DROSÓFILA COMO MODELO EXPERIMENTAL

Para a realização do presente trabalho foi utilizado o organismo modelo D.

melanogaster. As razões da utilização da sua utilização já foram referenciadas na primeira parte

do trabalho.

Através do trabalho desenvolvido por Vogel et al, (1991), foram desenvolvidas seis linhagens de D. melanogaster, designadamente Hikone-R, Berlin-K, Oregon-k-y (OK-y), 91- C, 91-R e Haag-79. Estas linhagens variam tanto no conteúdo como na inducibilidade de enzimas oxidativas microssomias (possuem atividades metabólicas diferentes) (Vogel et al, 1991). De acordo com as características das seis linhagens de D. melanogaster, a linhagem que mais se adequa ao trabalho realizado é a linha OK-y, na medida em que apresenta uma frequência de olhos com mosaico relativamente baixo (baixa taxa de mutações espontâneas nos omatídeos) (Gaivão et al, 1999).

Esta linhagem apresenta também ao nível bioquímico e genético uma grande sensibilidade, a valores baixos da atividade da catalase e superóxido dismutase e uma elevada capacidade de sintetizar o anião superóxido. Assim sendo, a linhagem OK-y é útil na avaliação genotóxica de agentes indutores de espécies reativas de oxigénio (ROS), estas induzem danos no DNA que condicionam nos resultados do ensaio do cometa e teste SMART (Gaivão et al, 1996).

Esta interferência deve-se ao facto do antibiótico antitumoral, SN, utilizado promover a um aumento de produção de ROS. Esta linhagem tem como marcadores os genes white (w) e yellow (y), os quais foram introduzidos através da N-etil-N-nitrosureia, deixando a maior parte do genoma intacto. A N-etil-N-nitrosureia é um potente mutagénico o qual pode induzir ganho ou perda de função de um determinado gene, daí a sua utilização nesta linhagem (Vogel et al, 1991).

3.1.1 Técnicas gerais de manuseamento da Drosófila

3.1.1.1 Meio de cultura

Para a criação de D. melanogaster, existem numerosos meios de cultura. Na realização da presente tese de mestrado foram utilizados dois meios de cultura, o meio de cultura instantâneo com a fórmula 4-24 da Carolina Biological Supply Co., Burlington, N.C., EUA e o meio de cultura convencional.

O meio de cultura instantâneo com a fórmula 4-24 da Carolina Biological Supply Co.,

Burlington, N.C., EUA, é desidratado o qual se hidrata adicionando a mesma quantidade de

água destilada (dH2O) e meio de cultura instantâneo. Após a reconstituição em dH2O, o meio

presenta uma cor azul o que facilita a visualização das larvas.

O meio de cultura convencional possui a seguinte composição: fermento de padeiro; sacarose; ágar-ágar; ácido propiónico e cloreto de sódio.

As quantidades dos constituintes do meio de cultura estão descritos na Tabela 1.

Procedimento:

 Proceder à dissolução da sacarose e, em separado, dissolver a levedura e o ágar-ágar;  Após a dissolução total da sacarose, colocar o preparado sobre a placa de aquecimento e juntar a levedura e o ágar-ágar, mexer sempre o meio para facilitar a homogeneização;

 Decorridos aproximadamente 30 minutos, retirar o meio da placa de aquecimento e deixar arrefecer até atingir uma temperatura de mais ou menos 50 ºC;

 Posteriormente, adicionar o ácido propiónico, que vai atuar como um antifúngico, para uma melhor conservação do meio;

 Colocar aproximadamente 50 mL de meio em frascos de vidro com a capacidade de 250 mL.

Nos ensaios de longevidade e genotoxicidade, até ao nascimento dos descendentes, utilizou-se o meio instantâneo, sendo a manutenção dos descendentes feita posteriormente com o meio de cultura convencional.

Tabela 1: Quantidades dos produtos utilizados para a elaboração do meio de cultura de D. melanogaster

½ Dose 1 Dose 1,5 Doses 2 Doses

Água 500 mL 1000 mL 1500 mL 2000 mL

Sacarose 50 g 100 g 150 g 200 g

Ágar-ágar 6 g 12 g 18 g 24 g

Levedura 50 g 100 g 150 g 200 g

Ácido propiónico 2,5 mL 5 mL 7,5 mL 10 mL

3.1.1.2 Isolamento de fêmeas virgens

As fêmeas possuem a capacidade de armazenar e usar o esperma de uma única inseminação durante grande parte da sua vida. Deste modo, é necessário selecionar as fêmeas virgens para cruzamentos genéticos controlados. Este passo torna-se essencial para o desenvolvimento do trabalho pois as fêmeas vão ser colocadas no frasco de vidro em contacto com o meio de cultura e a substância a testar, permitindo que a fecundação e postura dos ovos e posterior desenvolvimento larvar ocorra (Raymond, 1988).

Existem essencialmente duas formas de isolamento de fêmeas virgens. A primeira consiste na identificação do sexo e isolamento das fêmeas adultas com seis horas de idade, no máximo. Seis horas é o tempo que as fêmeas necessitam para atingir a maturação sexual. O segundo método consiste na seleção de drosófilas recém-emergidas que se apresentam com uma cor branca e pálida, corpo alongado e como as asas por sobressair. Neste tipo de método é necessário um cuidado acrescido no manuseamento das drosófilas de forma a não danificar as asas, sendo um método que necessita de uma maior experiência pois existe uma maior dificuldade na identificação sexual (Raymond, 1988; Sanches, 1990).

3.1.1.3 Distinção sexual

Nas drosófilas adultas a distinção entre sexos é simples podendo ser feita a olho nu e mais pormenorizada com o auxílio de uma lupa (Figura 9).

As fêmeas apresentam um abdómen maior e mais pontiagudo do que o macho, especialmente quando esta está mais distendida com os ovos. Possuem também várias listas escuras no seu abdómen, enquanto o macho possui menos listas e apresenta uma zona terminal mais arredondada e escura. O macho é ainda caraterizado pela presença de um pente sexual que consiste em cerca de 10 cerdas escuras na articulação do tarso superior da perna anterior, esta característica é fulcral na distinção dos sexos nas 2 primeiras horas após a eclosão, quando a forma e a pigmentação do corpo ainda não estão completamente desenvolvidas (Griffiths et al, 2006; Pierce, 2005).

Figura 9: Representação da Drosophila melanogaster macho e fémea.(Adapatado de Drosophila melanogaster adultes, acedido em 20 de junho de 2014 em:

http://www.savoirs.essonne.fr/sections/ressources/photos/photo/drosophila-melanogaster-adultes).

3.1.1.4 Método Anestésico

Quando se pretende trabalhar com drosófilas de modo seguro e eficaz, é necessário proceder à sua anestesia. Existem diversos métodos para o poder fazer, sendo o mais utilizado o recurso ao éter. Apesar de ser um método simples, este requer alguns cuidados no seu manuseamento. Deve-se ter em conta o tempo de exposição em que as drosófilas estão em contacto com o mesmo, pois períodos de tempo prolongados podem conduzir a esterilidade e até mesmo levá-las à morte. Geralmente uma drosófila anestesiada permanece imóvel por um período compreendido entre os 5 e os 10 minutos

Fêmea

O objetivo principal da anestesia nas drosófilas é permitir um melhor manuseamento e contagem das mesmas sem causar qualquer dano a nível morfológico e bioquímico.

3.1.1.5 Pré-Cruzamento

Com o intuito de obter o número necessário de drosófilas e de genótipo adequado para a realização do ensaio foi necessário efetuar um pré-cruzamento. O pré-cruzamento consistiu em colocar nos frascos de cultura 30 casais, das quais as drosófilas fêmeas têm que ser

obrigatoriamente virgens e possuírem o genótipo w+, com o corpo amarelo (y)( w+/ w+), e os

machos têm de possuir a cor dos olhos branca, ou seja detentores do genótipo (w) (w/y). O recurso ao marcador genético y é uma garantia de que as fêmeas usadas nos ensaios experimentais foram apanhadas virgens, pois caso contrário, a descendência gerada seria

yellow.

O pré-cruzamento foi efetuado em frascos de cultura durante um período de 72 horas. Ao fim deste tempo, todos os indivíduos foram retirados dos frascos de cultura e postos em novos frascos de cultura para o aumento da população necessária para a realização de todos os ensaios do presente trabalho.

O crescimento e a manutenção das drosófilas efetuou-se a uma temperatura média de 25 ˚C, com ciclos circadianos de acordo com a estação do ano em que foram efetuados os procedimentos.