Doseamento de flavonoides

Para identificar as possíveis substâncias responsáveis pelo efeito antioxidante foi feito o doseamento de flavonoides expressos por flavonas e flavonóis. O princípio desse método consiste na formação de complexos ácidos estáveis entre o cloreto de alumínio e a carbonila em C-4 e a hidroxila em C-5 do anel A e entre as hidroxilas em C-3 e C-4 do anel B em flavonóis e flavonas (Figura 20) (CHANG et al., 2002). A presença de insaturação entre o C-2 e C-3 no anel C de flavonoides fornece um máximo de absorção do complexo na faixa de 415-440 nm (CHANG et al., 2002).

Figura 20. Esquema da complexação do cloreto de alumínio com flavonoides (MABRY et al. 1970).

A curva padrão obtida por regressão linear da rutina para a análise da dos extratos brutos etanólicos resultou em um coeficiente angular r2 _{> 0,90. O tratamento} estatístico dos dados mostrou que as diferenças entre os três experimentos independentes realizados para cada extrato não foram estatisticamente significativas (p ≥ 0,05). Os resultados obtidos no doseamento de flavonoides podem ser visualizados na Tabela 8.

Tabela 8. Teor de flavonoides, expressos em flavonas e flavonóis, obtidos para os extratos etanólicos de C. grandiflora.

Código das amostras Teor de flavonoides (%)

Flores 1,57±0,00ª

Raízes adventícias 1,56±0,00b

Folhas 1,56±0,00b

Legenda: a, b _{sem diferença significativa entre os extratos por Tukey-Kramer}

A avaliação do grau de significância das diferenças entre os valores do teor de flavonoides obtidos para cada extrato também foi efetuada por ANOVA que considerou a diferença significativa. O teste de Tukey-Kramer também sugere essa diferença, exceto quando comparado o extrato das flores com dos ramos e extrato das raízes adventícias com das folhas.

Todos os extratos avaliados apresentaram baixos teores de flavonas e flavonóis quando comparados a dados de outras espécies como, C. fluminensis (SILVA & PAIVA, 2012) e C. lanceolata (FERREIRA et al., 2014). O maior teor foi observado na amostra das flores (1,57±0,00%) e o menor valor foi obtido para a amostra das folhas (1,56±0,00%), sugerindo que o potencial antioxidante pode não estar relacionado a essas substâncias ou que estas não são as únicas responsáveis, uma vez que estudos mostram que a formação de complexos do cloreto de alumínio com flavonoides que não possuem essa insaturação resulta em uma absorvância muito baixa na faixa de comprimento de onda utilizado (CHANG et al., 2002). Além disso em Clusia identificou-se maior presença de flavonas e bisflavonoides que de flavonóis (VIRGINIO, 2015). A presença de outros esqueletos flavonoídicos diferentes pode justificar a alta atividade antioxidante observada ao lado do baixo teor de flavonoides expressos como flavonas e flavonóis.

Para se saber se o teor de flavona e flavonol possui ou não correlação com a atividade antioxidante, foi realizado o teste de Correlação de Pearson. Este teste é uma ferramenta estatística que fornece um coeficiente definido pela medida de associação linear entre variáveis. Os valores de Correlação de Pearson podem estar situados entre -1 e +1, onde o número 1 indicaria uma correlação linear perfeita e o sinal indicaria se essa correlação é negativa ou positiva, respectivamente (FILHO & JÚNIOR, 2009). São classificados ainda como relação fraca quando os valores estão entre 0,10 e 0,29; correlação moderada quando os valores estão entre 0,30 e 0,49 e correlação forte quando os valores estão 0,50 e 1 (COHEN, 1988).

Os resultados obtidos forneceram uma correlação positiva moderada (+0,48) entre os valores de CE50 dos extratos e o percentual de flavonoides. Isto indica uma

tendência moderada de que o valor de CE50 aumenta conforme o aumento do teor de flavonoides. A Figura 21 apresenta os resultados de Correlação de Pearson entre o percentual de flavonoides e os valores de CE50, o que sugere a participação de outras substâncias corroborando o efeito observado.

Figura 21. Correlação de Pearson (r2 _{= 0,2276) entre os valores de CE50 dos} extratos de C. grandiflora e o percentual de flavonoides.

5.6. Atividade citotóxica

Para desenvolvimento de um fármaco a toxidez pode fazer de moléculas promissoras uma molécula descartada, já que sua segurança é um dos parâmetros mais importantes (FLINT et al., 2000). O equilíbrio entre o efeito farmacológico e toxicológico é sempre verificado quando se busca aplicabilidade como agente terapêutico (MELO et al., 2000). Entretanto, para células neoplásicas o ideal é que o fármaco seja tóxico apenas para células tumorais e não para as sadias. Por isso, o estudo da toxidez se faz importante.

Um avanço na pesquisa de produtos naturais no campo da oncologia vem ocorrendo desde o início do século XX. A maioria dos fármacos antitumoral, 60 %, tem sua origem nos produtos naturais, dentre eles a vimblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, podofilotoxina, etoposídeo, teniposídeo, camptotecina, topotecano e irinotecano (LOTUFO et al., 2010).

As substâncias de origem vegetal mostram ser boas perspectivas como anticancerígeno por possuir diversidade química e potencial ilimitado para modificação racional (DIAZ-CARBALLO et al., 2008).

A análise da toxidez e pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa de screening do National Cancer Institute (NCI) nos Estados Unidos, que testa mais de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É um método rápido, sensível e barato que tem a capacidade de analisar o estado metabólico da célula. Consiste em uma análise colorimétrica baseada na clivagem do sal de tetrazóleo (amarelo) para cristais de formazan (azul/púrpura), a partir de substratos de enzimas microssomais e mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas.

O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a toxidez, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE et al., 1996). Assim, o ensaio de hemólise sugere se o mecanismo do extrato ou substância estudada pode ser através da lise de membrana celular pelo fato da morte celular ser observada pela presença de necrose.

A verificação da citoxicidade in vitro dos extratos brutos frente às células tumorais HCT-116 (cólon humano), AGP-01 (ascite gástrica), MCF7 (mama-humano) e MRC5 (fibroblasto humano) através do ensaio com MTT, assim como a atividade hemolítica estão apresentados na Tabela 9, onde os valores da concentração inibitória média do crescimento celular (Cl50) estão em μg/mL para os extratos e em μM para doxorrubicina.

Tabela 9. Valores da concentração do CI50 dos extratos brutos obtidos de C.

grandiflora. Código das amostras Cl50* MCF7 AGP-01 HCT-116 MRC5 Hemólise CGFH >50 >50 >50 >50 >200 CGFEt >50 >50 >50 >50 >200 CGRAH >50 >50 >50 >50 >200 CGRAEt >50 >50 >50 >50 >200 CGRH >50 >50 >50 >50 >200

CGREt >50 >50 24,30(18,54 –31,84) >50 >200 CGFoH >50 >50 >50 >50 >200 CGFoEt >50 44,15(34,79 – 56,02) >50 >50 >200 Doxorrubicina 0,95 (0,73 – 1,24) 0,25(0,19- 0,33) 0,1 (0,047-0,28) 0,2 (0,16- 0,25) >200

Legenda: * os valores das concentrações estão em µg/mL para os extratos e em µM para dexorrubicina.

CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGFEt: extrato etanólico das flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C.

grandiflora; CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora;

CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora; CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora.

Das amostras testadas as mais promissoras foram as extraídas em etanol. O CGREt apresentou um bom resultado inibitório na linhagem HCT-116 com a CI50 24,3 μg/mL e o CGFoEt na linhagem AGP-01 com a CI50 de 44,2 μg/mL. Ressalta-se que os extratos foram ativos apenas na linhagem tumoral e não inibiram o crescimento da linhagem normal nas concentrações testadas. Segundo protocolo do NCI (ALLEY et al., 1988), valores de CI50 ≤ 30 µg/mL devem ser considerados interessantes para extratos brutos de origem vegetal, enquadrando-se CGREt.

O estudo realizado para a determinação de atividade hemolítica em células de camundongos indicou que nenhuma das amostras testadas provocou lise na membrana plasmática das células na maior concentração testada, apresentando CI50 >200μg/mL, demonstrando não ser este o mecanismo de ação dos extratos.

Em Clusia, relatos de atividade citotóxica estão presentes na literatura, sendo as benzofenonas os metabólitos secundários com maior ação. A nemorosona, presente em Clusia rosea, foi citotóxica frente a diferentes linhagens tumorais e com baixa citotoxidade em células sadias (CUESTA-RUBIO et al., 2002; DIAZ- CARBALLO et al., 2003; DIAZ-CARBALLO et al., 2008; POPOLO et al., 2011). Derivados bifenila presentes em Clusia paralicola também apresentaram citotoxidez

em linhagem de células KB (sublinhagem celular tumoral geral que formam queratina) (SEO et al., 1999).

5.7. Atividade antimicrobiana

O crescente aumento da resistência bacteriana aos antibióticos em circulação no mercado é considerado um dos maiores problemas atuais de saúde pública (BALSALOBRE et al., 2014). O fato denota dados alarmantes, pois existem bactérias que já são resistentes à grande maioria – senão a todos – os antibióticos conhecidos, como é o caso de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) e Enterococcus faecium resistentes à vancomicina (VRE) (GUIMARÃES et al., 2010). Simultaneamente o número de novos antibióticos aprovados pela Food

And Drug Administration (FDA) tem diminuído ao longo dos anos (BOUCHER et al.,

2009). Devido à complexidade de suas estruturas químicas e às interações específicas com seus alvos (GUIMARÃES et al., 2010), produtos de origem natural têm sido vistos como uma boa alternativa a serem explorados (HARVEY et al.,2008), já que poucos fármacos provenientes de recursos naturais foram reprovados pelo FDA (SUFFREDINI et al., 2006).

Em vista disso, todos os extratos obtidos de C. grandiflora foram analisados quanto sua atividade antimicrobiana frente às cepas de bactérias gram-positivas (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e S. simulans) e gram-negativas (Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae,

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella pneumoniae). Primeiro, foi

realizada a análise por TSA e observou-se que as únicas cepas inibidas foram de P.

aeruginosa e E. coli para cinco dos oito extratos. Os resultados obtidos da média

entre os diâmetros das zonas de inibição (Halo = mm) estão apresentados na Tabela 10.

Tabela 10. Diâmetro dos halos de inibição formados em função dos extratos de C.

grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli.

Código das amostras P. aeruginosa E. coli

CGFH - -

CGRAH - - CGRAEt 7,0 mm 7,0 mm CGRH 7,6 mm 7,8 mm CGREt 6,6 mm 7,0 mm CGFoH - - CGFoEt 7,3 mm 6,2 mm

Legenda: - sem formação de halo

CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGFEt: extrato etanólico das flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C.

grandiflora; CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora;

CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora; CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora.

Dos cinco extratos que mostraram atividade frente a P. aeruginosa, todos obtiveram um diâmetro do halo variando de 6,3 mm até 7,6 mm. Já em E. coli, os halos variaram de 6,2 mm a 7,8 mm. Este resultado é bastante promissor por se tratar de um extrato bruto composto por várias substâncias em pequenas concentrações que podem estar contribuindo de maneira sinérgica e reduzindo as chances de resistência (DA SILVA, 2001).

Segundo à Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a sensibilidade dos microrganismos frente aos antimicrobianos é representada pela concentração inibitória mínima (CIM) de cada microrganismo para cada antimicrobiano, que corresponde a menor concentração do antimicrobiano capaz de inibir o desenvolvimento visível do microrganismo.

Os extratos que apresentaram atividade no ensaio de TSA tiveram a CIM determinada. Os resultados foram mensurados pela turbidez a olho nu e, em seguida, pela mudança de coloração, devido a uma redução, de azul, do azul de resazurina, para rosa, da resorufina. Essa mudança de coloração se deve a presença de respiração aeróbia. Os resultados encontram-se na Tabela 11.

Tabela 11. Concentrações inibitória mínima (CIM) dos extratos ativos de C.

grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli.

Código das amostras P. aeruginosa E. coli

CGFEt 256 μg/mL 64 μg/mL

CGRAEt 32 μg/mL 16 μg/mL

CGRH 256 μg/mL 128 μg/mL

CGREt 64 μg/mL 32 μg/mL

CGFoEt 64 μg/mL 32 μg/mL

Legenda: CGFEt: extrato etanólico das flores de C. grandiflora; CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora; CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora.

O extrato CGRAEt foi o mais eficaz tanto frente à P. aeruginosa como à E.

coli, apresentando um CIM de 32 μg/mL e 16 μg/mL, respectivamente. O extrato

CGREt foi capaz de inibir completamente o crescimento de P. aeruginosa em uma concentração de 64 μg/mL. Ainda em relação a P. aeruginosa, os extratos CGRH e CGFEt apresentaram um CIM de 256 μg/mL. No caso de E. coli, o extrato CGRAEt, como já mencionado, apresentou o melhor resultado de CIM, inibindo completamente seu crescimento a partir da concentração de 16 μg/mL. Os extratos CGREt e CGFoEt mostraram-se eficazes a partir da concentração de 32 μg/mL e o extrato CGFEt inibiu em uma concentração de 64μg/mL. Por último, o extrato CGRH apresentou um CIM de 128 μg/mL, mas ainda dentro da faixa de concentração aceita pelo CLSI como um bom resultado (512 μg/mL> CIM> 0,25 μg/mL).

Estudos anteriores sobre C. grandiflora, mostraram que benzofenonas possuem atividade antimicrobiana contra os patógenos do mel Paenibacillus larvae e

Paenibacillus alvei (LOKVAM et al., 2000) e as resinas florais mostraram atividade

antimicrobiana contra S. aureus, B. subtilis e C. albicans em ensaio de bioautografia (PORTO et al.,2000). Este ensaio veio acrescentar que não apenas os componentes das resinas florais podem apresentar atividade antimicrobiana, assim como extratos de outros órgãos.

Os carrapatos são artrópodes ectoparasitos hematófagos que afetam a população animal e humana devido a transmissão de patógenos (ESTRADA-PEÑA & JONGEJAN, 1999; PAROLA & RAOULT, 2001). O carrapato Rhipicephalus

microplus é um ixodídeo originário da Ásia, cujo principal hospedeiro é o bovino. Sua

incidência é maior na América, África, Ásia e Austrália (GONZALES, 1995; NARI, 1995).

Seus danos ao animal parasitado se devem, principalmente, pela espoliação da grande quantidade de sangue (MARTINS, 2004) e transmissão de doenças (MARTINS & CORREA, 1995), gerando grande perda econômica (GRISI et al., 2002). Atualmente, o controle do carrapato é feito principalmente com o uso de carrapaticidas e sua troca geralmente é indiscriminada e acaba não cumprindo o seu objetivo de controlar os carrapatos, permitindo que sejam selecionados os indivíduos tolerantes (FURLONG et al., 2003). O controle biológico de pragas tem sido uma alternativa promissora, pois utiliza mecanismos naturais ao combate, menor impacto ambiental, menor custo, maior especificidade e menor desenvolvimento de resistência (ALVEZ, 1998; MILNER, 2000; SHAH & PELL, 2003; SHAMISH et al., 2004).

Assim, avaliaram-se os extratos brutos hexânicos de C. grandiflora quanto sua atividade acaricida frente ao carrapato bovino Rhipicephalus microplus. Os resultados do teste de mortalidade por imersão de fêmeas adultas nos extratos podem ser visualizados na Figura 22.

Figura 22. Teste de imersão de fêmeas adultas nos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora.

Os carrapatos imersos no controle apresentaram mortalidade apenas após o quarto dia, chegando em torno de 15 % após 15 dias de análise. Já a mortalidade por imersão no extrato CGFoH após os 15 dias foi semelhante ao controle, enquanto que no extrato CGRAH foi o que exibiu o menor percentual de mortalidade. O extrato que obteve a melhor atividade foi CGRH, com a mortalidade dos carrapatos iniciando logo no primeiro dia, e com cerca de 50 % de mortalidade após 15 dias.

Os extratos foram também analisados frente ao índice de postura de ovos (IPO) e porcentagem de inibição de postura 15 dias após o tratamento com extratos hexânicos de C. grandiflora. Estes resultados estão expressos na Tabela 12.

Tabela 12. Índice de postura de ovos (IPO) e inibição de postura, em porcentagem, 15 dias após o tratamento com extratos hexânicos de C. grandiflora.

Amostras IPO Inibição de postura (%)

Controle Negativo 0,132 ± 0,014 ---

CGRH 0,106 ± 0,008 0

CGRAH 0,134 ± 0,011 0

CGFoH 0,125 ± 0,015 0

CGFH 0,107 ± 0 6,56

Legenda: CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora.

O extrato CGRH obteve melhor resultado com o menor valor de IPO e o CGRAH foi próximo ao controle, porém, menor.

No gênero Clusia há relatos da atividade inseticida para espécie Clusia

hilariana frente as larvas de Rhodnius prolixus, transmissor da doença de Chagas,

devido a presença do triterpeno ácido oleanólico e da benzofenona nemorosona (KELECOM et al., 2002).