E SFREGAÇOS DE S ANGUE P ERIFÉRICO

Sempre que necessário, quer seja a pedido do clinico devido a alarmes dado pelo equipamento ou outras suspeitas, é efetuado o esfregaço de sangue periférico e a observação ao microscópio ótico com contagem manual do diferencial leucocitário e observação da morfologia celular. A observação microscópica do esfregaço de sangue fornece informação relevante sobre todos os elementos figurados no sangue.

É importante ter em atenção alterações nas três linhagens. Na linhagem eritrocitária podem observar-se alterações morfológicas, nomeadamente no tamanho, cor e presença de inclusões e alterações no estado de maturação. Na linhagem leucocitária faz-se a contagem leucocitária e observam-se alterações morfológicas, como tamanho, aspeto da cromatina, forma do núcleo, presença de nucléolos, razão núcleo/citoplasma, presença ou ausência de grânulos, basofilia do citoplasma e o estado de maturação dos leucócitos. Na linhagem plaquetária, observam-se alterações

18 morfológicas, como o tamanho, a presença de agregados plaquetários e alterações relativamente ao número de plaquetas.

2.2.1. Preparação de Esfregaço de Sangue

Podem ser usadas amostras de sangue fresco ou então com anticoagulante EDTA K3. No caso deste último, idealmente, o esfregaço deve ser feito até 1 – 2h após colheita, caso contrário, os elementos figurados do sangue total começam a ficar distorcidos quando expostos ao anticoagulante durante muito tempo. Antes de preparar o esfregaço de sangue a amostra deve estar entre 18ºC a 25ºC e devidamente homogeneizada.

Numa lâmina devidamente identificada coloca-se na margem uma gota de sangue, usando um aplicador de gota (Figura 8).

Figura 8 - Esfregaço de sangue periférico com o auxílio de um aplicador de gota de sangue com

espalhador, Haemo-Diff da SARSTEDT. 1. Colocar aplicador no tubo; 2. Tudo é invertido para dispensar uma gota de sangue na lâmina; 3. Usar o espalhador para fazer o esfregaço.(2)

Os aplicadores Haemo-Diff da SARSTEDT têm uma cânula que penetra a membrana na tampa do tubo de colheita onde dispensa uma gota de sangue na lâmina. A utilização destes aplicadores eliminam a necessidade de abrir os tubos de colheita e contaminar a amostra e o desperdiço de mais material para transferir a gota.(2)

Um esfregaço bem preparado deve apresentar as margens da lâmina livres, deve ficar mais fino desde o ponto de origem até a extremidade e terminar em franja (Figura 9).(3)

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Figura 9 - (A) Esfregaço bem preparado; (B) e (C) Esfregaços mal preparados.(2)

Ao exercer muita pressão sobre o espalhador a maioria dos leucócitos podem ser arrastados para a extremidade da lâmina, afetando deste modo a distribuição dos diferentes tipos de leucócitos e diminuindo a contagem de leucócitos no resto do esfregaço.(2)

2.2.2. Princípio da Coloração de Lâminas

A coloração usada para a observação microscópica dos elementos figurados do sangue é do tipo Romanowsky, baseado em soluções alcoólicas com componentes básicos e acídicos. Este, consiste num método de coloração policromático contendo azul-de-metileno e/ou os seus produtos de oxidação, como o Azur B (Trimetiltionina) e,

um corante de halogenado de fluoresceína, normalmente eosina Y

(Tetrabromofluoresceína). O efeito de Romanowsky concede uma cor típica a determinados componentes celulares e reflete a ação combinada da coloração contida no corante a pH compreendido entre 6,7 e 7,0. O núcleo celular cora de roxo, o citoplasma de azul e rosa, e os diferentes grânulos de outras cores específicas.(3)

O azul-de-metileno é um corante básico que cora o núcleo e algumas estruturas citoplasmáticas de azul ou roxo. Estas estruturas coradas são estruturas basófilas, como é o caso de DNA e RNA. Por sua vez, a eosina é um corante acídico que cora algumas estruturas citoplasmáticas de vermelho alaranjado. Estas estruturas coradas são acidófilas, como é o caso de algumas proteínas. Quando ambos os componentes, básico e acídico, coram uma estrutura citoplasmática este adquire a cor rosa ou lilás.(3)

Atendendo ao fluxo diário de amostras recebidas no laboratório a secção de Hematologia tem à sua disposição um corador de lâminas automático Hematek. Trata-se de um aparelho de bancada totalmente automatizado que transporta, fixa e cora lâminas de esfregaços. A coloração utilizada com o aparelho automático é o método de Wright modificado que contem uma combinação de azul-de-metileno e eosina, e metanol como fixador.

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2.2.3. Situações que Requerem Confirmação

Um resultado fora dos intervalos de referência definidos para os diferentes elementos sanguíneos ativam flags no aparelho e/ou alarmes no programa de validação automática de resultados (SIS) (Tabela 6).

Tabela 6 - Alguns cenários que exigem confirmação por esfregaço de sangue.

Flags/Alarmes Valores Observações

Trombocitopenia PLT ˂ 150 109/L

Possíveis agregados plaquetários ou diminuição no número de plaquetas em circulação.

Scattergram

anormal de NRBC NRBC ≥ 1%.

Possível presença de eritroblastos. Confirma- se a presença de eritroblasto e corrige-se a contagem de WBC. Pode haver interferência de linfócitos frágeis ou partículas de lípidos que podem impedir uma clara separação entre os WBC e NRBC.

Desvio à esquerda - Possível presença de neutrófilos em banda ou neutrofilia.

Granulócitos

imaturos ≥ 3% Confirmar presença de granulócitos imaturos. Linfocitose > 3,5 109

/L Para despiste de leucemia linfoide crónica e linfomas.

Fórmula invertida - Para indivíduos com idades superiores a 18 anos

Linfoblastos HGB ≤ 11,5 g/dL

Os linfoblastos têm um comportamento perante o reagente do canal IMI idêntico ao dos leucócitos maduros. Assim sendo, o canal IMI apresentará um diagrama normal e o canal 5Diff apresentará anormalidade na zona de separação entre linfócitos e monócitos.

Linfócitos atípicos ≥ 1,5%

São células mononucleares com uma

atividade aumentada em RNA. No

scattergram encontram-se na zona dos

linfócitos com elevada fluorescência. Pode haver interferência de plasmócitos e imunócitos com elevada produção de imunoglobulinas e elevada quantidade de retículo endoplasmático.

Eosinofilia >20% ou >1,5 103/µL Devido a alergias ou parasitas, ou síndrome hipereosinofílica.

Basofilia ≥ 2% Para despiste de leucemia mieloide crónica e

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