Teste histoquímico

A histoquímica tem como objectivo localizar in situ, os principais grupos químicos que ocorrem nos tecidos. Os testes histoquímicos são aplicados em estudos de caracterização de plantas que apresentem metabólitos primários e/ou secundários. Além destes estudos, os testes podem ser incorporados em futuro controle de qualidade (LEITE, 2009).

Para identificar a possível presença de determinadas classes de substâncias na folha e ramo de C. grandiflora, essas partes vegetativas foram submetidos à diferentes reagentes.

Os alcalóides podem se acumular em células epidérmicas e a reação positiva para o reagente de Wagner se deu devido a precipitação do metabólito em presença de halogênios, corando em vermelho a castanho-avermelhado (Figura 12A) (FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora a presença da substância se deu na epiderme e no feixe vascular de toda lâmina foliar e no pecíolo, porém não foram encontrados na literatura tal metabólito secundário para o gênero.

A presença de carboidratos, metabólito primário essencial para sobrevivência da planta, se deu devido a presença de dois tipos de polissacarídeos, o estrutural (celulose) e de reserva (amido) (FIGUEIREDO et al., 2007). Para detecção de amido foi utilizado o lugol, ao qual é constituído por iodeto de potássio que se acumula na molécula de amido gerando coloração marrom, roxo ou negro (Figura 12B) (FIGUEIREDO et al., 2007). Este metabólito foi encontrado em todas as partes da folha, pecíolo e ramo, principalmente no parênquima cortical e medular do pecíolo e da nervura principal, próximo ao cilindro vascular; no parênquima lacunoso da região intercostal e parênquima cortical do ramo. Essa substância que está bastante presente na espécie (ESAU, 1974). Para detecção de celulose foi utilizado o calcoflúor, um fluoróforo que quando irradiado com luz UV o complexo formado fluoresce intensamente de azul (FIGUEIREDO et al., 2007), sua presença foi sugerida apenas na epiderme do mesofilo (FIGURA 12C).

Substâncias lipídicas e seus derivados são corados por um processo puramente físico, isto é, afinidade do reagente pelo metabólito primário (FIGUEIREDO et al., 2007). Para tal detecção foram utilizados sudan III, sudan IV e auramina. Os sudans coraram em alaranjado (Figura 12D e 12E) (FIGUEIREDO et al., 2007) e, em C. gradiflora, foram evidenciados, principalmente, nas cutículas

presente em toda lâmina foliar e ramo e em idioblastos presentes nos parênquimas corticais e medulares da nervura principal, no parênquima cortical do pecíolo, no parênquima fundamental do bordo e no parênquima cortical do ramo. Já o fluoróforo auramina quando irradiado com luz UV o complexo formado fluoresce em esverdeado (Figura 12F) e, em C. gradiflora foi onservado, principalmente, na cutícula presente em toda lâmina foliar.

Substâncias fenólicas foram detectadas pela reação com cloreto férrico que se complexaram formando precipitados cuja coloração puderam variar do verde intenso, púrpura, azul a negro (Figura 12G) (FIGUEIREDO et al., 2007). Este tipo de substância está amplamente distribuído no reino vegetal e compreende cumarinas, xantonas, flavonoides, entre outras (CARVALHO et al., 1999), sendo muitas delas encontradas em Clusiaceae e Clusia. Em C. gradiflora foram encontrados no parênquima paliçádico da região intercostal, no parênquima fundamental do bordo, sistema vascular do pecíolo e a região cortical do ramo.

Uma das classes de subtâncias fenólicas são os taninos. Para detecção dessas substâncias utilizou-se vanilina clorídrica que formam um produto de condensação resultante da reação dos grupos aldeídicos da vanilina com os fenóis, resultando em uma coloração vermelho alaranjado (Figura 12H) (FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. gradiflora foram idenficados em tecidos parenquimáticos da nervura principal e epiderme do ramo. Esta classe de substância tem atuação na defesa contra insetos, fungos e bactérias (SANTOS & MELLO, 1999) e já foram descritos por Fernandes (2007) em Clusia criuva.

Por fim, para detecção de outra classe de substâncias fenólicas, foi utilizado cloreto de alumínio que se complexa com flavonóides (flavonas) com grupos hidroxilo livres em 3' ou 5', corando em amarelo sob luz UV (Figura 12I). (FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora, esta metodologia não foi a mais promissora, sendo detectado com pouca clareza apenas no sistema vascular do pecíolo, porém, já foram identificados flavonoides em espécies de Clusia.

A Tabela 5 evidencia as classes químicas encontradas em diferentes partes da planta.

Figura 12. Testes histoquímicos da lâmina foliar e ramos de C. grandiflora. A) Epiderme e feixe vascular corados com ragente de Wagner no bordo foliar sugerindo presença de alcaloides. B) Parênquima medular da nervura principal, próximo ao cilindro vascular, corado com lugol (seta) indicando a presença de amido. C) Mesofilo envidenciando a presença de celulose na epiderme corado com calcofluor. D) Cutícula do pecíolo corada com Sudam IV indicando a presença de lipídios. E) Idioblastos no parênquima cortical do ramo corado com Sudam III indicando a presença de liídeos F) Bordo foliar evidenciando a presença de lipídeos quando corados com auramina. G) Parênquima paliçádico da região intercostal corado com cloreto férrico, evidencia a presença de substâncias fenólicas, comum ao gênero. H) Idioblasto presentes na nervura corado com vanilina clorídrica evidenciando a presença de taninos, já descrito em outras espécies de Clusia. I) Possível resultado positivo para flavonoides, classe descrita em outras espécies de Clusia, devido a coloração amarelada quando em presença de cloreto de alumínio nas células

presente no pecíolo. ep: epiderme, cu: cutícula, fv: feixe vascular, pf: parênquima fundamental, pp: parênquima paliçádico.

Tabela 5. Localização das classes químicas detectadas na lâmina foliar e no ramo de C. grandiflora utilizando teste histoquímico.

Classe química

Reagente Pecíolo Bordo Mesofilo Nervura Ramo

Substâncias lipofílicas Sudam III + + + + + Sudam IV + + + + + Auramina + + + + n Flavonoides Cloreto de alumínio + - - - - Alcaloides Reagente de Wagner + + + + - Taninos Vanilina Clorídrica - - - + + Substâncias fenólicas Cloreto férrico + + + - + Carboidratos: Amido Calulose Lugol + + + + + Calcofluor - - + - n

Legenda: + presença, - ausência, n: não realizado teste para parte vegetatitva