maiores que esse valor, encontradas entre todas as sete espécies de

Kempnyia (15,1% em K. colossica), A. debilis (4,6%), Anacroneuria ipiau sp. nov.

(4,1%) e G. reticulata (4,1%). Os valores de divergência intraespecífica encontrados neste estudo para Plecoptera são comparativamente altos quando comparados com outros insetos (Zhou et al., 2007, Hayashi & Sota, 2010, Park et al., 2011, Renaud et

al., 2012). No entanto, divergências intraespecíficas altas entre 4,2% e 8,3% já foram

reportadas por diversos autores para espécies de diferentes famílias de Plecoptera. Fochetti et al. (2011) registraram para os perlodídeos máxima divergência intraespecífica de 8,3% em Besdolus bicolor (Navás) e 7,7% em Perlodes

microcephalus (Pictet). Para os cloroperlídeos, Weiss et al. (2012) encontraram

máximas divergências intraespecíficas de 6,2% em Siphonoperla torrentium (Pictet) e 5,1% em S. hajastanica (Zhiltzova). Mynott et al. (2011) registraram uma divergência intraespecífica em gripopterigídeos de 5,8% em Riekoperla alpina McLellan e 4.2% em

R. karki McLellan, indicando que estes valores altos podem ser relacionados com o

isolamento geográfico de populações ocorrendo em grandes altitudes, que podem representar espécies crípticas.

Os plecópteros estudados aqui, principalmente as espécies de Kempnyia, também estão distribuídas em populações isoladas em áreas montanhosas no Sudeste do Brasil. Espécimes de Kempnyia são em geral coletados em rios de primeira e segunda ordens, sendo mais abundantes em áreas de altitude (eg. K. alterosarum, K. colossica,

K. gracilenta, K. reticulata). Assumindo que essas espécies utilizam hábitats específicos

em áreas montanhosas, seguindo Mynott et al. (2011), os vales em baixas altitudes funcionariam como uma barreira para a dispersão desses insetos, isolando suas populações nessas áreas montanhosas, aumentando a variação intraespecífica.

Autores também têm associado o isolamento de populações às altas divergências intraespecíficas, dada a baixa motilidade dos plecópteros (Boumans & Baumann, 2012;

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Mynott et al., 2011). Assim, para aquelas espécies que não estão restritas às áreas montanhosas, maiores distâncias geográficas entre as localidades poderiam resultar em maiores divergências intraespecíficas entres essas populações (Bergsten et al., 2012). De acordo com essa hipótese, as maiores divergências encontradas dentre os diferentes gêneros estudados, ocorreram entre indivíduos coletados em pontos geograficamente distantes. Na Figura 15 (A-D), os diagramas de caixas mostram a distribuição das divergências K2P intraespecíficas de indivíduos coletados na mesma localidade (I) e indivíduos de localidades distantes mais de 100 Km (II), onde podemos observar o efeito do distanciamento das populações sobre as divergências intraespecíficas. Entre as espécies de Anacroneuria, as maiores divergências encontradas intraespecíficas ocorreram entre indivíduos de A. ipiau sp. nov. separados por 250 km (4,1% entre ENT980*ENT168/346/349/352) e machos identificados de A. debilis separados por 220 km (4,4% entre ENT576*ENT981). Entre os Gripopterigídeos, as maiores divergências foram encontradas entre um macho e uma fêmea de G. reticulata separados por quase 400 km. Em contrapartida, valores baixos (se comparados aos demais espécimes) foram encontrados entre machos de K. petersorum (4,6%, ENT246*ENT243) separados cerca de 700km. O mesmo ocorreu entre uma fêmea de A. cf. minuta e um macho de A.

boraceiensis (3,2%, ENT574*ENT990), separados por mais de 1.000 km.

Por outro lado, outro efeito da escala geográfica seria a diminuição das divergências interespecíficas, especialmente entre espécies próximas (Bergsten et al., 2012). Entre espécies de K. petersorum e K. neotropica, baixas divergências foram encontradas, se levarmos em conta os valores encontrados para Kempnyia. Como já abordado, tais espécies são relacionadas e a inclusão de mais espécimes de K.

neotropica poderá esclarecer se se trata de uma espécie distinta ou mesmo se há

influência da escala geográfica sobre a análise. Essa tendência foi observada entre indivíduos de Kempnyia e Anacroneuria, mas não foi significativa entre os Gripopterygidae.

Os resultados encontrados ainda estão longe de serem os ideais para compreender e resolver os limites entre espécies de Plecoptera na Região Neotropical. Entretanto, trata-se do primeiro passo para iniciar o uso da metodologia molecular para solucionar ou tentar resolver questões ainda não possíveis com a metodologia tradicional. O uso dessa ferramenta para associação de estágios se mostrou efetiva e

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Figura 13. Número de comparações par-a-par das porcentagens das distâncias K2P intraespecíficas (preto) e interespecíficas (cinza) mostrando o barcoding gap para Gripopteryx (A) e Tupiperla (B).

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Figura 24 – Número de comparações par-a-par das porcentagens das distâncias K2P intraespecíficas (preto) e interespecíficas (cinza) mostrando o barcoding gap para Anacroneuria (A) e Kempnyia (B).

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Figura 15. Diagrama de caixas mostrando a distribuição das divergências K2P intraespecíficas de indivíduos coletados na mesma localidade (I) e indivíduos de localidades distantes mais de 100 Km (II). Na figura A, a comparação é feita para todos os gêneros de Plecoptera estudados; em B, a comparação é feita para os Gripopterygidae, em C para Kempnyia e D para Anacroneuria.

poderá ser uma alternativa fácil e efetiva, quando a criação das ninfas não for possível, e uma ferramenta a mais no estudo das relações entre espécies de Plecoptera.

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