PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
ANÁLISES GENÔMICAS (GISH) E CITOGENÔMICAS COMPARATIVAS EM ESPÉCIES DO GÊNERO Passiflora L.
GONÇALO SANTOS DA SILVA
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL
Setembro de 2017
ANÁLISES GENÔMICAS (GISH) E CITOGENÔMICAS COMPARATIVAS EM ESPÉCIES DO GÊNERO Passiflora L.
Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de doutor em Genética e Biologia Molecular.
Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular.
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL Setembro de 2017
S586 Silva, Gonçalo Santos da.
Análises genômicas (GISH) e citogenômicas comparativas em espécies do gênero Passiflora L. / Gonçalo Santos da Silva. – Ilhéus, BA: UESC, 2017.
xi, 105 f. : il.
Orientadora: Margarete Magalhães de Souza.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de
Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Gené- tica e Biologia Molecular.
Inclui referências.
1. DNA. 2. Mapeamento cromossômico. 3. Gené- tica vegetal. I. Título.
CDD 572.86
ANÁLISES GENÔMICAS (GISH) E CITOGENÔMICAS COMPARATIVAS EM ESPÉCIES DO GÊNERO Passiflora L.
Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de doutor em Genética e Biologia Molecular.
Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular.
APROVADA: 29 de setembro de 2017
Profa. Dra. Eliana Regina Forni Martins Profa. Dra. Fernanda Amato Gaiotto (UNICAMP) (UESC)
Profa. Dra. Fátima Cerqueira Alvim Profa. Dra. Patrícia Nayara Caldas S. Rocha (UESC) (PMI)
Profa. Dra. Margarete Magalhães de Souza (UESC – Orientadora)
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Raimundo e Teresinha, por todo o amor que existe entre nós.
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AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo dom da vida.
Aos meus pais Raimundo e Teresinha, por todo amor, apoio e incentivo durante a minha vida acadêmica.
À profª. Drª. Margarete Magalhães de Souza, pela orientação, dedicação, apoio no desenvolvimento deste trabalho e pelos valiosos ensinametos transmitidos.
Às Profª. Drª. Fabienne Micheli e Ioná Araujo pela coorientação e suporte durante o doutorado.
À Cláusio, pela amizade, pelos conselhos e pela disponibilidade em me auxiliar durante o mestrado e doutorado. Um exemplo que levarei para a minha vida profissional!
À Vanessa, por ter se aventurado comigo no mundo do DNA repetitivo. Tivemos uma longa caminhada!
À Drª. Sarah Gomes de Oliveira, pelo auxílio com o RepeatExplorer.
Aos amigos que o LAMEP me proporcionou (Vivi, Ritinha, Jona, Ritão, Manu, Pedro, Jôsie, Analu, Matu e Aline), com o apoio de vocês essa caminhada se tornou mais fácil.
À Dani, pela amizade que existe entre nós e por ter sempre me proporcionado momentos felizes ao longo dessa caminhada.
Aos amigos, Thay, Pati e Joedson pela amizade que tornou os meus dias na UESC mais felizes.
Aos amigos Jonson e Robson, pela amizade e companheirismo.
Aos amigos do Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia molecular, pela amizade adiquirida ao longo desses anos.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia molecular, Fábricia, Mara e Kátia pela total disponibilidade em resolver as questões burocráticas.
Ao técnico de campo Roberto, por toda ajuda na casa de vegetação.
À toda minha família, por sempre estarem ao meu lado.
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À Universidade Estadual de Santa Cruz, em especial ao Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), pela concessão da bolsa de estudos.
Muito Obrigado!
v
ÍNDICE
EXTRATO ... viii
ABSTRACT ... x
INTRODUÇÃO ... 1
REVISÃO DE LITERATURA ... 3
1. Família Passifloraceae e gênero Passiflora ………...………... 3
2. Filogenia molecular do gênero Passiflora ... 5
3. Citogenética e citogenômica no gênero Passiflora ... 7
4. Hibridação Genomica In Situ: origem e evolução de planta ...……….. 9
5. Hibridação Genomica In Situ em Passiflora …...………...……… 11
6. DNA repetitivo: DNA satélite e elementos transponíveis ………...…. 12
7. DNA ribossomal 45S (DNAr 45S) ... 15
CAPÍTULO 1: Relações genômicas entre Passiflora edulis f. flavicarpa e espécies próximas (subgêneros Decaloba e Passiflora) ... 17
Resumo ... 17
Abstract ... 18
1. Introdução ... 19
2. Material e Métodos ... 21
2.1 Material vegetal ... 21
2.2 Preparo de lâminas ... 23
2.3 Extração do DNA e preparo da sonda... 23
2.4 Hibridação Genomica In Situ (GISH) ... 24
2.5 Fotodocumentação ... 25
3.Resultados ... 25
4. Discussão ... 29
5. Conclusões ... 32
6. Agradecimentos ... 32
7. Referências ... 34
CAPÍTULO 2: Low-coverage genome sequencing to identify 45S rDNA in Passiflora L. and its chromosomal localization in plants ... 39
Abstract ... 39
vi
1. Introduction ... 40
2. Materials and Methods ... 42
2.1 Plant material ... 42
2.2 Extraction of genomic DNA and Next Generation Sequencing (NGS) ... 42
2.3 Identification of the 45S rDNA sequences and bioinformatics analysis ... 43
2.4 26S rDNA amplification ... 44
2.5 Slide preparation ... 44
2.6 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) ... 45
2.7 Quantification of GC content and double staining with fluorochromes CMA3 and DAPI ………..…….. 46
2.8 Image analysis ... 46
3. Results ... 47
4. Discussion ... 52
5. Conclusions ... 56
Supplementary Materials ... 57
Acknowledgments ... 57
Author Contributions ... 57
Conflicts of Interest ... 57
References ... 57
CAPÍTULO 3 Caracterização citogenômica do DNA repetitivo e mapeamento cromossômico comparativo em Passiflora L. usando dados de sequenciamento de baixa cobertura ... 62
Resumo ... 62
Abstract ... 63
1. Introdução ... 64
2. Material e Métodos ... 65
2.1 Material vegetal ... 65
2.2 Extração de DNA genômico e sequenciamento de nova geração ... 65
2.3 Identificação do DNA repetitivo e anotação ... 66
2.4 Preparo de sonda ... 67
2.5 Preparo de lâminas ... 69
2.6 Hibridação in situ Fluorescente ... 69
2.7 Análise de imagem ... 70
vii
3. Resultados ... 71
4. Discussão ... 82
5. Conclusões ... 85
6. Agradecimentos ... 86
7. Referências ... 87
CONCLUSÕES GERAIS ... 94
REFERÊNCIAS COMPLEMENTAS ... 96
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EXTRATO
SILVA, Gonçalo Santos da. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, setembro de 2017.
Análises genômicas (GISH) e citogenômicas comparativas em espécies do gênero Passiflora L.. Orientadora: Margarete Magalhães de Souza. Coorientadoras: Fabienne Micheli; Ioná Santos Araújo.
O gênero Passiflora compreende espécies de relevância econômica, sendo utilizadas para diversos fins, entre eles, produção de frutos, culinária, ornamentação de interiores e exteriores, e uso medicinal. No entanto, no gênero Passiflora as análises citogenéticas e citogenômicas ainda são muito incipientes. Nesse âmbito, o conhecimento da estrutura e organização citológica do genoma, bem como a localização cromossômica de sequências de interesse possibilitará obter avanços importantes para o estudo das relações entre as espécies e na seleção de plantas para o melhoramento. Esse trabalho objetivou investigar a origem evolutiva de P. edulis f. flavicarpa e as relaçãoes genômicas entre as espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa bem como identificar, caracterizar e mapear o DNA repetitivo (DNA ribossomal, DNA satélite e elementos tranponíveis) em espécies de Passiflora. No capítulo 1: A origem evolutiva de P. edulis f. flavicarpa e as relaçãoes genômicas entre diversas espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f.
flavicarpa foi investigada. Para o preparo de lâminas, ápices de raízes das espécies foram coletados e pré-tratados com 8-Hidroxiquinolina (8-HQ) e as lâminas foram preparadas pela técnica de esmagamento e mantidas a -20 ºC até a aplicação da Hibridação Genômica In Situ (GISH). Para a investigação da origem de P. edulis f. flavicarpa e análise das relações das espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa por meio da GISH, os DNAs genômicos das espécies P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P.
micropetala, P. morifolia, P. rubra, P. suberosa, P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P.
edulis f. edulis, P. edulis f. flavicarpa, P. ligularis, P. nitida, P. vitifolia, P. foetida e P.sublanceola foram extraidos, e utilizados no preparo de sondas para subsequente mapeamento cromossômico em P. edulis f. flavicarpa. Não foram verificados indícios de que P. edulis f. flavicarpa originou-se por hibridação e foi constatado que as espécies do subgênero Passiflora são muito próximas de P. edulis f. flavicarpa, enquanto que as espécies do subgênero Decaloba possui uma relação muito distante, devido ao baixo nível de DNA compartilhado. No capítulo 2: Foi realizada a identificação do DNAr 45S a partir de dados de
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sequenciamento de baixa cobertura pelo RepeatExplorer em P. alata, P. cincinnata e P. edulis e posterior mapeamento cromossômico através da Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) em espécies de Passiflora e a hibridação heterologa em Cucumis melo e Citrus Sunki.
Paralelamente foi realizada a quantificação do conteúdo GC nos genes ribossomais e bandamento CMA3/DAPI para verificar a relação das regiões ricas em GC com os genes ribossomais 45S. O isolamento do gene ribossomal 26S permitiu a localização cromossômica do locus de DNAr 45S nas espécies de Passiflora, além da localização desse sítio em outras espécies de angiospermas, mostrando que essa nova sonda obtida a partir do isolamento do gene ribossomal 26S pode ser utilizada com sucesso em espécies de plantas. A quantificação do conteúdo GC permitiu evidenciar que os genes ribossomais são as regiões mais ricas em GC (52-63%) no genoma das espécies de Passiflora, quando comparada com o conteúdo de GC dos retrotransposons (38-40%) e da porção gênica (45%). Sendo observado que as bandas CMA3+ estão restritas aos locus de DNAr 45S. No capítulo 3: A identificação e caracterização do DNA repetitivo foi realizada no RepeatExplorer utilizando dados de sequenciamento de baixa cobertura de P. alata, P. cincinnata e P. edulis e posterior mapeamento cromossômico.
Foi observado, que a maior proporção do genoma dessas espécies é composto de DNA repetitivo, 74,70% do genoma de P. alata, 66,86% do genoma de P. edulis e 62,24% do genoma de P. cincinnata, sendo que os retrotransposons LTR (Gypsy e Copia) compõem a maior proporção e o DNA satélite representa apenas uma pequena proporção do genoma. O mapeamento cromossômico dos retrotransposons LTR mostrou que esses elementos repetitivos possuem uma distribuição dispersa ao longo dos cromossomos, enquanto o DNA satélite foi mapeado na região subtelomérica. Essa distribuição sugere que esses elementos repetitivos desempenham papéis importantes na estrutura e organização do genoma das espécies do gênero Passiflora. Além disso, o fato dessas espécies possuírem o mesmo número cromossômico (2n = 18) e tamanho dos genomas diferentes evidenciou que o aumento do tamanho do genoma está relacionado com o ganho de DNA repetitivo.
Palavras-chave: DNA repetitivo, FISH, Mapeamento cromossômico, RepeatExplorer
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ABSTRACT
SILVA, Gonçalo Santos da. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, setembro de 2017.
Genomic (GISH) and cytogenomic comparative analyzes in species of the genus Passiflora L.. Advisor: Margarete Magalhães de Souza. Co-Advisor: Fabienne Micheli; Ioná Santos Araújo.
The genus Passiflora comprises species of economic relevance, being used for various purposes, among them, fruit production, culinary, interior and exterior ornamentation, and medicinal use. However, in the genus Passiflora the cytogenetic and cytogenetic analyzes are still very incipient. In this context, the knowledge of the structure and cytological organization of the genome, as well as the chromosomal localization of sequences of interest, will make it possible to obtain important advances in the study of the relations between the species and in the selection of plants for breeding. This work aimed to investigate the evolutionary origin of P. edulis f. flavicarpa and the genomic relationships between the species of the subgenera Decaloba and Passiflora with P. edulis f. flavicarpa as well as to identify, characterize and map repetitive DNA (ribosomal DNA, satellite DNA and transposable elements) in Passiflora species. In chapter 1: The evolutionary origin of P. edulis f. flavicarpa and the genomic relationships among several species of the Decaloba and Passiflora subgenera with P. edulis f. flavicarpa was investigated. For slide preparation, root apices of the species were collected and pretreated with 8-Hydroxyquinoline and the slides were prepared by the crushing technique and maintained at -20 ºC until the application of Genomic In Situ Hybridization (GISH). For the investigation of the origin of P. edulis f. flavicarpa and analysis of the relationships of the species of the Decaloba and Passiflora subgenera with P. edulis f.
flavicarpa through GISH, the genomic DNAs of the species P. biflora, P. capsularis, P.
cervii, P. coriacea, P. micropetala, P. morifolia, P. rubra, P. suberosa, P. alata, P.
cincinnata, P. coccinea, P. edulis f. edulis, P. edulis f. flavicarpa, P. ligularis, P. nitida, P.
vitifolia, P. foetida and P.sublanceola were extracted and used in the preparation of probes for subsequent chromosome mapping in P. edulis f. flavicarpa. There was no evidence that P.
edulis f. flavicarpa originated by hybridization and it was found that the species of the Passiflora subgenus are very close to P. edulis f. flavicarpa, whereas the species of the Decaloba subgenus has a very distant relation, due to the low level of shared DNA. In
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Chapter 2: Identification of the 45S rDNA was performed from low coverage genome sequencing data in P. alata, P. cincinnata and P. edulis, and later chromosome mapping by In Situ Fluorescent Hybridization (FISH) in species of Passiflora and heterologous hybridization in Cucumis melo and Citrus Sunki. In parallel, quantification of GC content in ribosomal genes and CMA3/DAPI banding was performed to verify the relationship of GC rich regions with 45S ribosomal genes. Isolation of the 26S ribosomal gene allowed the chromosomal localization of the 45S rDNA locus in Passiflora species, as well as the localization of this site in other angiosperm species, showing that this new probe obtained from the isolation of the 26S ribosomal gene can be successfully used in plant species. The quantification of the GC content showed that ribosomal genes are the richest regions in GC (52-63%) in the genome of Passiflora species, when compared to the GC content of the retrotransposons (38- 40%) and the gene portion (45%). It is observed that the CMA3+
bands are restricted to the 45S rDNA locus. In Chapter 3: Identification and characterization of repetitive DNA was performed in the RepeatExplorer using low coverage genome sequencing data of P. alata, P.
cincinnata and P. edulis and subsequent chromosome mapping. It was observed that the highest proportion of the genome of these species is composed of repetitive DNA, 74.70% of the genome of P. alata, 66.86% of the genome of P. edulis and 62.24% of the genome of P.
cincinnata, with LTR retrotransposons (Gypsy and Copia) making up the largest proportion and satellite DNA representing only a small proportion of the genome. The chromosomal mapping of the LTR retrotransposons showed that these repetitive elements have a dispersed distribution along the chromosomes, while the satellite DNA was mapped in the subtelomeric region. This distribution suggests that these repetitive elements play important roles in the structure and organization of the genome of the Passiflora species. In addition, the fact that these species have the same chromosomal number (2n = 18) and different genome size, was evidenced that the increase of the genome size is related to the gain of repetitive DNA.
Key-words: Repetitive DNA, FISH, Chromosome mapping, RepeatExplorer
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INTRODUÇÃO
O gênero Passiflora compreende espécies de grande importância ecológica e econômica, com vários representantes endêmicos da flora brasileira (BERNACCI et al., 2003). A importância econômica se estende desde a utilização direta de espécies, como P.
edulis Sims (maracujá-azedo), P. alata Curtis (maracujá-doce) e P. cincinnata Mast (maracujá do mato) para a indústria alimentícia e consumo in natura até a utilização de diversas espécies silvestres como plantas ornamentais. Entre as espécies de maior interesse econômico destaca-se P. edulis, que ocupa mais de 95% da área plantada no Brasil, que é destinada ao mercado de frutas e à indústria de sucos (MELETTI, 2011). Esses fatos são relevantes para o agronegócio e agricultura familiar no Brasil, sendo um forte gerador de renda para o país (MANICA, 2005; IBGE, 2015). Embora no Brasil o maracujá seja conhecido principalmente pelo consumo do fruto, grande parte do germoplasma silvestre pode ser utilizado na ornamentação, como é feito na Europa (VANDERPLANK, 2000; ABREU et al., 2009). O marucujá também pode ser utilizado como matéria prima para a indústria farmacêutica, devido à presença de um composto denominado passiflorina, que funciona como um calmante natural (FAUSTINO et al., 2010).
Os maracujazeiros são considerados ornamentais devido à sua beleza única, com flores exóticas e folhagens diversificadas, e desde sua introdução no velho mundo, em 1625, as passifloras têm sido usadas para decorar estufas e jardins europeus e americanos (ABREU et al., 2009). Muitas espécies são utilizadas para ornamentação de pérgulas, muros, dentre outros (VANDERPLANK, 2000).
Diversos estudos já foram realizados no sentido do conhecimento da diversidade cariotípica e genética de espécies silvestres e cultivadas do gênero Passiflora (MELO et al., 2001; SILVA et al., 2014; MELO et al., 2017). Contudo, apesar das contribuições que as análises cariotípicas promoveram para a compreensão da diversidade no gênero, pouco se conhece sobre a estrutura genômica e distribuição da heterocromatina. A carência de dados relacionados à organização genômica e estrutural da cromatina limitam a localização de genes, contigs e sequências repetitivas, que podem ser aplicáveis à análise sintênica e na colinearidade entre genomas de espécies do mesmo gênero. Tais abordagens têm sido realizadas em espécies com grande importância econômica, como por exemplo, Solanum
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lycopersicum L. (tomate) e S. tuberosum L. (batata) promovendo a localização física de sequências e a comparação da sua distribuição entre mapas físicos (TANG et al., 2008).
Em P. edulis, um estudo recente analisou 10.000 sequências inseridas em BACs (Bacterial Artificial Chromossome), sendo observado que 19,6% dessas sequências correspondem a DNA repetitivo (SANTOS et al., 2014). Diante disso, uma caracterização global do DNA repetitivo de espécies pertencentes ao gênero Passiflora, será de grande utilidade para o entendimento da estrutura e organização do genoma dessas espécies, que associada ao mapeamento cromossômico permitirá obervar a distribuição do DNA repetitivo ao longo do genoma. Além disso, essas informações poderão ser úteis ao melhoramento de passifloras, auxiliando na seleção de genótipos de interesse.
Em plantas com genomas grandes, as sequências moderadamente e altamente repetitivas podem chegar a 90% (LEITCH et al., 1998). Atualmente, a citogenética associada à genômica e algumas ferramentas de bioinformática têm permitido a investigação de sequências repetitivas em genomas de eucariotos (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Várias ferramentas de bioinformática têm sido desenvolvidas para análises de sequências repetitivas.
Recentemente, foi desenvolvida uma pipeline, denominada RepeatExplorer, que caracteriza elementos repetitivos e identifica sequências moderada e altamente repetitivas em genomas de plantas superiores (NOVÁK et al., 2013).
Tendo em vista a necessidade de conhecer a estrutura e organização dos genomas de espécies pertencentes ao gênero Passiflora, esse estudo objetivou elucidar a origem evolutiva de P. edulis f. flavicarpa e as relaçãoes genômicas entre as espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa, bem como identificar, caracterizar e mapear o DNA repetitivo (DNA ribossomal, DNA satélite e elementos tranponíveis) em espécies de Passiflora. Nesse sentido, esse estudo permitiu uma melhor compreenção sobre a estrutura e organização do genoma em espécies do gênero Passiflora, possibilitando a obtenção de avanços na cultura do maracujá.
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REVISÃO DE LITERATURA
1. Família Passifloraceae e gênero Passiflora
Pertencente à ordem Malpighiales, a família Passifloraceae é composta por cerca de 650 espécies, distribuídas em 17 gêneros (BERNACCI et al., 2013a). As espécies desta família são, em geral, lianas com gavinhas, que habitam os trópicos e subtrópicos, no entanto algumas espécies podem ser arbustos ou árvores (BERNACCI et al., 2013a). Quatro dos 17 gêneros, aceitos atualmente para a família Passifloraceae, ocorrem no Brasil: Ancistrothrysus Harms, Mitostemma Mast., Dilkea Mast. e Passiflora L, com 149 espécies (BERNACCI et al., 2013b). No entanto, com a descoberta de novas espécies, esse número continua crescendo, tais como Passiflora kikiana Cervi & Linsingen (CERVI; LINSINGEN, 2010), P. cristalina Vanderpl. & Zappi (VANDERPLANK; ZAPPI, 2011) P. cacao Bernacci & M. M. Souza (BERNACCI; SOUZA, 2012) e P. pottiae Cervi & Imig (CERVI; IMIG, 2013).
As principais características das espécies que compõem a família Passifloraceae, são a presença de gavinhas axilares utilizadas para sustentação em outras árvores, glândulas nos pecíolos e na superfície foliar, flores que apresentam cores variadas, com pétalas e sépalas em número de cinco, androceu com cinco estames e gineceu composto de três estiletes, folhas alternas simples, sementes ariladas. Além dessas características todas as espécies dessa família apresentam flores com uma corona, que é a caracteristica morfológica mais marcante na família (KILLIP, 1938). A maioria das espécies são auto-incompatíveis (AKAMINE;
GIROLAMI, 1957) e dependem da ação de polinizadores, entre eles as mamangavas (Xylocopa spp.), que são os agentes polinizadores mais eficientes para as passifloráceas (RUGGIERO, 1980), beija-flores (Ensifera ensifera) (LINDBERG; OLESEN, 2001), morcegos, vespas e abelhas (BERNACCI et al., 2013a). No entanto, a abelha africana Apis mellifera prejudica a polinização, sendo considerada uma praga em lavouras de maracujazeiros (P. edulis f. edulis e P. edulis f. flavicarpa), uma vez que, devido ao seu pequeno porte não consegue realizar uma polização eficiente, danificando a flor na busca pelo néctar, causando prejuízos nas lavouras de maracujá (BRUCKNER et al., 2005).
O gênero Passiflora, com 525 espécies, é o maior dentro da família Passifloraceae (CERVI; IMIG, 2013), sendo o Brasil, um importante centro de diversidade do grupo, onde são encontradas 137 espécies (BERNACCI et al., 2013b). Na Bahia, o gênero Passiflora é
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representado por cerca de 31 espécies, com uma ampla distribuição, ocorrendo praticamente em todos os biomas do Estado, porém, a Chapada Diamantina e a Floresta Atlântica do Sul do Estado são consideradas os principais centros de diversidade (NUNES; QUEIROZ, 2006).
Dentro do gênero Passiflora, existe um grande interesse econômico/agronômico por várias espécies, principalmente para o mercado de frutas. Sendo as espécies P. alata (maracujá-doce), P. cincinnata (maracujá do mato) e P. edulis (maracujá-azedo) as mais importantes no Brasil e a espécie P. ligularis (granadilla) a mais importante na Colômbia.
Esses dois países são os mais tradicionais no cultivo do maracujá (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016). Para fins medicinais, as espécies mais utilizadas são P. caerulea e P. incarnata, uma vez que algumas espécies possuem uma alta concentração de um composto denominado passiflorina, um calmante natural (ULMER; MACDOUGAL, 2004). As espécies de maracujazeiro também podem ser utilizadas para a produção de cosméticos (cremes, óleos e perfumes) (PENHA, 2012) e para o mercado de plantas ornamentais, devido à beleza única de suas flores (ABREU et al., 2009).
No Brasil, a espécie P. edulis ocupa a primeira posição na produção de maracujá, sendo essa frutífera uma importante geradora de renda para o país. Os dados do ano de 2015 mostraram que a produção de maracujá foi de 50.837 ha de área colhida e 694.539 t de produção, com um rendimento de 13,66 t/há. A maior parte da produção de maracujá ocorre na região Nordeste (64.9% da produção), sendo o Estado da Bahia o maior produtor da região Nordeste (42.81% da produção) (IBGE - Produção Agrícola Municipal, 2015). Essa produção coloca o Brasil como maior produtor e consumidor mundial de maracujá, uma vez que a exportação desse fruto para os países europeus e latino-americanos ainda é incipiente (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016).
Apesar da grande importância econômica e ecológica do maracujá para o Brasil, no último levantamento sobre espécies ameaçadas da flora do país, foram incluídas seis espécies de maracujá em risco de extinção: P. hatschbachii Cervi, P. imbeana Sacco, P. ischnoclada Harms, P. margaritae Sacco, P. urubiciencis Cervi e P. setulosa Killip (BERNACCI et al., 2013a). Essas espécies estão em risco de extinção devido aos avanços das fronteiras agrícolas, principalmente na região Centro-Norte (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016). O processo de urbanização e expanção da agricultura tem sido um grande problema para muitas espécies de plantas, reduzindo a diversidade genética e o tamanho populacional (FERREIRA, 2005). A consevação do germoplasma ex situ tem sido uma solução para manter conservardos os
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recursos genéticos e permitir o acesso futuro a essas espécies silvestres (ABREU et al., 2009).
No Brasil existem diversas instituições científicas e de pesquisa que mantem bancos de germoplasmas de maracujá, sendo elas: EMBRAPA Cerrados, EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, EMBRAPA Semi-Árido, Instituto Agronômico de Campinas (IAC), Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Instituto Agrnômico do Paraná (IAPAR), Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catariana, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Universidade do Estado do Mato Grosso (UEMG) e Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016).
2. Filogenia molecular do gênero Passiflora
O gênero Passiflora foi estabelecido por Linnaeus em 1753, em que foram descritas 22 espécies e a primeira classificação infragenérica foi feita por Killip (1938), em que 355 espécies foram organizadas em 22 subgêneros. Posterior a essa classificação foi adicionado um novo subgênero (ESCOBAR, 1989) e mais recentemente uma nova classificação infragenérica, baseada em caracteres morfológicos e ecológicos, foi proposta, com apenas quatro subgêneros: Astrophea (DC.) Mast. (57 espécies), Decaloba (DC.) Rchb. (220 espécies), Deidamioides (Harms) Killip (13 espécies), Passiflora (240 espécies) (FEUILLET;
MACDOUGAL, 2004).
As análises de filogenia molecular, baseadas em marcadores plastidiais e nucleares, estão mais de acordo com as últimas proposições morfológicas, corroborando total ou parcialmente essa última classificação infragenérica (MUSCHNER et al., 2003;
YOUCKTENG; NADOT, 2004; HANSEN et al., 2006; MUSCHNER et al., 2012). A primeira filogenia molecular em Passiflora utilizou três marcadores moleculares: os espaçadores internos transcritos do DNA ribossomal (ITS1 e ITS2), a região espaçadora plastidial entre os genes de RNA tranportador de leucina e fenilalanina (trnL e trnF) e o gene plastidial que codifica a pequena proteína ribossomal 4 (rps4). Nessa análise foram utilizadas 61 espécies, representando 11 dos 23 subgêneros propostos por Killip (1938) e Escobar (1989). Essa filogenia suportou fortemente três (Astrophea, Decaloba e Passiflora) dos quatro subgêneros propostos por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, a posição de subgênero Deidamioides permaneceu indefinida (MUSCHNER et al., 2003).
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Em outra análise de filogenia molecular foi utilizado o gene nuclear que codifica a glutamina sintase expressa no cloroplasto (ncpGS) em 90 espécies, reconhecendo oito subgêneros em Passiflora, denominados Astrophea, Deidamioides, Dysosmia, Granadilla (=Passiflora), Plectostemma (=Decaloba) Polyanthea, Tetrapathea e Tryphostemmatoides.
Dos oito subgêneros reconhecidos nessa filogenia, quatro estão de acordo com a classificação proposta por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, os resultados sugeriram a manutenção de quatro subgêneros adicionais propostos por Killip (1938). Nesse trabalho foi observada uma forte relação entre a posição filogenética de diferentes clados e o número cromossômico.
O clado 1 (subgênero Astrophea), com n = 12; o clado 2 (subgênero Decaloba), com n = 6 e o clado 3 (subgênero Passiflora) com n = 9. O subgênero Dysosmia, com um número cromossômico variável, n = 9-11, foi considerado como um subgênero separado proximamente relacionado ao subgênero Passiflora (YOUCKTENG; NADOT, 2004).
Hansen et al. (2006) analisaram a relação filogenética utilizando dois marcadores cloroplastídicos: gene rpoC1 e os genes de RNA tranportador de leucina e treonina (trnL e trnT). Nessa análise foram utilizadas 61 espécies, representado os 22 subgêneros propostos por Killip (1938) e os quatro subgêneros propostos por Feuillet e MacDougal (2004). Os resultados dessa análise filogenética suportaram a redução dos 22 subgêneros de Killip (1938) para os quatro subgêneros de Feuillet e MacDougal (2004), suportando fortemente a monofilia desses quatro subgêneros. Além disso, foi observado que a evolução no gênero Passiflora está relacionada com o número cromossômico, o subgênero Passiflora com o número ancestral n = 9; o subgênero Decaloba com o número ancestral n = 6 e os subgêneros Astrophea e Deidamioides com n = 12.
Na última e mais abrangente análise filogenética em Passiflora, foram investigadas 106 espécies, representado os quatro subgêneros de Feuillet e MacDougal (2004). Foram analisados oito marcadores moleculares: os genes rbcL e rps4, o intron do trnL, os espaços intergênicos dos genes trnL e trnF do genoma plastidial, os introns b/c do gene nad1 e os intros d/e nad5 do genoma mitocrondral e uma porção do gene de DNAr 26S. Nessa análise, o gênero Passiflora foi fortemente suportado como monofilético. Da mesma forma três subgêneros (Astrophea, Decaloba e Passiflora) também foram fortemente suportados, no entanto o subgênero Deidamioides emergiu como parafilético, pois P. tryphostemmatoides apareceu como grupo irmão de Astrophea. Os autores apontaram que esses resultados devem ser considerados com cautela, pois nessa análise foi incluída apenas uma espécie da secção
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Tryphostemmatoides, no entanto, sugerriram uma revisão na classificação infragenérica, colocando Tryphostemmatoides como um novo subgênero (MUSCHNER et al., 2012).
3. Citogenética e citogenômica no gênero Passiflora
No gênero Passiflora as técnicas citogenéticas clássicas e moleculares têm sido aplicadas para a compreensão das relações entre as espécies trazendo avanços significativos ao estudo citotaxonômico (MELO et al., 2001, MELO; GUERRA, 2003), evolutivo (VIANA;
SOUZA, 2012) e o melhoramento genético (SANTOS et al., 2012; MELO, 2014; MELO et al., 2017).
As espécies de Passiflora já analisadas apresentam diferentes números cromossômicos, podendo ser agrupadas de acordo com o número básico (x), sendo x = 6, x = 9, x = 10 e x = 12 (MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003). O número básico x = 6 é considerado ancestral dentro do gênero e os demais números básicos são considerados secundários (MELO et al., 2001), porém x = 12 também tem sido considerado como número básico ancestral (HANSEN et al., 2006). Na literatura há vários trabalhos usando dados citogenéticos e moleculares acerca do número básico ancestral para Passiflora (STOREY, 1950; RAVEN, 1975; MORAWETZ, 1986; SNOW; MACDOUGAL 1993; MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003; HANSEN et al., 2006; SOUZA et al., 2008). A nível cariotípico, além da descrição de passifloras consideradas diplóides com 2n = 12, 2n = 18, 2n
= 20 e 2n = 22 (MELO et al., 2001; SOUZA et al., 2008), também já foram descritos citótipos tetraplóides (2n = 4x = 24), sendo x = 6 (KNIGHT, 1991; BRUNER, 1998; MELO;
GUERRA, 2003), hexaplóides (2n = 6x = 36) também com x = 6 (MELO; GUERRA, 2003) ou octaplóides (2n = 8x = 72) e x = 9 (SNOW; MACDOUGAL, 1993; MELO et al., 2001;
MELO; GUERRA, 2003).
A utilização de técnicas convencionais tem revelado parâmetros cariotípicos comuns aos representantes de determinados níveis taxonômicos de subgênero, série e secção, como por exemplo, a ocorrência de taxa com 2n = 12 e 2n = 18 em espécies do subgênero Decaloba e Passiflora, respectivamente (MELO et al., 2017). Apesar da contribuição da citogenética clássica para estudo do gênero Passiflora, o número cromossômico foi identificado em apenas 13% das espécies já documentadas de acordo com o IPCN chromosome number (GOLDBLATT; JOHNSON, 2011). Contudo, o número de espécies avaliadas está sendo
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ampliado gradualmente com a inclusão de novos dados cariotípicos obtidos pela aplicação de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares (VIANA; SOUZA, 2012; MELO et al., 2017).
Em passifloras, o simples estabelecimento do número cromossômico pode auxiliar o melhoramento genético através da seleção de espécies para o planejamento de hibridações interespecíficas, uma vez que a seleção de espécies com números cromossômicos diferentes pode levar ao insucesso do cruzamento (CONCEIÇÃO et al., 2011).
Além do número cromossômico obtido pela coloração citogenética convencional, a aplicação de outras técnicas citogenéticas clássicas tem auxiliado o estudo genético do gênero, por exemplo, a utilização do bandamento C para a localização da heterocromatina constitutiva e subsequente identificação e delimitação entre as espécies P. edulis e P. cacao Bernacci &
Souza (VIANA; SOUZA, 2012). A localização de satélites (constrição secundária) nos cariótipos das passifloras pode ser realizada através da simples coloração com fluorocromos base-específicos CMA3 e DAPI, uma vez que as bandas CMA3+ são restritas aos satélites (MELO et al., 2014). A identificação de blocos CMA3+
/DAPI- tem revelado pouca variação em número, mas grandes variações na localização e posição desses blocos, demonstrando que a aplicação de fluorocromos possibilita uma análise comparativa entre espécies (MELO et al., 2001; MELO et al., 2014).
A contribuição da citogenética molecular para a análise comparativa entre espécies e para o apoio a programas de melhoramento é uma atividade incipiente em espécies e híbridos do gênero Passiflora. Todavia, trabalhos realizados com a aplicação da Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) (MELO; GUERRA 2003; SOUZA et al., 2010; COELHO et al., 2016;
MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press) e Hibridação Genômica In Situ (GISH) (MELO et al., 2015; COELHO et al., 2016; MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press) foram conduzidos com sucesso em espécies e híbridos de Passiflora. O mapeamento físico de sequências de DNAr 45S e 5S tem revelado a existência de variações em número e localização em função do nível taxonômico e do número cromossômico, permitindo a utilização desta informação na taxonomia e no estudo evolutivo do gênero, contudo esses marcadores citológicos não revelam modificações cromossômicas estruturais (MELO;
GUERRA, 2003; VIANA; SOUZA, 2012). Em Passiflora verificou-se a relação entre o número de sítios de hibridação de sondas para DNAr 45S e o nível de ploidia de muitas espécies (MELO; GUERRA, 2003).
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Apenas um trabalho realizando uma abordagem citogenômica, visando à construção de um mapa físico, foi relizado em Passiflora. Nesse trabalho oito genes obtidos a partir de uma biblioteca genômica inserida em BACs e sequenciados pela técnica de BAC-ends foram mapeados em P. edulis utilizando a metodologia de BAC-FISH. O gene ERS2 (Ethylene response sensor;BAC198H23) foi mapeado no braço longo do cromossomo 1. O gene ACO1 (1-Aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase; BAC134H15) foi mapeado no braço curto do cromossomo 3. Os genes CYCD1 (Cyclin-dependent protein kinase regulator) e G3PD (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; BAC125I23 e 215I08, respectivamente) foram mapeados no braço curto do cromossomo 4. Os genes EMB2765 (Embryo defective2765), LOX (Lipoxygenase), MIPS (Myo-inositol 1-phosphate synthase) e NDID (NADP-dependent isocitrate dehydrogenase) apresentaram padrões de hibridação dispersos, preferencialmente nas regiões pericentroméricas e subteloméricas na maioria dos cromossomos, indicando a presença de DNA repetitivo nesses BACs (SANTOS et al., 2014).
4. Hibridação Genômica In Situ: origem e evolução de plantas
A técnica de GISH, que surgiu a partir de uma modificação da FISH, se tornou uma das ferramentas mais versáteis da citogenética molecular atualmente. Diferentemente da FISH, que utiliza sequências específicas como sondas (ex.: DNAr 45S e 5S, DNA satélite, elementos transponíveis, sequências teloméricas e genes de cópia única), a GISH utiliza o DNA genômico total de uma espécie como sonda. Dessa forma, essa ferramenta pode ser utilizada para identificação dos genomas parentais em híbridos artificiais ou naturais, na origem e evolução de alopoliploides e no melhoramento de plantas (SILVA; SOUZA, 2013)
Para investigar a origem de uma espécie híbrida ou alopoliploide, o DNA genômico total de uma provável espécie doadora é transformada em sonda e hibridada na espécie em análise. O fato da GISH permitir identificar os genomas que deram origem ao híbrido ou alopoliploide torna essa ferramenta muito informativa (visual) na compreenção da origem e evolução de plantas (SILVA; SOUZA, 2013).
Camellia reticulata, conhecida mundialmente pelas suas características ornamentais, apresenta uma série poliploide variando de 2n = 2x = 30, 2n = 4x = 60 a 2n = 6x = 90, com o número básico x = 15. Essa espécie foi investigada em relação à presença desses números cromossômicos diferentes. Atrevés da GISH, com a utilização das espécies diploides C.
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reticulata, C. pitardii and C. saluenensis (2n = 2x = 30) que fazem parte do complexo C.
saluenensis-pitardii-reticulata foi observada a natureza alopoliploide de C. reticulata com 2n
= 60 e 2n = 90. C. reticulata alotetraploide (4x) surgiu da hibridação entre C. reticulata (2x) e C. pitardii (2x) e C. reticulata alohexaploide (6x) surgiu de uma hibridação subsequente entre C. reticulata alotetraploide (4x) e C. saluenensis (2x) (LIU; GU, 2011).
O amendoim cultivado (Arachis hypogaea, 2n = 4x = 40, AABB), já era estabelecido como uma espécie alotetraploide. No entanto, através da GISH foi possível encontrar seus prováveis ancestrais diploides. Das sete espécies silvestres próximas analisadas, A. duranensis (genoma A) e A. ipaensis (genoma B) mostraram ser as melhores candidatas como doadoras de genomas, pois apresentaram o padrão de hibridação mais intenso e uniforme quando testada contra o conjunto de cromossomos correspondente (SEIJO et al., 2007).
A espécie diploide Emilia sonchifolia (2n = 2x = 10) e a espécie alotetraploide E.
fosbergii (2n = 4x = 20), que ocorre na América tropical e subtropical, são as únicas duas espécies de Emilia que ocorrem no Brasil. E. fosbergii apresenta um cariótipo bimodal (10 cromossomos grandes e 10 cromossomos pequenos), sendo os 10 cromossomos pequenos similares aos 10 cromossomos de E. sonchifolia. Na GISH, quando foi utilizada o DNA E.
fosbergii como sonda e o DNA de E. sonchifolia como bloqueio (1:30), apenas o lote de cromossomos maiores marcaram intensamente, indicando que os 10 cromossomos menores são oriundos de E.sonchifolia (MORAES; GUERRA, 2010).
A relação filogenética entre a manga (Mangifera indica L.) e oito espécies de Mangifera foi observada atraves da comparação do padrão de hibridação do DNA genômico marcado (sonda) das oito espécies nos cromossomos de M. indica. De acordo com o número de sítios de hibridações e intensidades dos sinais, as oito espécies foram divididas em quatro grupos:
As espécies do grupo 1 (M. sylvatica, M. flava e M. caloneura), apresentaram sinais de hibridação intensos distribuídos em todos os cromossomos, indicando que essas espécies compartilham muitas sequências em comum. As espécies do grupo 2 (M. cochinchinensis e M. foetida) apresentaram um menor numero de sítios e a intensidade dos sinais de hibridação foram menos intensos quando comparados com o grupo 1. A espécie do grupo 3 (M.
gracilipes) apresentou sinais de hibridação fracos. As espécies do grupo 4 (M. griffithii e M.
macrocarpa) não apresentaram sinais de hibridação. Dessa forma, as espécies do grupo 1 possuem uma relação muito próxima com M. indica, enquanto as espécies do grupo 4 possuem uma relação muito distante (NISHIYAMA et al., 2006).
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5. Hibridação Genômica In Situ (GISH) em Passiflora
O primeiro relato em periódico indexado a respeito do estabelecimento e da aplicação da técnica de GISH em Passiflora foi realizado por MELO et al. (2015), utilizando sonda genômica paterna para a identificação de híbridos F1 (HD13-133, P. sublanceolata vs. P.
foetida e HD15-101, P. gardineri vs. P. gibertii) e híbridos RC1 (HD18-106 e HD18-113, P.
sublanceolata vs. HD13-133). Nesse trabalho a técnica de GISH foi aperfeiçoada para permitir a identificação dos híbridos. Para isso diferentes concentrações de DNA de bloqueio, que atuam bloqueando o DNA repetitivo compartilhado entre as espécies genitoras, foram testadas (20X, 40X, 60X e 100X) em relação à sonda. A concentração de DNA de bloqueio de 100X foi a mais eficiente na diferenciação dos genomas parentais, pois quanto menor era a concentração de DNA de bloqueio, maior era a hibridação em todos os cromossomos, não sendo possível identificar o lote cromossômico de cada genitor. Isso ocorreu devido ao fato dessas espécies serem muito próximas e compartilharem uma grande quantidade de DNA repetitivo.
Em um híbrido obtido pela EMBRAPA entre duas espécies de grande interesse econômico e agronômico (P. edulis vs. P. cincinnata) não foi possível identificar um lote cromossômico (nove cromossomos) de cada espécie. Sendo identificados três lotes cromossômicos: oito cromossomos oriundos de P. edulis (completamente marcados pela sonda), seis cromossomos parcialmente marcados e quatro cromossomos sem marcação.
Esses resultados provavelmente foram obtidos devido à utilização de uma baixa concentração de DNA de bloqueio, pois a hibridação parcial de alguns cromossomos pode ter acontecido, devido ao fato dessas espécies serem próximas e compartilharem uma grande quantidade de DNA repetitivo (COELHO et al., 2016).
Recentemente a técnica de GISH em híbridos interespecíficos permitiu não apenas a identificação/confirmação de híbridos artificiais F1 e RC1 envolvendo as espécies P.
sublanceolata (Genoma-S) e P. foetida (Genoma-F)com potencial ornamental, mas também foi utilizada para a visualização de recombinações cromossômicas em plantas RC1 e na elucidação da origem da triploidia em um híbrido RC1. Foram observadas diferenças nos números e nas origens das recombinações cromossômicas (MELO et al., 2017). Da mesma forma, a GISH permitiu a identificação dos genomas materno e paterno em oito híbridos obtidos do cruzamento entre P. gardineri vs. P. gibertii, (SILVA et al., 2017 in press).
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6. DNA repetitivo: DNA satélite e elementos transponíveis
O DNA repetitivo são sequências que estão representadas em múltiplas cópias, podendo chegar a milhares de cópias no genoma (MEHROTRA; GOYAL, 2014). A porção do DNA repetitivo em angiospermas pode corresponder até 90% do tamanho do genoma destes organismos (LEITCH et al., 1998). Inicialmente o DNA repetitivo pode ser dividido em duas classes, sequências repetitivas dispersas (elementos tranponíveis) e em tandem (DNA satélite, DNAr 45S e 5S e telômeros), considerando os mecanismos de evolução e distribuição ao longo do genoma para essa classificação (SLAMOVITS; ROSSI, 2002).
O DNA satélite, levando-se em consideração o tamanho do monômero (unidade de repetição) e o seu arranjo no genoma, pode ser classificado em três grupos distintos:
microssatélites (2-5 bp), variando de 10-100 unidades de repetição; minissatélites (6-100 bp), com as unidades de repetição variando de 0,5 a 30 kb; e DNA satélite, com o tamanho do monômero variando entre 150-400 pb na maioria das plantas e animais e as unidades de repetição podendo chegar a 100 Mb (MEHROTRA; GOYAL, 2014).
Os DNAs satélites receberam essa denominação a partir do seu isolamento, que inicialmente era realizado em bandas após o gradiente gerado por centrifugação (TEK et al., 2005). As características principais do DNA satélite são a elevada distribuição em tandem de monômeros e sua localização na heterocromatina (PLOHL, 2010). Os tamanhos dos monômeros de sequências satélites que apresentam um comprimento variável, geralmente entre 150–400 pb, pode estar relacionado com número de pares de base necessários a contornar um nucleossomo. O mapeamento físico do DNA satélite em diversas espécies vegetais demostraram que essas sequências estão geralmente localizadas em regiões heterocromáticas centroméricas ou pericentroméricas. Contudo, a distribuição subtelomérica e intersticial também têm sido relatadas (PLOHL, 2010).
A função do DNA satélite é pouco conhecida, exceto pela participação destas sequências na estruturação e organização cromossômica. A existência de genes ou fatores de transcrição em regiões de DNA satélites é escassa, com pouca ou nenhuma ativação gênica (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Por outro lado, essas regiões são responsáveis pela regulação da transcrição de genes adjacentes a heterocromatina, como observado em Drosophila (ZHIMULEV et al., 1986). O DNA satélite, como unidade repetitiva está associado a diversas funções organizacionais, participando de eventos citológicos, como por exemplo, a
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movimentação cromossômica, condensação centromérica, pareamento, rearranjo e recombinação cromossômica e a interação entre a cromatina e suas proteínas associadas (MEHROTRA; GOYAL, 2014).
Os elementos tranponíves são uma classe de DNA repetitivo com a característica única de movimentação genômica, podendo influenciar a expressão gênica e a expressão de determinadas características fenotípicas. O início das pesquisas com os elementos de transposição se deu na década de 40 por Bárbara McClintock e seus trabalhos com milhos, demostrando que a estrutura genética não é estática, mas susceptível a modificações não necessariamente relacionadas a mutações, quebrando assim um dogma da biologia na época (McCLINTOCK, 1956). No entanto, apenas em 1970 com a descoberta que existiam elementos capazes de remover-se e inserir-se em outros locais no genoma de bactérias e moscas das frutas causando alterações, foi possível identificar os elementos transponíveis como os maiores constituintes dos genomas (BIÉMONT; VIEIRA, 2006) Apesar dos efeitos deletérios da inserção de elementos de transposição em sequências codificantes, esses elementos móveis são responsáveis pela regulação gênica em resposta ao ambiente e a fatores epigenéticos, particularmente em função a estresses ambientais sendo de interesse do melhoramento genético (GRANDBASTIEN et al., 2005; SLOTKIN; MARTIENSSEN, 2007).
Os elementos tranponíveis são classificados em duas classes, quanto ao mecanismo de transposição (enzimologia), com a presença ou ausência de um RNA intermediário no processo de transposição. Os elementos tranponíveis da classe I utilizam um RNA intermediário no processo de tranposição, sendo conhecidos como retroelementos ou retrotransposons, e os da classe II, em que o processo de transposição ocorre na forma de DNA, sendo conhecidos como transposons de DNA (WICKER et al., 2007). Nos elementos da classe I, em que a tranposição é feita pela enzima trancriptase reversa, o mecanismo de tranposição é conhecido como ‘copia e cola’ e nos elementos da classe II, em que a tranposição é feita pela enzima DNA transposase, o mecanismo de tranposição é conhecido como ‘recorta e cola’ (JURKA et al., 2007)
Em plantas os elementos tranponíveis compõem a maior porção do DNA repetitivo, podendo chegar a 80% ou mais no genoma (WICKER et al., 2007). Devido à grande diversidade e variabilidade dos elementos transponíveis, modo de inserção, organização e enzimologia, as classes de elementos tranponíveis podem ser classificadas em subclasse,
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ordem, superfamília, família e subfamília (WICKER et al., 2007). A primeira subdivisão dos retrotransposons da classe I é em relação à presença de LTRs (Ex.: Ty1-Copia e Ty3-Gypsy) e os retrotransposons sem LTRs (Ex.: LINEs e SINEs). Em plantas, os retrotransposons das superfamílias Copia e Gypsy são os mais abundantes e diversificados, representando a maior parte do DNA repetitivo disperso nos genomas (MARCO; MARIN, 2005; WICKER, 2007;
KEJNOVSKY et al., 2012)
Aspectos genômicos-evolutivos são os principais responsáveis pelo acúmulo de sequências repetitivas em plantas superiores. O acúmulo destas sequências durante o processo evolutivo das angiospermas é fato constatado pelo pequeno conteúdo genômico observado em plantas ancestrais em comparação com as espécies atuais, o que sugere o acúmulo e aumento do genoma ao longo de toda história evolutiva (MEHROTRA; GOYAL, 2014).
As variações relacionadas à organização genômica, tipo de sequência de nucleotídeos e localização cromossômica do DNA repetitivo entre os taxa de um determinado gênero são importantes para a compreenção dos eventos evolutivos que representam as distâncias filogenéticas entre as espécies, sendo desta forma, fatores relevantes no estudo genômico- comparativo e na sintenia e coliearidade entre espécies (HAN et al., 2009; KOO et al., 2010;
ZHANG et al., 2012; MEHROTRA; GOYAL, 2014). As modificações relacionadas ao DNA repetitivo ocorrem rapidamente em monômeros, os quais são duplicados com o passar do tempo evolutivo, sendo essas alterações específicas para uma espécie ou um grupo taxonômico (KOO et al., 2010). Por outro lado, famílias de DNA satélite se mostram conservadas em alguns gêneros (ANAMTHAWAT-JÓNSSON; HESLOP-HARRISON, 1992). As sequências repetitivas em tandem se originam por mutação de novo e recombinações anormais resultando em duplicações de blocos de DNA repetitivo. Neste caso, as recombinações desiguais são consideradas o mecanismo inicial da duplicação/multiplicação do DNA satélite. De modo geral, após a amplificação de monômeros de DNA satélites, as sequências são inseridas em uma nova região genômica (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Devido à rápida modificação em número de cópias e em localização a caracterização do DNA satélite é ideal para a visualização de modificações cromossômicas estruturais em plantas.
As informações sobre o DNA repetitivo geralmente são desconsideradas ou sumarizadas em projetos visando o estudo genômico de alta-resolução, limitando as inferências em torno da participação e organização da heterocromatina na composição do
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cariótipo e o estabelecimento de mapas físicos com a inclusão de informações referentes ao DNA repetitivo (PLOHL, 2010). Antes do uso das ferramentas de bioinformática que atualmente estão disponíveis, a maior limitação da inclusão dos dados obtidos de sequenciamento genômico era a identificação do DNA satélite pela presença de monômeros em tandem de baixa variabilidade, dificultando o alinhamento e a obtenção de longos contigs para a avaliação e mapeamento (PLOHL, 2010). No entanto, o sequenciamento do DNA satélite contribuiu para o estudo de genes de alguns organismos (NAKAGI et al., 2004;
HOSKINS et al., 2007). A atual disponibilidade de softwares e algoritmos específicos para a análise do DNA repetitivo (NOVÁK et al., 2013), plataformas de análise e de servidores de informação genômica (GOECKS et al., 2010) e bancos de dados de DNA repetitivo, permitem a identificação de sequências repetitivas e outra análise de dados de sequenciamento sem a necessidade da inclusão de informações adicionais ou genomas de referência (NOVÁK et al., 2013).
Dados de sequenciamento genômico de última geração têm sido utilizados para a identificação e caracterização do DNA repetitivo (NOVÁK et al., 2010), DNA satélite e de elementos transponíveis (GONZÁLEZ; DEYHOLOS, 2012) em espécies importantes, como Pisum sativum L., Glycine max L. (NOVÁK et al., 2010), Linum usitatissimun L.
(GONZÁLEZ; DEYHOLOS, 2012), Solanum tuberosum L. (TORRES et al., 2011) e Olea europeae L. (BARGHINI et al., 2014). O sequenciamento de baixa cobertura genômica tem sido uma excelente estratégia para a identificação de sequências repetitivas. Desta forma, a conveniência da utilização de pouca informação de sequenciamento torna a análise bioinformática menos trabalhosa e demorada. Vários estudos já utilizaram o sequenciamento genômico de baixa cobertura para a identificação de DNA repetitivo, satélites e elementos transponíveis (SVEINSSON et al., 2013; BARGHINI et al., 2014).
7. DNA ribossomal 45S (DNAr 45S)
O DNA ribossomal 45S, geralmente referido como DNAr 45S, é um tipo de DNA repetititivo codificante, organizado em tandem, presente em eucariotos, repetidos de dezenas a milhares de vezes. A sua nomenclatura é devido ao coeficiente de sedimentação, em unidades de Svedberg (S). Cada unidade de repetição do DNAr 45S é composta pelas regiões trancritas e não trancritas. As regiões transcritas compreendem o espaçador trancrito externo
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(ETS), os três genes ribossomais (18S, 5.8S e 26S) e os dois espaçadores internos (ITS): ITS1 entre os genes 18S e 5.8S e ITS2 entre os genes 5.8S e 26S. A região não transcrita é composta pela região intergênica (IGS), localizada entre duas unidades de repetição (KOVARIK et al., 2004; EICKBUSH; EICKBUSH, 2007). As regiões gênicas (18S, 5.8S e 26S) é altamente conservada entre diferentes organismos, enquanto as regiões ETS, ITS e IGS são bastante variáveis (LOUGHNEY et al., 1983).
Em plantas, alguns autores tem adotado a nomenclatura de ‘DNAr 35S’ (KOVARIK et al., 2008; GARCIA et al., 2010), além disso, o gene ribossomal maior tem recebido a nomenclatura de 25S, 26S ou 28S (APPELS et al., 1980; UNFRIED; GRUENDLER, 1990;
HANSON et al., 1996). Devido a sua alta conservação, o DNAr 45S é um dos marcadores mais utilizados na citogenética de plantas, sendo utilizados em análises comparativas, citotaxonômicas e evolutivas (PEDROSA-HARAND; GUERRA, 2004). Em Passiflora, o DNAr 45S tem sido o marcador mais utilizado, já tendo sido mapeado citogeneticamente em diversas espécies e utilizados em análises comparativas e citotaxonômicas. Nesse trabalho, para padronizar nós adotamos a nomenclatura de 45S e o gene ribossomal maior de 26S, pois é a mais utilizada.
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CAPÍTULO 1: Relações genômicas entre Passiflora edulis f. flavicarpa e espécies próximas (subgêneros Decaloba e Passiflora)
Gonçalo Santos Silva, Margarete Magalhães Souza, Cláusio Antônio Ferreira de Melo
Resumo
A investigação da origem de P. edulis f. flavicarpa e as relações filogenéticas entre algumas espécies próximas no gênero Passiflora (subgêneros Decaloba e Passiflora) foram estabelecidas com a aplicação da Hibridação Genômica In Situ (GISH) baseada no nível de homologia genômica. Os DNAs genômicos de 18 espécies foram utilizadas como sondas, as quais foram hibridadas nos cromossomos de P. edulis f. flavicarpa. Através da técnica de GISH com as sondas das espécies do subgênero Passiflora não foi possível identificar lotes cromossômicos específicos de nenhuma das espécies analisádas. Por outro lado, as sondas das espécies P. edulis f. edulis, P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P. nitida, e P. vitifolia produziram hibridações intensas e uniformes em todos os cromossomos. Sondas genômicas das espécies P. ligularis, P. foetida e P. sublanceolata produziram hibridação mais intensa em quatro sítios teloméricos, correspondentes ao lócus de DNAr 45S, e hibridação dispersa menos intensa ao longo de todos os cromossomos. Quando foram utilizadas as sondas das espécies do subgênero Decaloba: P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P.
micropetala, P. morifolia, P. rubra e P. suberosa, a hibridação foi restrita aos sítios de DNAr 45S. Os resultados sugerem que as espécies do subgênero Passiflora compartilham muitas sequências repetitivas, sendo que o genoma das espécies P. ligularis, P. foetida e P.
sublanceolata possuem menor relação de similaridade com P. edulis f. flavicarpa. As hibridações restritas aos sítios de DNAr 45S com as sondas das espécies do subgênero Decaloba indicam que esses dois subgêneros divergiram há muito tempo na escala evolutiva do gênero, uma vez que a proporção de DNA repetitivo em comum decresce com divergência evolutiva entre as espécies.
Palavras-chave: DNA repetitivo, Evolução, GISH, Relações filogenéticas.
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Abstract
The investigation of the origin of P. edulis f. flavicarpa and the phylogenetic relationships between relatives species in Passiflora genus (Decaloba and Passiflora subgenera) were established with the application of Genomic In Situ Hybridization (GISH) based on the level of genomic homology. Genomic DNA from 18 species were used as probes, which were hybridized on P. edulis f. flavicarpa chromosomes. It was not possible to identify specific chromosome subset through the GISH technique with the probes of the species of the Passiflora subgenus. On the other hand, the probes of species P. edulis f. edulis, P. alata, P.
cincinnata, P. coccinea, P. nitida, and P. vitifolia produced intense and uniform hybridizations on all chromosomes. Genomic probes of P. ligularis, P. foetida and P.
sublanceolata produced more intense hybridization at four telomeric sites, corresponding to the 45S rDNA locus, and less intense dispersed hybridization across all chromosomes. When the probes of the species of Decaloba subgenus were used: P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P. micropetala, P. morifolia, P. rubra and P. suberosa, the hybridization was restricted to the sites of 45S rDNA. The results suggest that the species of the Passiflora subgenus share many repetitive sequences, and the genome of the species P. ligularis, P.
foetida and P. sublanceolata have a lower smilarity relation with P. edulis f. flavicarpa.
Hybridizations restricted to the 45S rDNA sites with the probes of species of the Decaloba subgenus indicate that these two subgenera have diverged a long time on the evolutionary scale of the genus, since the proportion of repetitive DNA in common decreases with evolutionary divergence between species.
Key-words: Repetitive DNA, Evolution, GISH, Phylogenetic relationships.
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1. INTRODUÇÃO
Passiflora L., o maior gênero da família Passifloraceae, compreende mais de 525 espécies (CERVI; IMIG, 2013), distribuídas especialmente na região neotropical (ULMER;
MACDOUGAL, 2004). A presença de uma corona e um androginóforo confere às flores das espécies desse grupo uma beleza única, que atrai os olhares de horticultores e colecionadores apaixonados por passifloras. Dessa forma, atualmente, além da produção de frutos, as passifloras silvestres são amplamente cultivadas como plantas ornamentais, pois além de sua beleza, apresentam uma ampla diversidade de formas e cores (HANSEN et al., 2006).
O gênero Passiflora foi estabelecido por Linnaeus em 1753, em que foram descritas 22 espécies e a primeira classificação infragenérica foi feita por Killip (1938), em que 355 espécies foram organizadas em 22 subgêneros. Posterior a essa classificação foi adicionado um novo subgênero por Escobar (1989) e mais recentemente Feuillet e MacDougal (2004) propuseram uma nova classificação infragenérica, baseada em caracteres morfológicos, com apenas quatro subgêneros: Astrophea (DC.) Mast. (57 espécies) Decaloba (DC.) Rchb. (220 espécies) Deidamioides (Harms) Killip (13 espécies) Passiflora (240 espécies).
As filogenias moleculares, baseadas em marcadores plastidiais e nucleares, estão mais de acordo com as proposições morfológicas feitas por Feuillet e MacDougal (2004), corroborando total ou parcialmente essa última classificação infragenérica (MUSCHNER et al., 2003; YOUCKTENG; NADOT, 2004; HANSEN et al., 2006; MUSCHNER et al., 2013).
A primeira filogenia molecular em Passiflora suportou fortemente três (Astrophea, Decaloba e Passiflora) dos quatro subgêneros propostos por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, a posição de subgênero Deidamioides permaneceu indefinida (MUSCHNER et al., 2003). Em sua análise de filogenia molecular Youckteng e Nadot (2004), reconheceram oito subgêneros em Passiflora, denominados Astrophea, Deidamioides, Dysosmia, Granadilla (=Passiflora), Plectostemma (=Decaloba) Polyanthea, Tetrapathea e Tryphostemmatoides. Quatro destes estão de acordo com a classificação proposta por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, os resultados sugeriram a manutenção de quatro subgêneros adicionais propostos por Killip (1938). No referido trabalho foi observada uma forte relação entre a posição filogenética de diferentes clados e o número cromossômico. O clado 1 (subgênero Astrophea), com n = 12; o clado 2 (subgênero Decaloba), com n = 6 e o clado 3 (subgênero Passiflora) com n = 9. O subgênero Dysosmia, com um número cromossômico variável, n = 9-11, foi considerado
