6. DNA repetitivo: DNA satélite e elementos transponíveis
O DNA repetitivo são sequências que estão representadas em múltiplas cópias, podendo chegar a milhares de cópias no genoma (MEHROTRA; GOYAL, 2014). A porção do DNA repetitivo em angiospermas pode corresponder até 90% do tamanho do genoma destes organismos (LEITCH et al., 1998). Inicialmente o DNA repetitivo pode ser dividido em duas classes, sequências repetitivas dispersas (elementos tranponíveis) e em tandem (DNA satélite, DNAr 45S e 5S e telômeros), considerando os mecanismos de evolução e distribuição ao longo do genoma para essa classificação (SLAMOVITS; ROSSI, 2002).
O DNA satélite, levando-se em consideração o tamanho do monômero (unidade de repetição) e o seu arranjo no genoma, pode ser classificado em três grupos distintos:
microssatélites (2-5 bp), variando de 10-100 unidades de repetição; minissatélites (6-100 bp), com as unidades de repetição variando de 0,5 a 30 kb; e DNA satélite, com o tamanho do monômero variando entre 150-400 pb na maioria das plantas e animais e as unidades de repetição podendo chegar a 100 Mb (MEHROTRA; GOYAL, 2014).
Os DNAs satélites receberam essa denominação a partir do seu isolamento, que inicialmente era realizado em bandas após o gradiente gerado por centrifugação (TEK et al., 2005). As características principais do DNA satélite são a elevada distribuição em tandem de monômeros e sua localização na heterocromatina (PLOHL, 2010). Os tamanhos dos monômeros de sequências satélites que apresentam um comprimento variável, geralmente entre 150–400 pb, pode estar relacionado com número de pares de base necessários a contornar um nucleossomo. O mapeamento físico do DNA satélite em diversas espécies vegetais demostraram que essas sequências estão geralmente localizadas em regiões heterocromáticas centroméricas ou pericentroméricas. Contudo, a distribuição subtelomérica e intersticial também têm sido relatadas (PLOHL, 2010).
A função do DNA satélite é pouco conhecida, exceto pela participação destas sequências na estruturação e organização cromossômica. A existência de genes ou fatores de transcrição em regiões de DNA satélites é escassa, com pouca ou nenhuma ativação gênica (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Por outro lado, essas regiões são responsáveis pela regulação da transcrição de genes adjacentes a heterocromatina, como observado em Drosophila (ZHIMULEV et al., 1986). O DNA satélite, como unidade repetitiva está associado a diversas funções organizacionais, participando de eventos citológicos, como por exemplo, a
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movimentação cromossômica, condensação centromérica, pareamento, rearranjo e recombinação cromossômica e a interação entre a cromatina e suas proteínas associadas (MEHROTRA; GOYAL, 2014).
Os elementos tranponíves são uma classe de DNA repetitivo com a característica única de movimentação genômica, podendo influenciar a expressão gênica e a expressão de determinadas características fenotípicas. O início das pesquisas com os elementos de transposição se deu na década de 40 por Bárbara McClintock e seus trabalhos com milhos, demostrando que a estrutura genética não é estática, mas susceptível a modificações não necessariamente relacionadas a mutações, quebrando assim um dogma da biologia na época (McCLINTOCK, 1956). No entanto, apenas em 1970 com a descoberta que existiam elementos capazes de remover-se e inserir-se em outros locais no genoma de bactérias e moscas das frutas causando alterações, foi possível identificar os elementos transponíveis como os maiores constituintes dos genomas (BIÉMONT; VIEIRA, 2006) Apesar dos efeitos deletérios da inserção de elementos de transposição em sequências codificantes, esses elementos móveis são responsáveis pela regulação gênica em resposta ao ambiente e a fatores epigenéticos, particularmente em função a estresses ambientais sendo de interesse do melhoramento genético (GRANDBASTIEN et al., 2005; SLOTKIN; MARTIENSSEN, 2007).
Os elementos tranponíveis são classificados em duas classes, quanto ao mecanismo de transposição (enzimologia), com a presença ou ausência de um RNA intermediário no processo de transposição. Os elementos tranponíveis da classe I utilizam um RNA intermediário no processo de tranposição, sendo conhecidos como retroelementos ou retrotransposons, e os da classe II, em que o processo de transposição ocorre na forma de DNA, sendo conhecidos como transposons de DNA (WICKER et al., 2007). Nos elementos da classe I, em que a tranposição é feita pela enzima trancriptase reversa, o mecanismo de diversidade e variabilidade dos elementos transponíveis, modo de inserção, organização e enzimologia, as classes de elementos tranponíveis podem ser classificadas em subclasse,
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ordem, superfamília, família e subfamília (WICKER et al., 2007). A primeira subdivisão dos retrotransposons da classe I é em relação à presença de LTRs (Ex.: Ty1-Copia e Ty3-Gypsy) e os retrotransposons sem LTRs (Ex.: LINEs e SINEs). Em plantas, os retrotransposons das superfamílias Copia e Gypsy são os mais abundantes e diversificados, representando a maior parte do DNA repetitivo disperso nos genomas (MARCO; MARIN, 2005; WICKER, 2007;
KEJNOVSKY et al., 2012)
Aspectos genômicos-evolutivos são os principais responsáveis pelo acúmulo de sequências repetitivas em plantas superiores. O acúmulo destas sequências durante o processo evolutivo das angiospermas é fato constatado pelo pequeno conteúdo genômico observado em plantas ancestrais em comparação com as espécies atuais, o que sugere o acúmulo e aumento do genoma ao longo de toda história evolutiva (MEHROTRA; GOYAL, 2014).
As variações relacionadas à organização genômica, tipo de sequência de nucleotídeos e localização cromossômica do DNA repetitivo entre os taxa de um determinado gênero são importantes para a compreenção dos eventos evolutivos que representam as distâncias filogenéticas entre as espécies, sendo desta forma, fatores relevantes no estudo genômico-comparativo e na sintenia e coliearidade entre espécies (HAN et al., 2009; KOO et al., 2010;
ZHANG et al., 2012; MEHROTRA; GOYAL, 2014). As modificações relacionadas ao DNA repetitivo ocorrem rapidamente em monômeros, os quais são duplicados com o passar do tempo evolutivo, sendo essas alterações específicas para uma espécie ou um grupo taxonômico (KOO et al., 2010). Por outro lado, famílias de DNA satélite se mostram conservadas em alguns gêneros (ANAMTHAWAT-JÓNSSON; HESLOP-HARRISON, 1992). As sequências repetitivas em tandem se originam por mutação de novo e recombinações anormais resultando em duplicações de blocos de DNA repetitivo. Neste caso, as recombinações desiguais são consideradas o mecanismo inicial da duplicação/multiplicação do DNA satélite. De modo geral, após a amplificação de sumarizadas em projetos visando o estudo genômico de alta-resolução, limitando as inferências em torno da participação e organização da heterocromatina na composição do
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cariótipo e o estabelecimento de mapas físicos com a inclusão de informações referentes ao DNA repetitivo (PLOHL, 2010). Antes do uso das ferramentas de bioinformática que atualmente estão disponíveis, a maior limitação da inclusão dos dados obtidos de sequenciamento genômico era a identificação do DNA satélite pela presença de monômeros em tandem de baixa variabilidade, dificultando o alinhamento e a obtenção de longos contigs para a avaliação e mapeamento (PLOHL, 2010). No entanto, o sequenciamento do DNA satélite contribuiu para o estudo de genes de alguns organismos (NAKAGI et al., 2004;
HOSKINS et al., 2007). A atual disponibilidade de softwares e algoritmos específicos para a análise do DNA repetitivo (NOVÁK et al., 2013), plataformas de análise e de servidores de informação genômica (GOECKS et al., 2010) e bancos de dados de DNA repetitivo, elementos transponíveis (GONZÁLEZ; DEYHOLOS, 2012) em espécies importantes, como Pisum sativum L., Glycine max L. (NOVÁK et al., 2010), Linum usitatissimun L.
(GONZÁLEZ; DEYHOLOS, 2012), Solanum tuberosum L. (TORRES et al., 2011) e Olea europeae L. (BARGHINI et al., 2014). O sequenciamento de baixa cobertura genômica tem sido uma excelente estratégia para a identificação de sequências repetitivas. Desta forma, a conveniência da utilização de pouca informação de sequenciamento torna a análise bioinformática menos trabalhosa e demorada. Vários estudos já utilizaram o sequenciamento genômico de baixa cobertura para a identificação de DNA repetitivo, satélites e elementos transponíveis (SVEINSSON et al., 2013; BARGHINI et al., 2014).